Các dụng cụ cần thiết đều được rửa sạch, sấy khô, hấp khử trùng và bảo quản đúng cách. Sau đó thực hiện theo các bước sau:
• Bước 1: Tạo vật liệu khởi đầu cho việc nuôi cấy
Hạt lúa lai F1 đã bóc sạch vỏ trấu và chú ý không làm tổn thương phôi.
• Bước 2: Khử trùng mẫu
Khảo sát hiệu quả khử trùng mẫu trong 2 nghiệm thức với thời gian khử trùng khác nhau là KT1 và KT2:
KT1
- Lắc 1 phút trong cồn 960
. - Rửa lại bằng nước cất 1 lần. - Lắc 3 phút trong HgCl2 0,06%.
KT2
- Lắc 1 phút trong cồn 960. - Rửa lại bằng nước cất 1 lần. - Lắc 5 phút trong HgCl2 0,06%.
Sau khi khử trùng xong hạt được rửa lại bằng nước cất vô trùng 3- 4 lần. Mỗi tổ hợp lai được khử trùng trong 2 nghiệm thức, mỗi lần khử trùng 10 hạt, lặp lại mỗi nghiệm thức 3 lần.
• Bước 3: Cấy hạt đã khử trùng lên môi trường nảy mầm
Các hạt sau khi được khử trùng đem cấy trên môi trường nảy mầm. Môi trường nảy mầm: khảo sát 2 nghiệm thức [17]
NC1: MS + 4,5 mg/l BA + 0,5mg/l AIA NC2: MS + 3,5 mg/l BA + 0,5mg/l AIA
Môi trường nuôi cấy được chứa trong bình tam giác 250ml, mỗi nghiệm thức cấy 2 bình, mỗi bình cấy 5 hạt, lặp lại 3 lần.
Nuôi mẫu cấy 1- 2 tuần trong điều kiện: ánh sáng 3000 ± 500 lux; nhiệt độ 25 ± 20C. Quan sát khả năng nảy mầm của hạt và mức độ nhiễm của mẫu nuôi cấy trong vòng 1– 2 tuần.
Chỉ tiêu theo dõi:
Tỉ lệ mẫu nhiễm (%) = tổngsốmẫunhiễm
tổngsốmẫucấy x100%
• Bước 4: Cấy chồi vào môi trường tạo cụm chồi
Hạt nảy mầm sau 7- 10 ngày, cắt bỏ rễ mầm, lá, chỉ chừa lại đoạn chồi cách gốc khoảng 1cm, đem cấy vào môi trường tạo cụm chồi. Sau đó quan sát sự tạo chồi và sự tăng trưởng cụm chồi, cấy chuyền nhân nhanh số lượng cụm chồi sau 3 tuần. Quan sát sự tạo chồi sau 3 tuần, 5 tuần.
Môi trường tạo cụm chồi: khảo sát 2 nghiệm thức [17]
NC1: MS + 4,5mg/l BA + 0,5 mg/l AIA NC2: MS + 3,5mg/l BA + 0,5 mg/l AIA
Môi trường tạo cụm chồi và môi trường nảy mầm giống nhau nhằm tạo sự thích ứng nhanh chóng cho các chồi.
Chỉ tiêu theo dõi: so sánh khả năng tạo cụm chồi ở các hạt lai F1 bằng hệ số nhân chồi.
𝐡ệ𝐬ố𝐧𝐡â𝐧𝐜𝐡ồ𝒊= tổng số chồi thu được tổng số chồi cấy ban đầu • Bước 5: Tạo cây hoàn chỉnh
Sau khi cấy chuyền nhân nhanh số lượng cụm chồi, tách riêng các chồi và cấy vào môi trường tạo rễ. Mỗi chồi khi ra rễ là thành một cây hoàn chỉnh.
Môi trường tạo rễ: môi trường MS [17]
• Bước 6: Huấn luyện cây con
Khi cây trong bình nuôi đủ tiêu chuẩn, chuyển ra chậu đất đặt nơi có ánh sáng, độ ẩm thích hợp để cây thích nghi dần với môi trường tự nhiên thì tỉ lệ sống cao hơn.
Tỉ lệ sống sót giai đoạn chuyển từ môi trường in-vitro ra chậu đất (sau 2 tuần chuyển):