Nuôi cấy mô tế bào thực vật ngày nay có ý nghĩa quan trọng trong công nghệ sinh học, đặc biệt trong kĩ thuật chuyển gen tạo ra những giống cây trồng mới đều cần đến kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật. Nuôi cấy mô được ứng dụng để:
• Nhân giống với hệ số nhân cao trong thời gian ngắn.
• Tạo ra dòng cây con hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền.
• Tạo ra các dòng cây sạch bệnh (loại bỏ virus, vi khuẩn) từ cây mẹ nhiễm bệnh.
Ở nước ta, việc nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào thực vật mới chỉ bắt đầu từ những năm 1975 nhưng đã gặt hái những thành tựu không nhỏ trong chọn giống và nhân giống cây trồng trong nông nghiệp với những cây quan trọng như mía, lúa, cà phê, khoai tây, chuối, dứa Cayenne...
Trường Đại học Đà Lạt đã nhân được gần 30 loài lan đặc hữu của Vườn Quốc gia Cát Tiên bằng biện pháp nuôi cấy mô sau hơn 1 năm tiến hành nghiên cứu. Trong số đó, có nhiều loài rất quý được nước ngoài đặt mua với số lượng lớn như lan hài Hồng, kim hài, vân hài, lan gấm, A. Rích... Một số loài như Ludisia discolor, Kim tuyến còn có tác dụng làm thuốc chữa bệnh. Việc nhân nhanh các loài lan quý này không chỉ phục vụ cho mục đích kinh tế, phục vụ khách du lịch, mà còn góp phần bảo vệ sự đa dạng sinh học của nước ta.
Kĩ thuật nuôi cấy bao phấn đơn bội cây lúa, ngô đã được hoàn chỉnh về quy trình, kết hợp với các kĩ thuật chuyển gen, lai xa... đã và đang hứa hẹn tạo ra những giống mới mang nhiều đặc điểm ưu thế: sinh trưởng mạnh, chống chịu tốt, kháng đạo ôn, sâu bệnh, năng suất cao ... Các dòng, giống lúa có triển vọng gồm: DT26, DT29, DT32, J1, AC22, AC23, AC24, AC25... đang được khảo nghiệm. Nhờ nuôi cấy bao phấn lúa có thể rút ngắn thời gian chọn giống mới xuống từ 4 - 6 thế hệ. Kỹ thuật đơn bội in- vitrocũng đang được triển khai mạnh trong chọn giống ở Viện lúa Đồng bằng Sông Cửu Long, Viện Công nghệ sinh học,...
Giống AC5 là giống lúa quốc gia đầu tiên được tạo ra bằng kết hợp lai hữu tính với kỹ thuật nuôi cấy bao phấn ở Việt Nam và đã sử dụng để sản xuất lúa hàng hóa, chất lượng cao tại các vùng đồng bằng sông Hồng và Bắc Trung Bộ.
Một số công trình nuôi cấy nhiều giống cây dược liệu quý như Sâm Ngọc Linh, các loại nấm dược liệu quý hiếm, cây lô hội, vù hương ...cũng đã hoàn chỉnh, đáp ứng nhu cầu khai thác nguồn dược liệu cũng như lưu giữ và nhân nhanh các nguồn gen quý.
Nuôi cấy mô còn đem lại nhiều lợi ích trong việc nhân nhanh các giống cây công nghiệp có giá trị kinh tế cao như dó trầm, cây Đăng, bạch đàn, keo, lát hoa, neem, bông...
Viện công nghệ sinh học và viện nghiên cứu cây bông và cây có sợi cũng đã xây dựng thành công quy trình tái sinh cây bông phù hợp với điều kiện Việt Nam, giúp nhân nhanh các giống cây bông có năng suất cao, cung cấp nguyên liệu cho ngành dệt may hiện nay, và hạn chế việc nhập khẩu bông [5], [7], [33], [41], [45].
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu
1. Giống lúa Bắc Thơm số 7
- Nguồn gốc: là giống lúa thuần nhập nội từ Trung Quốc, được công nhận giống theo quyết định số 1224 QĐ/BNN-KHCN (Bộ nông nghiệp- khoa học công nghệ), ngày 21 tháng 4 năm 1998.
- Đặc điểm: Bắc Thơm 7 là giống lúa có thể gieo cấy được trong cả 2 vụ, thời gian sinh trưởng ở vụ Xuân muộn là 135- 140 ngày, ở vụ Mùa sớm là 115- 120 ngày. Chiều cao cây: 90- 95 cm. Đẻ nhánh khá, trỗ kéo dài. Hạt thon nhỏ, màu vàng sẫm. Chiều dài hạt trung bình: 5,86 mm. Tỷ lệ chiều dài/ chiều rộng hạt là 2,95. Trọng lượng 1000 hạt: 19– 20g. Gạo có hương thơm. Cơm thơm, mềm [47].
2. Giống lúa Hương Thơm số 1
- Nguồn gốc: là giống lúa thuần nhập nội từ Trung Quốc, được công nhận giống theo Quyết định số 123 QĐ/BNN-KHCN, ngày 16 tháng 1 năm 2004.
- Đặc điểm: Hương Thơm số 1 là giống lúa thơm ngắn ngày, gieo cấy được ở cả 2 vụ. Thời gian sinh trưởng ở vụ Xuân muộn là 130– 132 ngày, ở vụ Mùa là 105– 110 ngày. Chiều cao cây: 95- 105 cm. Dạng cây gọn, có mùi thơm, đẻ nhánh khá, trỗ tập trung. Bông dài 22– 25 cm, 110– 120 hạt chắc/bông. Hạt nhỏ, màu vàng sẫm. Chiều dài hạt trung bình: 5,32 mm. Tỷ lệ chiều dài/ chiều rộng hạt là: 2,75 [47].
3. Dòng lúa lai Tám Xoan 1-2
- Nguồn gốc: dòng lúa này là kết quả lai giữa 2 giống Tám Xoan đột biến 1 và Tám Xoan đột biến 2, được Tiến sĩ Nguyễn Thị Mong lai tạo, chọn lọc và cung cấp hạt giống.
Giống lúa Tám Xoan đột biến 1 (đột biến từ Tám Xoan Hải Hậu)
- Nguồn gốc: do bộ môn lúa, Viện Khoa học nông nghiệp miền Nam xử lý bằng tia phóng xạ và chọn đến M6.
- Đặc điểm: thời gian sinh trưởng 95-100 ngày, chiều cao cây 93-95 cm, dạng cây gọn, bẹ tím, lá xanh đậm, dày, đứng, bông dài 22-24 cm, hạt bầu, màu vàng sáng, có chấm đen ở đầu hạt, mất tính cảm quang chu kỳ.
Giống lúa Tám Xoan đột biến 2 (đột biến từ Tám Xoan Hải Hậu)
- Nguồn gốc: do bộ môn lúa, viện khoa học nông nghiệp miền Nam xử lý bằng tia phóng xạ và chọn đến M6, đã thuần.
- Đặc điểm: thời gian sinh trưởng 90-100 ngày, cao cây 90-93 cm, dạng cây trung gian, đẻ nhánh trung bình, lá hơi cong, màu xanh đậm, bông dài 23-24 cm, hạt khá dài, màu vàng sáng, mất tính cảm quang chu kỳ.
4. Dòng lúa lai Nàng Hương đột biến x Tám Xoan 93 (NHĐB x TX93)
- Nguồn gốc: dòng lúa này là kết quả lai giữa 2 dòng Nàng Hương đột biến và Tám Xoan 93, được Tiến sĩ Nguyễn Thị Mong lai tạo, chọn lọc và cung cấp hạt giống.
Giống lúa Nàng Hương
- Nguồn gốc: là giống lúa đặc sản địa phương lâu đời, trồng nhiều ở Long An, An Giang, thành phố Hồ Chí Minh.
- Đặc điểm: thời gian sinh trưởng 155-165 ngày, cảm ứng chặt với quang chu kỳ, trổ bông tháng 11-12, cây cao 130-180 cm, dài bông 23,5 cm, hạt thóc nhỏ và thon, có mỏ, hạt gạo dài 6,21 mm, gạo đục, lá dài, rủ. Cây hơi xòe, đẻ nhánh trung bình. Năng suất 3-3,2 tấn/ha. Có mùi thơm nhẹ, khối lượng 1000 hạt là 22g. Cơm dẻo, mềm [35].
Giống lúa Tám Xoan 93
- Nguồn gốc: do viện lúa đồng bằng sông Cửu Long chiếu xạ bằng tia Gamma Co60
vào hạt khô của giống lúa Tám Xoan Hải Hậu- Nam Định, được chọn ở thế hệ M3
và nhân thành dòng ở thế hệ M6.
- Đặc điểm: thời gian sinh trưởng 95-100 ngày, cao cây 95-100 cm, khả năng đẻ nhánh khỏe. Dạng cây đứng, chụm, lá đứng, bản lá tương đối rộng. Hạt thóc dài, màu vàng sáng, hạt gạo ít bạc bụng, thơm nhẹ, đạt tiêu chuẩn xuất khẩu. Không còn cảm ứng quang chu kỳ, cấy được các vụ trong năm, kháng được rầy nâu và đạo ôn.
5. Dòng lúa lai Nàng Thơm đột biến x Nàng Thơm chợ Đào (NTD2)
- Nguồn gốc: dòng lúa này là kết quả lai giữa 2 dòng Nàng Thơm đột biến và Nàng Thơm chợ Đào, do Tiến sĩ Nguyễn Thị Mong lai tạo, chọn lọc và cung cấp hạt giống.
Giống Nàng Thơm chợ Đào
- Nguồn gốc: là giống lúa đặc sản địa phương được trồng tại xã Mỹ Lệ nên còn gọi là Nàng Thơm Mỹ Lệ, thuộc tỉnh Long An, do nông dân ở Long An chọn lọc và giữ giống.
- Đặc điểm: thời gian sinh trưởng 155-165 ngày, cảm ứng quang chu kỳ, cây cao 145 cm, bông dài 24-24,6 cm, lá dài thon, hạt thóc nhỏ thon, có mỏ, hạt gạo dài 6,3 mm, gạo đục, mùi thơm nhẹ [35].
6. Dòng lúa lai Nàng Thơm chợ Đào x Nàng Thơm đột biến (NT1)
- Nguồn gốc: dòng lúa này là kết quả lai giữa 2 dòng Nàng Thơm chợ Đào và Nàng Thơm đột biến, là kết quả phép lai nghịch của tổ hợp NTD2 nêu trên, được Tiến sĩ Nguyễn Thị Mong lai tạo, chọn lọc và cung cấp hạt giống.
7. Giống lúa Jasmine 85 (JAS)
- Nguồn gốc: giống lúa Jasmine 85 là giống lúa thơm có nguồn gốc từ giống IR841 của Viện Lúa Quốc tế do Bộ Nông Nghiệp Mỹ chọn lọc lại với dòng Jasmine 85. Giống này được du nhập vào Việt Nam trong những năm đầu của thập niên 1990, trồng nhiều các tỉnh Đồng Tháp, An Giang, Long An và một số vùng khác.
- Đặc diểm: thời gian sinh trưởng 105-110 ngày. Chiều cao cây 110-115 cm và độ dài bông 26,2 cm. Trọng lượng 1000 hạt 26g, thuộc nhóm hạt to, chiều dài hạt 6,9 cm, tỉ lệ dài/ rộng là 3,05. Tán lá đứng, đẻ nhánh trung bình, mùi thơm nhẹ, mềm cơm, ngon ngọt cơm, không bạc bụng. Đây là thành tựu khá nổi bật của các nhà chọn giống, bởi vì trên 20 năm lai tạo và chọn lọc, người ta đã thất bại trong phát triển giống lúa thơm có dạng hình cải tiến, ngắn ngày, năng suất cao [35].
8. Dòng lúa lai Tám- Dự 1 (TD)
- Nguồn gốc: Tám- Dự 1 được tạo ra từ tổ hợp lai giữa Dự đột biến số 2 và Tám Xuân Đài đột biến số 3, chọn lọc theo phương pháp phả hệ, có những đặc điểm ưu việt hơn so với 2 dạng bố mẹ, được đưa vào khảo nghiệm cơ bản trong mạng lưới khảo nghiệm quốc gia ở vụ Xuân năm 2005. Dự đột biến số 2 và Tám Xuân Đài đột biến số 3 là các dòng đột biến của 2 giống lúa tẻ thuần chủng là Dự Hải Hậu và
Tám Xuân Đài. Hạt giống do Tiến sĩ Nguyễn Minh Công- Bộ môn Di truyền học, Đại học Sư phạm Hà Nội cung cấp.
Giống lúa Dự Hải Hậu
- Nguồn gốc:là giống đặc sản do Sở nông nghiệp Nam Định tuyển chọn, được công nhận năm 1995.
- Đặc điểm:đây là giống lúa mùa phản ứng chặt với quang chu kì, có thời gian sinh trưởng 160-165 ngày, cây cao 145-150 cm, thường trổ bông vào tháng 10, chín vào tháng 11. Chiều dài bông 24-25 cm, năng suất 30-40 tạ/ha, tỉ lệ hạt lép 11-15%, khối lượng 100 hạt 19-20g. Phẩm chất hạt gạo: trắng, bạc bụng ít, cơm dẻo, hơi thơm.
Giống lúa Tám Xuân Đài
- Nguồn gốc: là giống lúa đặc sản cổ truyền được tạo ra từ xã Xuân Đài, huyện Xuân Trường, tỉnh Nam Định, được bộ công nghiệp và thực phẩm cho phép đưa vào sản xuất năm 1995.
- Đặc điểm:đây là giống lúa mùa phản ứng chặt với quang chu kỳ, có thời gian sinh trưởng dài hơn các giống lúa Tám khác, thường là 170-180 ngày, thường trổ bông vào tháng 10, chín vào tháng 11. Cây cao 155-165 cm, bông dài, tỉ lệ hạt lép tương đối cao 17-20%. Phẩm chất hạt gạo: trắng, bạc bụng ít, cơm dẻo, ngon, rất thơm.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Bố trí thí nghiệm lai tạo hạt F1
Chuẩn bị chậu trồng lúa: 50 chậu đất, đường kính 40cm, chiều cao 35 cm.
Chuẩn bị đất: đất được lấy từ ruộng về, phơi 1 tuần, sau cho cho vào chậu ngâm nước 1 tuần, trộn đều với phân bò khô. Tháo nước sấp, trộn đều và gieo hạt.
Chuẩn bị giống: các giống, dòng lúa vật liệu được phơi nhẹ, ngâm 24 giờ trong nước 3 sôi 2 lạnh, ủ 2 ngày 2 đêm. Hạt giống cho vào các túi nilon có đục lỗ riêng biệt, trên túi có ghi nhãn nhận diện.
Gieo mạ: sau khi hạt giống nảy mầm, gieo dày trong các chậu riêng biệt có đánh dấu tên từng giống, dòng. Khi mạ được 25 ngày, chọn các cây mạ khỏe,
cứng cáp, rễ trắng, dài, nhiều, mang cấy vào các chậu đã chuẩn bị sẵn. Mỗi giống, dòng được trồng trong 5 chậu, mỗi chậu 4 cây.
Chăm sóc: chăm sóc mạ theo quy trình trồng lúa thông thường.
Chế độ nước: mực nước trong chậu phải đảm bảo từ 5-7 cm.
Chế độ bón phân: bón phân 3 lần
Lần I: (bón lót) trước khi cấy 1 ngày, theo công thức 400kg supper lân/ha + 66kg ure/ha.
Lần II: (bón thúc) khoảng 15 ngày sau cấy, theo công thức 66kg ure/ha +60kg K2O/ha.
Lần III: (bón đón đòng) khoảng 35 ngày sau khi cấy, theo công thức 66kg ure/ha + 60kg K2O/ha.
Lai tạo hạt giống F1
Khảo sát sự chênh lệch về thời gian sinh trưởng của các giống và dòng đột biến ban đầu để chuẩn bị cho lai.
Thực hiện các phép lai gồm các cặp cha mẹ từ các giống và dòng ban đầu bằng phương pháp cắt vỏ trấu để khử nhị vào lúc 15-17 giờ ngày hôm trước và tiến hành lai vào 9-11 giờ ngày hôm sau.
Sau khi khử nhị xong, bông lúa được bao lại bằng túi giấy can (6 x15 cm) để tránh sự giao phấn tự do.
Cắt bông lúa đang nở của cây chọn làm bố, rũ mạnh để rắc hạt phấn lên trên bông lúa đã khử nhị của cây chọn làm mẹ. Sau đó, bông lúa được bao lại.
Hình 2.1. Các bông lúa được khử nhị và lai
2.2.2. Phương pháp nuôi cấy cụm chồi in-vitro
Các dụng cụ cần thiết đều được rửa sạch, sấy khô, hấp khử trùng và bảo quản đúng cách. Sau đó thực hiện theo các bước sau:
• Bước 1: Tạo vật liệu khởi đầu cho việc nuôi cấy
Hạt lúa lai F1 đã bóc sạch vỏ trấu và chú ý không làm tổn thương phôi.
• Bước 2: Khử trùng mẫu
Khảo sát hiệu quả khử trùng mẫu trong 2 nghiệm thức với thời gian khử trùng khác nhau là KT1 và KT2:
KT1
- Lắc 1 phút trong cồn 960
. - Rửa lại bằng nước cất 1 lần. - Lắc 3 phút trong HgCl2 0,06%.
KT2
- Lắc 1 phút trong cồn 960. - Rửa lại bằng nước cất 1 lần. - Lắc 5 phút trong HgCl2 0,06%.
Sau khi khử trùng xong hạt được rửa lại bằng nước cất vô trùng 3- 4 lần. Mỗi tổ hợp lai được khử trùng trong 2 nghiệm thức, mỗi lần khử trùng 10 hạt, lặp lại mỗi nghiệm thức 3 lần.
• Bước 3: Cấy hạt đã khử trùng lên môi trường nảy mầm
Các hạt sau khi được khử trùng đem cấy trên môi trường nảy mầm. Môi trường nảy mầm: khảo sát 2 nghiệm thức [17]
NC1: MS + 4,5 mg/l BA + 0,5mg/l AIA NC2: MS + 3,5 mg/l BA + 0,5mg/l AIA
Môi trường nuôi cấy được chứa trong bình tam giác 250ml, mỗi nghiệm thức cấy 2 bình, mỗi bình cấy 5 hạt, lặp lại 3 lần.
Nuôi mẫu cấy 1- 2 tuần trong điều kiện: ánh sáng 3000 ± 500 lux; nhiệt độ 25 ± 20C. Quan sát khả năng nảy mầm của hạt và mức độ nhiễm của mẫu nuôi cấy trong vòng 1– 2 tuần.
Chỉ tiêu theo dõi:
Tỉ lệ mẫu nhiễm (%) = tổngsốmẫunhiễm
tổngsốmẫucấy x100%
• Bước 4: Cấy chồi vào môi trường tạo cụm chồi
Hạt nảy mầm sau 7- 10 ngày, cắt bỏ rễ mầm, lá, chỉ chừa lại đoạn chồi cách gốc khoảng 1cm, đem cấy vào môi trường tạo cụm chồi. Sau đó quan sát sự tạo chồi và sự tăng trưởng cụm chồi, cấy chuyền nhân nhanh số lượng cụm chồi sau 3 tuần. Quan sát sự tạo chồi sau 3 tuần, 5 tuần.
Môi trường tạo cụm chồi: khảo sát 2 nghiệm thức [17]
NC1: MS + 4,5mg/l BA + 0,5 mg/l AIA NC2: MS + 3,5mg/l BA + 0,5 mg/l AIA
Môi trường tạo cụm chồi và môi trường nảy mầm giống nhau nhằm tạo sự thích ứng nhanh chóng cho các chồi.
Chỉ tiêu theo dõi: so sánh khả năng tạo cụm chồi ở các hạt lai F1 bằng hệ số nhân chồi.
𝐡ệ𝐬ố𝐧𝐡â𝐧𝐜𝐡ồ𝒊= tổng số chồi thu được tổng số chồi cấy ban đầu