Xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel (Window 2007).
Đánh giá số liệu có sự sai khác về mặt thống kê bằng phần mềm Stagraphic 3.0 (các kết quả xử lý thể hiện ở phần phụ lục của luận văn).
Để đánh giá các tính trạng số lượng, đề tài sử dụng các công thức thống kê sinh học cơ bản đang được áp dụng phổ biến trong những nghiên cứu sinh học và nông nghiệp sau:
Giá trị trung bình của tập hợp mẫu
𝑿 = 𝒙𝟏+𝒙𝟐+𝒙𝟑+⋯.+𝒙𝒏
Phương sai mẫu
Ước lượng trung bình mẫu
Trong đó: x1, x2,...xn: số liệu từng mẫu,
𝑋: giá trị trung bình mẫu, M:ước lượng trung bình mẫu n: số lượng mẫu khảo sát
S: độ lệch chuẩn, S2: phương sai mẫu
Với n ≥ 30 thì độ tin cậy của mẫu là γ = 95% và C = 1,96 (đọc ở bảng Student)
Công thức tính mức độ trội hp ở F1 (Beili và Atkius, 1996):
ℎ𝑝=F1−mp
P−mp
Với:
• F1: giá trị trung bình của tính trạng nghiên cứu ở F1
• mp: giá trị trung bình tính trạng của hai bố mẹ
• P: giá trị trung bình của tính trạng nghiên cứu ở bố hoặc mẹ trội hơn.
Nếu:
• hp=0: không trội
• hp=1: trội hoàn toàn
• -1<hp<0: trội không hoàn toàn, ưu thế lai âm, thiên về dạng có trị số tuyệt đối của tính trạng nhỏ hơn.
• 0<hp<1: : trội không hoàn toàn, ưu thế lai dương, thiên về dạng có trị số tuyệt đối của tính trạng lớn hơn.
• hp<-1: siêu trội âm, hp>1: siêu trội dương [dẫn theo 11].
( 1 ) ( 2 ) ( ) ( ) 2 2 2 2 2 1 ... n 1 i i n i x X x X x X S x X n n → = − + − + + − = = ∑ − S M X C n = ±
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả nuôi cấy tạo cụm chồi in-vitro các hạt lúa lai F1
3.1.1. Kết quả khử trùng hạt lúa lai F1
Hạt lai F1 của các tổ hợp lai được tiến hành khử trùng theo quy trình đã nêu, kết quả khử trùng mẫu trong 2 điều kiện khử trùng KT1 và KT2 được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả khử trùng hạt lai F1 của các tổ hợp lai
STT TỔ HỢP LAI SỐ HẠT KHỬ TRÙNG SỐ HẠT NHIỄM TỈ LỆ NHIỄM (%) KT1 KT2 KT1 KT2 KT1 KT2 1 HT2/NTD2 30 30 0 0 0,00 0,00 2 NTD2/HT2 30 30 4 4 13,33 13,33 3 HT1/TX1-2 30 30 3 0 10,00 0,00 4 TX1-2/TD 30 30 3 0 13,33 0,00 5 NHĐB-TX93/TD 30 30 5 0 16,67 0,00 6 NTD2/TD 30 30 0 0 0,00 0,00 7 JAS/TD 30 30 0 0 0,00 0,00 8 NT1/BT7 30 30 0 0 0,00 0,00 9 NT1/HT2 30 30 5 0 16,67 0,00
Các tổ hợp lai 1, 6, 7, 8, tỉ lệ nhiễm trong 2 nghiệm thức đều là 0%. Tổ hợp 2 có tỉ lệ nhiễm ở 2 điều kiện như nhau, đều là 13,33 %. Các tổ hợp 3, 4, 5, 9 có tỉ lệ nhiễm trong điều kiện khử trùng KT1 (3 phút) nhiều hơn trong KT2 (5 phút). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhìn chung, các hạt lai của 8 trong 9 tổ hợp lai đều bị nhiễm ít hơn khi được khử trùng với thời gian dài hơn (5 phút). Do lai bằng phương pháp cắt bỏ bao hoa, các hạt lai hình thành và phát triển trong điều kiện không được bảo vệ hoàn toàn bởi vỏ trấu, nên khả năng nhiễm khuẩn chắc chắn cao hơn so với các hạt bình thường. Vì thế, khi khử trùng trong thời gian dài hơn giúp tiêu diệt các mầm bệnh hiệu quả
và triệt để hơn, tỉ lệ nhiễm thấp. Riêng trường hợp tổ hợp lai 2, kết quả khử trùng trong cả 2 nghiệm thức không khác nhau, điều này cho phép kết luận mức độ nhiễm khuẩn của các hạt lai chắc chắn không giống nhau và ở nhiều mức độ khác nhau.
Như vậy, hiệu quả diệt nấm khuẩn trên bề mặt hạt chủ yếu phụ thuộc vào thời gian và nồng độ xử lý, ngoài ra còn phụ thuộc vào khả năng xâm nhập của chúng vào các ngõ ngách trên bề mặt mẫu cấy [16].
Sau khi khử trùng, các hạt lai được cấy lên môi trường nảy mầm ở 2 nghiệm thức là NC1 và NC2. Ở cả 2 môi trường, sau 3-4 ngày cấy, hạt lúa trương nước và nảy mầm. Sau 8-10 ngày, các chồi lớn dần, xuất hiện vài rễ nhỏ.
Quan sát sự nảy mầm của các hạt lai trong NC1, nhận thấy chúng nảy mầm đồng đều, chồi phát triển to khỏe và cứng cáp hơn so với các hạt lai được cấy trên NC2. Sự khác biệt này có lẽ do hàm lượng BA (một loại cytokinin) trong 2 môi trường không giống nhau. Môi trường NC1 chứa hàm lượng BA nhiều hơn NC2 (4,5mg/l so với 3,5mg/l) đã có tác động thúc đẩy quá trình nảy mầm nhanh hơn, chồi phát triển khỏe và cứng cáp hơn. Điều này hoàn toàn phù hợp với những nghiên cứu về tác động sinh lí của nhóm cytokinin, trong môi trường nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, đặc biệt tăng cường phát sinh chồi phụ [5], [7].
Bên cạnh đó, khi so sánh sức nảy mầm của các hạt lai trong cùng một tổ hợp lai ở 2 nghiệm thức nhận thấy, các hạt lai được khử trùng ở điều kiện 3 phút tỏ ra ưu thế hơn các hạt được khử trùng ở điều kiện 5 phút. Các hạt nảy mầm đồng đều và chồi cũng phát triển khỏe hơn. Điều này có thể là do khử trùng trong thời gian dài tuy tiêu diệt mầm bệnh hiệu quả hơn, nhưng nếu thời gian không thích hợp cũng làm giảm sức sống, sức nảy mầm của phôi, có thể làm chết mô cấy [5]. Đặc biệt với đối tượng nuôi cấy là các hạt lai, sự hình thành phôi nhũ của chúng không hoàn hảo, hạt nhỏ, khả năng cung cấp dinh dưỡng cũng như bảo vệ phôi hạn chế hơn so với những hạt phát triển trong điều kiện bình thường.
Như vậy, kết hợp 2 chỉ tiêu đánh giá về hiệu quả khử trùng và sức nảy mầm của hạt thì chọn điều kiện khử trùng KT1, vì dù ở KT1 tỉ lệ nhiễm cao hơn, nhưng
hạt được khử trùng ở nghiệm thức này lại có sức nảy mầm mầm tốt, do đó khả năng sinh trưởng và phát triển chắc chắn sẽ tốt hơn.
HT2/NTD2 NTD2/HT2 HT1/TX1-2
TX1-2/TD TX93/TD NTD2/TD
JAS/TD NT1/BT7 NT1/HT2
Hình 3.1. Giai đoạn nảy mầm in-vitro của các hạt lai F1 sau 1 tuần
3.1.2. Kết quả nuôi cấy tạo cụm chồi in-vitro
Nhân nhanh cụm chồi là giai đoạn kích thích sự phân hóa các chồi từ một hay vài chồi ban đầu. Đây là giai đoạn không thể thiếu với một quy trình sản xuất giống bằng phương pháp nhân giống in-vitro. Trong giai đoạn này sự sinh trưởng và phát triển của mô nuôi cấy phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, ánh sáng),
môi trường nuôi cấy (thành phần dinh dưỡng, chất điều hòa sinh trưởng và tỉ lệ giữa chúng). Tùy theo từng loài cây mà người ta có thể bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất điều hòa sinh trưởng với nồng độ và tỉ lệ khác nhau để thu được hệ số nhân chồi và chất lượng chồi cao nhất.
Sau khi các hạt lai F1 nảy mầm được khoảng 7-10 ngày và đạt chiều cao khoảng 4-5 cm thì tiến hành bước tạo cụm chồi trong 2 nghiệm thức NC1 và NC2. Trong mỗi nghiệm thức, mỗi tổ hợp lai cấy 10 chồi, phân bố trong 3 bình tam giác 250ml, lặp lại 3 lần. Quan sát quá trình tạo cụm chồi ở một số khía cạnh: tốc độ nhân chồi, sức sống của các chồi cũng như khả năng thích ứng với môi trường tạo cụm chồi.
Bảng 3.2. Kết quả nuôi cấy in-vitro tạo cụm chồi hạt lai F1
S T T TỔ HỢP LAI SỐ HẠT NẢY MẦM SỐ CHỒI (3 TUẦN) SỐ CHỒI (5 TUẦN) HỆ SỐ NHÂN CHỒI (SAU 5 TUẦN) NC1 NC2 NC1 NC2 NC1 NC2 NC1 NC2 1 HT2/NTD2 30 30 72 70 240 138 8,00 ± 0,65 4,60 ± 0,60 2 NTD2/HT2 26 26 99 35 437 69 16,81 ± 1,75 2,65 ± 0,51 3 HT1/TX1-2 27 30 65 64 112 141 4,15 ± 0,77 4,70 ± 0,81 4 TX1-2/TD 27 30 40 45 68 66 2,51 ± 0,53 2,20 ± 0,40 5 NHĐB-TX93/TD 25 30 33 39 166 66 6,64 ± 1,46 2,20 ± 0,49 6 NTD2/TD 30 30 96 66 135 102 4,50 ± 1,02 3,40 ± 0,97 7 JAS/TD 30 30 73 57 394 103 13,13 ± 2,25 3.43 ± 1,09 8 NT1/BT7 30 30 36 57 111 75 3,70 ± 0,88 2,50 ± 0,53 9 NT1/HT2 25 30 67 80 383 94 15,32 ± 3,34 3,13 ± 0,57
Quan sát sự tạo cụm chồi của các chồi ban đầu sau 3 tuần và 5 tuần trong môi trường tạo cụm chồi thu được kết quả như bảng 3.2.
So sánh khả năng tạo cụm chồi của các tổ hợp lai trong 2 nghiệm thức NC1 và NC2 sau 5 tuần nhân chồi đều thấy, ngoại trừ tổ hợp lai HT1/TX1-2, tất cả các tổ
hợp lai còn lại đều cho kết quả nhân chồi tốt hơn khi nuôi trong NC1 (môi trường có nồng độ BA cao hơn), đáng chú ý là các tổ hợp NTD2/HT2, JAS/TD, NT1/HT2 có hệ số nhân chồi ở NC1 gấp 4-8 lần NC2. Điều này hoàn toàn phù hợp với những nghiên cứu về tác động sinh lí của nhóm cytokinin trong nuôi cấy mô thực vật, đó là khả năng tăng cường quá trình phát sinh chồi phụ, đặc biệt là của BA [5].
Tổ hợp HT1/TX1-2 tạo cụm chồi tốt hơn ở NC2, tổ hợp TX1-2/TD tạo cụm chồi trong 2 nghiệm thức không chênh lệch quá lớn (2,51 chồi ở NC1 và 2,20 chồi ở NC2).
Hệ số nhân chồi của tổ hợp lai TX1-2/TD và NT1/BT7 tỏ ra hạn chế trong cả 2 nghiệm thức, có lẽ đây chưa phải là môi trường nhân chồi thuận lợi cho 2 đối tượng này.
Quan sát tốc độ nhân chồi của các hạt lai thuộc các tổ hợp lai khác nhau chúng tôi nhận thấy, mặc dù đã được cấy nảy mầm trên chính môi trường dùng để nhân chồi nhằm tạo sự thích ứng nhanh chóng cho các chồi, nhưng sự phát triển của cụm chồi trong giai đoạn 3 tuần đầu tiên vẫn tương đối chậm, trung bình 1 chồi ban đầu nhân được 1-3 chồi mới. Sau 3 tuần, một số cụm chồi bị đen ở gốc, một vài chồi bị khô do cạn kiệt chất dinh dưỡng. Sau khi cấy chuyền đổi môi trường thì tốc độ nhân chồi tăng lên rõ rệt do các chồi đã thích nghi hoàn toàn với môi trường nuôi cấy, đồng thời chất dinh dưỡng được cung cấp dồi dào hơn nên đã phát triển thuận lợi, đáng chú ý là các tổ hợp 2, 7, 9 có hệ số nhân chồi sau 5 tuần đạt trung bình từ 13,13 đến 16,81chồi.
Xét về sức sống của các chồi thì thấy: các chồi được cấy trên môi trường NC1 tỏ ra ưu thế hơn các chồi cấy trên NC2, cụm chồi phát triển tương đối đồng đều, chồi to khỏe, cứng cáp và xanh tốt hơn. Đây là một đặc điểm thuận lợi cho việc tách riêng từng chồi trong quá trình tạo rễ để hình thành cây in-vitro hoàn chỉnh ở giai đoạn sau, vì bản thân các chồi nếu có sức sống cao thì việc tạo rễ sẽ dễ dàng, cũng như khả năng thích ứng với môi trường tự nhiên sẽ tốt hơn.
Như vậy, khả năng nhân chồi của các tổ hợp lai phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy, bản thân đặc điểm vật liệu nuôi cấy và khả năng thích ứng với môi trường
của mẫu cấy. Trong giới hạn của nội dung thực nghiệm, khả năng tạo cụm chồi trong NC1 có hiệu quả hơn NC2. Các tổ hợp lai thích hợp nhất với môi trường nuôi cấy NC1 để tạo cụm chồi là HT2/NTD2, NTD2/HT2, JAS/TD, NT1/HT2.
HT2/NTD2 NTD2/HT2 HT1/TX1-2
TX1-2/TD NHĐB-TX93/TD NTD2/TD
JAS/TD NT1/BT7 NT1/HT2 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
HT2/NTD2 NTD2/HT2 HT1/TX1-2
TX1-2/TD NHĐB-TX93/TD NTD2/TD
JAS/TD NT1/BT7 NT1/HT2
HT2/NTD2 NTD2/HT2 HT1/TX1-2
TX1-2/TD NHĐB-TX93/TD NTD2/TD
JAS/TD NT1/BT7 NT1/HT2
HT2/NTD2 NTD2/HT2 HT1/TX1-2
TX1-2/TD NHĐB-TX93/TD NTD2/TD
JAS/TD NT1/BT7 NT1/HT2
3.1.3. Kết quả tạo rễ cho các chồi in-vitro
Môi trường tạo rễ cho các chồi in-vitro sử dụng trong thí nghiệm là môi trường MS, không bổ sung thêm chất điều hòa tăng trưởng [17].
Quan sát sự hình thành rễ của các chồi nhận thấy:
• Tất cả các chồi của các tổ hợp lai lai đều thích ứng khá tốt với môi trường MS để tạo rễ, sau khoảng một tuần cấy chuyền, đa số các chồi của các tổ hợp đều bắt đầu hình thành rễ con. Tuy nhiên, tốc độ và số lượng rễ tạo thành có sự khác biệt.
• Các chồi của các tổ hợp lai HT1/TX1-2, NHĐB-TX93/TD, NTD2/TD hình thành rễ con chậm (sau khoảng 10 ngày) và ít hơn, các rễ cũng phát triển yếu, nhỏ và ngắn hơn so với các chồi của các tổ hợp lai khác.
• Các chồi của các tổ hợp lai còn lại HT2/NTD2, NTD2/HT2, TX1- 2/TD, JAS/TD, NT1/BT7, NT1/HT2 đều hình thành rễ nhanh chóng (sau khoảng 1 tuần), số lượng rễ con nhiều, các rễ có màu trắng, phát triển khỏe mạnh, phân nhánh tạo nhiều rễ phụ.
• Sự tạo rễ diễn ra thuận lợi ở những chồi to khỏe, ở các chồi nhỏ thì sự hình thành rễ chậm và ít hơn. Cùng với sự hình thành rễ, phần chồi cũng phát triển thêm về chiều cao và đường kính thân, kéo lá dài hơn.
• Một số chồi sau một thời gian cấy vào môi trường tạo rễ cũng không hình thành rễ, có thể do thao tác tách riêng từng chồi trong cụm chồi chưa hoàn hảo, đã làm tổn thương phần thân giả của chồi, do đó không hình thành được rễ.
Các quan sát trên chứng tỏ khả năng tạo rễ không chỉ phụ thuộc vào thành phần môi trường nuôi cấy mà còn liên quan trực tiếp đến đặc điểm riêng của vật liệu nuôi cấy (các tổ hợp lai khác nhau), tuổi của chồi cũng như sức sống của từng chồi riêng biệt.
HT2/NTD2 NTD2/HT2 HT1/TX1-2
TX1-2/TD NHĐB-TX93/TD NTD2/TD
JAS/TD NT1/BT7 NT1/HT2
Hình 3.6. Kết quả tạo rễ của các cây F1 trong môi trường MS (sau 2 tuần)
Nhìn chung, trong môi trường MS không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng, sự hình thành rễ vẫn diễn ra khá thuận lợi. Điều này là do chồi dễ dàng phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng [16]. Mặc dù sự hình thành rễ là do tác động của auxin, nhưng trong quá trình phát triển, bản thân các chồi đã hấp thụ một lượng nhất định auxin từ môi trường nuôi cấy, hơn nữa chúng còn tạo thêm một lượng
auxin nội sinh nhất định, vì thế khi chuyển sang môi trường MS không bổ sung auxin, rễ vẫn có thể phát sinh.
HT2/NTD2 NTD2/HT2 HT1/TX1-2
TX1-2/TD NHĐB-TX93/TD NTD2/TD
JAS/TD NT1/BT7 NT1/HT2
Hình 3.7. Cây F1 in-vitro hoàn chỉnh của các tổ hợp lai 3.1.4. Tỉ lệ sống sót của cây in-vitro khi đem trồng trong chậu đất
Các cây in-vitro sau khi hình thành hệ rễ tương đối hoàn chỉnh được đưa ra ngoài và trồng trong chậu chứa đất ruộng đã được chuẩn bị trước. Quan sát tỉ lệ sống sót và sự phát triển của các cây này trong 1-2 tuần đầu, thông qua đó đánh giá hiệu quả của công tác nhân chồi.
Bảng 3.3. Tỉ lệ sống sót của các cây lúa in-vitro khi trồng trong chậu đất STT TỔ HỢP LAI SỐ CÂY IN-VITRO SỐ CÂY SỐNG SÓT TRONG CHẬU ĐẤT (SAU 2 TUẦN) TỈ LỆ SỐNG (%) 1 HT2/NTD2 378 348 92,06 2 NTD2/HT2 506 495 97,83 3 HT1/TX1-2 253 239 94,47 4 TX1-2/TD 134 121 90,30 5 NHĐB-TX93/TD 232 216 93,10 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});