Acid citric là một loại acid hữu cơ thuộc loại yếu và thƣờng đƣợc tìm thấy trong các loại trái cây thuộc họ cam quít. Nó là chất bảo quản thực phẩm tự nhiên và thƣờng đƣợc thêm vào thức ăn và đồ uống để làm vị chua. Ở lĩnh vực hóa sinh thì acid citric đóng vai trò quan trọng trong chu trình acid citric của quá trình trao đổi chất xảy ra trong tất cả các vật thể sống. Ngoài ra acid citric cũng đóng vai trò là một chất tẩy rửa an toàn đối với môi trƣờng và đồng thời cũng là một tác nhân chống oxy hóa. Acid citric có nhiều trong các loại rau quả và đƣợc tìm thấy nhiều nhất trong trái chanh. Theo ƣớc tính thì trong trái chanh acid citric chiếm khoảng 8% khối lƣợng khô.
Hình 2.9: Công thức cấu tạo acid citric
http://www.hoahocngaynay.com/vi/hoa-hoc-va-doi-song/hoa-thuc-pham/241-tim-hieu-ve-axit- citric.html
Ở nhiệt độ phòng acid citric tồn tại ở dạng tinh thể màu trắng dạng bột hoặc dạng khan hoặc dạng monohydrate có chứa một phân tử nƣớc trong mỗi phân tử của acid citric. Dạng khan của acid citric thì kết tinh trong nƣớc nóng, ngƣợc lại dạng monohydrate thì kết tinh trong nƣớc lạnh, ở nhiệt độ 74C thì dạng monohydrat sẽ chuyển sang dạng khan. Về mặt hóa học thì acid citric cũng có tính chất tƣơng tự nhƣ các dạng acid cacboxylic khác, khi nhiệt độ trên 175C thì nó sẽ bị phân hủy tạo thành CO2 và H2O. Theo Bohdziewicz et al., (1994), acid citric có khả năng tạo phức với nhiều kim loại nhƣ sắt, đồng, mangan, magie. Nhờ vậy mà nó có khả năng chống oxy hóa hiệu quả trong các lĩnh vực bảo quản rau quả và nhiều loại thực phẩm khác.
Trong vai trò của một phụ gia thực phẩm, acid citric đƣợc sử dụng nhƣ là chất tạo hƣơng vị và chất bảo quản trong thực phẩm và đồ uống, đặc biệt là các loại đồ uống nhẹ, đƣợc ký hiệu là E330. Acid citric có tự nhiên trong cơ thể, trong thức ăn thông thƣờng và đƣợc coi là không độc. Tuy nhiên nếu dùng nhiều và thƣờng xuyên acid citric có thể làm hỏng men răng. Khi tiếp xúc với mắt nó có thể gây tổn thƣơng mắt (Hoàng Ngọc Hùng và Vũ Chu Hùng, 2006).
Citric acid là một trong các acid đƣợc sử dụng rộng rãi nhất cho việc ức chế màu nâu trong các phản ứng hóa nâu do enzyme. Acid citric là một yếu acid hữu cơ tự nhiên thƣờng đƣợc tìm thấy trong trái cây citrus và đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ là
một phụ gia thực phẩm. Nồng độ acid citric cao hơn cho vị đắng, do đó việc sử dụng phụ gia thực phẩm này đƣợc giới hạn bởi liều lƣợng sử dụng. Acid citric có khả năng tạo cầu nối và khả năng cô lập các enzyme gây phản ứng hóa nâu, tuy nhiên tác động hóa nâu của acid citric chủ yếu là do đặc tính acid, làm giảm pH và kết hợp với nguyên tố đồng tại trung tâm hoạt động enzyme (Paul và Palmer, 1972). Nó thƣờng đƣợc dùng nhƣ là một tác nhân tạo acid hóa có tác dụng tƣơng tự nhƣ acid erythorbic (McCord và Kilara, 1983). Acid citric tạo môi trƣờng acid mạnh với pH thấp có tác dụng ức chế hoạt tính PPO hoạt động mạnh ở pH 5 ÷ 7 (Paul và Palmer, 1972).
2.4.2 Acid ascorbic (C6H8O6)
Acid ascorbic là một hợp chất hữu cơ tự nhiên với các đặc tính chống oxy hóa, là chất rắn màu trắng, nhƣng các mẫu không tinh khiết có thể xuất hiện màu vàng. Acid ascorbic dễ bị hòa tan trong nƣớc và tạo ra môi trƣờng acid nhẹ. Ascorbic còn có tính chất của vitamin C (L-ascorbic). Trong hóa học, ngoài L-ascobic acid thì acid ascorbic còn có một đồng phân khác là D-ascorbic acid nhƣng dạng này không tồn tại trong tự nhiên, có thể đƣợc tổng hợp nhân tạo và có khả năng chống oxy hóa giống hệt nhƣ L-ascorbic. Tuy nhiên D-ascorbic thì lại không có nhiều hoạt tính vitamin C nhƣ là L-ascorbic acid (mặc dù không hoàn toàn là không). Điều này cho thấy khả năng chống oxy hóa của acid ascorbic chỉ có một phần nhỏ vitamin tham gia hoạt động.
Hình 2.10: Công thức cấu tạo L-ascorbic acid
(http://www.hoahocngaynay.com/vi/hoa-hoc-va-doi-song/hoa-thuc-pham/239-vitamin-c.html)
Acid ascorbic cũng có nguồn gốc tƣơng tự nhƣ các phân tử đƣờng, mang nhiều nhóm thế chứa oxy. Phân tử ascorbic acid tồn tại ở trạng thái cân bằng với hai dạng ketone và enol, trong đó dạng ketone ổn định hơn dạng enol. Nhƣ là một chất bị oxy hóa nhẹ, acid ascorbic bị phân hủy khi tiếp xúc với không khí. Phản ứng này sẽ xảy ra nhanh chóng khi tiếp xúc thêm với các ion kim loại và ánh sáng, nó có thể bị oxy hóa một phần hoặc hoàn toàn tạo thành dehydroascorbic acid (Steele et al., 1976).
Acid ascorbic hoạt động nhƣ một chất chống oxy hóa, thƣờng phản ứng với các oxy của các gốc tự do, chẳng hạn nhƣ các gốc tự do hydroxyl hình thành từ độ phân tử. Các hình thức tự oxy hóa của acid ascorbic thƣờng không kèm theo các
phản ứng phụ khác và không gây ảnh hƣởng đến các mô của tế bào (Kim et al.,
2000). Ascorbic acid là một tác nhân có khả năng làm giảm tác động tạo màu nâu trong phản ứng hóa nâu. Nó tạo thành muối trung tính và tan trong nƣớc. Acid ascorbic đƣợc công nhận là an toàn (GRAS) để sử dụng trong trái cây và rau quả và có lẽ là chất đƣợc sử dụng rộng rãi.
Acid ascorbic và erythorbic đồng phân đã đƣợc sử dụng rộng rãi trong các công nghiệp thực phẩm do đặc tính chống oxy hóa. Cả hai loại acid đóng vai trò thay đổi thế oxy hóa khử. Vai trò trong chống màu nâu là giảm o-quinone thành o-diphenols trong phản ứng hóa nâu do enzyme (Golan-Goldhirsh et al., 1992).
2.4.3 Sodium chloride (NaCl)
Natri chloride là bột tinh thể màu trắng hay tinh thể không màu, vị mặn, không có mùi. Dung dịch natri chloride trong nƣớc ăn mòn sắt, cũng có thể phản ứng tạo kết tủa với bạc, chì và thủy ngân; bị chất oxy hóa mạnh giải phóng clo. NaCl có tác dụng ức chế sự hóa nâu. Tuy nhiên, để vô hoạt hoàn toàn phenolase cần NaCl có nồng độ cao. Ở nồng độ cao, muối NaCl có vị mặn không thích hợp trong nhiều trƣờng hợp chế biến. Do đó, việc ngâm muối có một giá trị giới hạn (Hoàng Kim Anh, 2005).
Sodium choride đƣợc biết đến nhƣ là tác nhân chống oxy hóa enzyme PPO; khả năng ức chế của enzyme PPO gia tăng khi pH giảm. Ion Cl- là một tác nhân ức chế hóa nâu yếu; một số tác giả đã báo cáo rằng nồng độ ion Cl- yêu cầu cho việc ức chế PPO là cao, và có thể tác động đến mùi vị của sản phẩm (Mayer và Harel, 1991). Trái lại, một vài tác giả tin rằng việc kiểm soát hóa nâu có thể thực hiện bằng cách ngâm dung dịch acid; pH ít nhất 3,5 (Rouet-Mayer và Philippon, 1986).
2.4.4 Hợp chất sulfite
Sulfur dioxyde và các sulfite nhƣ sodium sulfite, sodium bisulfite, sodium metabisulfite, sodium thiosulfite có ƣu điểm là rẻ, dễ sử dụng và là những chất ức chế mạnh của phenolase, có khả năng ngăn cản sự biến màu và hoạt động nhƣ là tác nhân chống oxy hóa. Các chất trên có tác dụng ngăn cản sự phát triển của vi sinh vật và hạn chế hƣ hỏng và bảo vệ vitamin C, ngăn chặn hiện tƣợng biến đổi màu tự nhiên của rau quả (Lê Ngọc Tú, 2004). Khi xử lý ở nồng độ cao sẽ gây mùi lạ cho sản phẩm. Việc sử dụng SO2 thừa có thể loại bỏ sau khi vô hoạt phenolase. Mặc dù vậy, việc sử dụng các hợp chất sulfite trong chế biến thực phẩm hiện đang đƣợc xem xét rất cẩn thận, năm 1986, FDA đã đƣa sulfite vào danh mục các phụ gia không đƣợc sử dụng trong các loại rau quả ăn liền (Martinez, 1995; Sapers, 1993).
Hình 2.11: Cơ chế ức chế phản ứng hóa nâu do enzyme bằng sulfite
(Lê Ngọc Tú, 2004)
2.5 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN
Một trong những vấn đề thƣờng xảy ra trong chế biến nguyên liệu khoai lang là sự hóa nâu và các biến đổi vật lý nhƣ mất nƣớc, dẫn đến làm giảm giá trị cảm quan cũng nhƣ chất lƣợng nguyên liệu một cách nhanh chóng. Các nghiên cứu về tính chất và hoạt động của enzyme PPO đã và đang đƣợc nhận đƣợc sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới. Deepaa Manohan và Wong Chen Wai (2012) đã nghiên cứu những ảnh hƣởng của nhiệt độ, pH, các chất ức chế tác động lên hoạt tính PPO trong khoai lang. Theo đó, nhiệt độ và pH tối ƣu tƣơng ứng là 30oC và độ pH là 7,0. Các thông số động học Km, Vmax của enzyme trong phƣơng trình động học lần lƣợt là 357,14 mM và 1000 EU/min/mL, sử dụng catechol làm cơ chất. Enzyme PPO hiện diện ở hầu hết các loại thực vật, bao gồm đu đủ, táo, đào, chuối, nho, xoài, atisô, hạt dẻ, cải bắp, rau diếp… Ngoài ra, PPO cũng đƣợc tìm thấy trong tôm và các loài thủy sản khác (Rolle et al., 1991; Chen et al., 1997). Những sản phẩm của quá trình hóa nâu có tác động kinh tế rất lớn đến ngành công nghiệp thực phẩm, ức chế PPO trong sản phẩm thủy sản đã đƣợc nghiên cứu rộng rãi (Yoruk và Marshall, 2003). Sự hoá nâu ở thực vật có thể làm chậm lại hoặc loại bỏ bằng cách hạn chế sự hiện diện của các chất phản ứng (oxy, phenolic,…) hoặc bằng cách sử dụng các phụ gia ức chế hoạt động của PPO (Dogan et al., 2001). Ngoài ra, sự ức chế enzyme hoá nâu trong thực vật là kết quả của sự vô hoạt enzyme PPO, loại bỏ những yếu tố thúc đẩy phản ứng hóa nâu và ngăn chặn sự hình thành các sản phẩm có màu (Ausin et al., 1995; McEvilly và Iyengar, 1992). Để ngăn chặn sự tiếp xúc của oxy với PPO trong khoai lang bị tác động cơ học trong quá trình thu hoạch và tồn trữ là rất hạn chế vì oxy tồn tại khắp nơi trong không khí và hiện diện trong cả tế bào thực vật. Chính vì thế, việc nghiên cứu sử dụng các loại phụ gia có khả năng hạn chế sự biến đổi màu là rất cần thiết.
Một số chất ức chế sodium bisulfite, acid ascorbic (Ausin et al., 1995, Lee et al., 1983), acid citric và acid acetic (Yang et al., 2001), L-cysteine, natri azit, acid tannic, acid benzoic và β-mercaptoethanol (Sakiroglu et al., 1996) đƣợc các nhà nghiên cứu sử dụng để ngăn chặn enzyme hoá nâu. Trong nghiên cứu, các chất ức chế hay phụ gia nhƣ acid citric, natri bisulfite, natri clorua và acid ascorbic đã đƣợc lựa chọn nhƣ các tác nhân làm giảm hoạt động của enzyme, thông qua hoạt tính của PPO khi phản ứng với cơ chất thích hợp, làm ngăn chặn tiến trình hoá nâu của PPO trong khoai lang. Sự biến đổi màu chậm lại là do sự có mặt các chất ức chế làm giảm sự hình thành quinone dƣới sự hiện diện của enzyme hóa nâu, tác động lên chính sản phẩm của quá trình hóa nâu (o-quinone) chuyển thành trạng thái ban đầu dihydroxyphenols hoặc phản ứng tạo ra các sản phẩm bền. Một số chất ức chế khác không tƣơng tác với sản phẩm sau phản ứng hóa nâu mà ảnh hƣởng trực tiếp hoạt động của enzyme PPO, vì thế cũng làm giảm hiện tƣợng hóa nâu trên rau quả sau quá trình thu hoạch, chế biến (Vamos-Vigyazo,1981).
Đối với từng loại nguyên liệu, các thông số về pH, nhiệt độ tối thích cũng nhƣ hiệu quả ức chế sự hóa nâu của các phụ gia tác động đến PPO cũng có sự thay đổi. Điển hình nhƣ giá trị pH tối ƣu cho hoạt động của PPO đƣợc ghi nhận ở dâu tây là 4,5 (Oktay et al., 1995) trong khi ở táo lại có giá trị pH tối ƣu là 9,0 (Wesche-Ebling và Montgomery, 1990). Tƣơng tự, nhiệt độ tối thích cho hoạt động của PPO cũng có sự thay đổi đáng kể, phần lớn PPO có nhiệt độ tối ƣu ở mức nhiệt độ phòng (Oktay et al., 1995), tuy nhiên đối với từng loại nguyên liệu, thậm chí thay đổi nguồn nguyên liệu trích ly, cơ chất phản ứng cũng là nguyên nhân dẫn đến sự thay đổi nhiệt độ tối thích. Điển hình nhƣ nhiệt độ tối thích PPO trích ly từ hột xoài là 25°C, trong khi giá trị tƣơng ứng từ PPO có nguồn gốc là vỏ quả xoài cùng loại là 50°C (Oktay et al., 1995). Điều này đã chứng tỏ đặc điểm của PPO phụ thuộc rất lớn vào nguồn trích ly, cơ chất phản ứng và các điều kiện môi trƣờng. Chính vì vậy, việc khảo sát tính chất của PPO phải đƣợc khảo sát một cách cụ thể trên từng đối tƣợng, làm cơ sở cho các nghiên cứu và ứng dụng tiếp theo.
CHƢƠNG 3 PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 PHƢƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM
3.1.1 Địa điểm, thời gian
Các thí nghiệm đƣợc tiến hành bố trí, theo dõi các chỉ tiêu và xử lý số liệu tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trƣờng Đại học Cần Thơ.
Thời gian thực hiện đề tài từ 05/08/2013 đến 15/11/2013.
3.1.2 Dụng cụ, thiết bị
- Cân điện tử Vibra, model DJ - 1000TW, độ chính xác 0,01 g, Nhật, - pH kế HANNA, model TOA pH meter HM - 12P, độ chính xác 0,01, Ý, - Máy ly tâm, model 800 Electronic Centrifuge, Trung Quốc,
- Máy đo quang phổ Spectrophotometer, model U-2800, Hitachi, Nhật, - Máy xay sinh tố Gali, model GL-1505, Trung Quốc,
- Tủ lạnh Alaska, model LC-633A, Mỹ,
- Lò sấy Sanaky, model VH-50HP, nhiệt độ 100 ÷ 250C, Trung Quốc, - Bể điều nhiệt Memmert, model WB-10, công suất 1.250 W, Đức,
- Nhiệt kế Hanna, model M-7860, -50 ÷ 150°C, độ chính xác 0,1°C, Mauritius, - Máy lắc ống nghiệm, model IKA, Đức,
- Micropipet 1.000 µL (Isolab, Đức) và 5 mL (Hirschoman, Đức), - Thiết bị lọc chân không, Trung Quốc,
- Một số dụng cụ khác trong phòng thí nghiệm. - Hóa chất dùng trong thí nghiệm
- Sodium chloride (NaCl): Độ tinh khiết ≥ 99,5%, Thái Lan. - Catechol (C6H4(OH)2):Độ tinh khiết ≥ 99,6%, Merck
- L-ascorbic acid (C6H8O6): Độ tinh khiết ≥ 99,7%, Trung Quốc.
- Acid citric monohydrate (C6H8O7. H2O): Độ tinh khiết ≥ 99,5%, Trung Quốc. - Sodium bisulfite (NaHSO3): Độ tinh khiết ≥ 96,0%, Trung Quốc
- Sodium dihydrogren phosphate dihydrate (NaH2PO4.2H2O): Độ tinh khiết ≥ 99,0%, Trung Quốc.
- Disodium hydrogren photphate dodecahydrate (Na2HPO4.12H2O): Độ tinh khiết ≥ 99,0%, Trung Quốc.
Các hóa chất sử dụng đƣợc nhập khẩu bởi Chi nhánh Cty CP Hóa chất & Vật Tƣ KHKT TP. Hồ Chí Minh, phân phối bởi Chi nhánh Cty CP Hóa Chất & Vật Tƣ KHKT Cần Thơ.
3.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1.3 Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu
Khoai lang trắng đƣợc thu nhận từ huyện Bình Tân (Vĩnh Long), độ tuổi (90 ÷ 105 ngày), bao gói bằng bao bì PE và bảo quản ở nhiệt độ thƣờng (30 ± 2ºC), sau đó vận chuyển về phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ thực phẩm, trƣờng Đại học Cần Thơ. Thời gian vận chuyển tối đa 1 ÷ 1,5 giờ.
Nguyên liệu sau khi lấy về đến phòng thí nghiệm tiến hành xử lý sơ bộ và phân tích các chỉ tiêu ban đầu. Chú ý chỉ lấy những củ khoai còn nguyên vẹn, không bị trầy xƣớc nhằm đảm bảo sự ổn định của các kết quả khảo sát.
3.1.4 Phƣơng pháp chuẩn ị dịch trích enzyme PPO th từ khoai lang trắng
Phƣơng pháp chuẩn bị dịch trích ly PPO thô đƣợc tiến hành dựa trên phƣơng pháp của Chikezie (2006). Mẫu khoai lang cần xác định hoạt tính PPO đƣợc cân với khối lƣợng xác định (khoảng 100 g), cắt nhỏ và ngâm trong dung dịch sodium sulfite (10 g/mL) với tỷ lệ nguyên liệu: dịch ngâm là 1: 2 (đảm bảo mẫu đƣợc ngâm ngập hoàn toàn), giữ lạnh (ở nhiệt độ dƣới 4C, sử dụng nƣớc đá) trong thời gian 20 phút, sau đó vớt ráo và rửa lại bằng nƣớc cất.
Cân 25 g mẫu (m, g) sau khi xử lý trong sodium sulfile, nghiền trong cối sứ, bổ sung 50 mL dung dịch đệm phosphate pH 7, đồng nhất mẫu bằng máy xay sinh tố (tốc độ 1500 rpm), sau đó giữ lạnh mẫu trong thời gian 3 phút. Lọc hỗn hợp bằng thiết bị lọc chân không, chú ý giữ lạnh trong thời gian lọc. Dịch lọc đƣợc tiến hành ly tâm với tốc độ 2500 rpm trong thời gian 10 phút ở nhiệt độ 4C, thu dịch lọc chứa enzyme polyphenol oxydase thô. Ghi nhận lại thể tích dịch trích enzyme V thu đƣợc, sử dụng để tính toán hoạt tính PPO có trong nguyên liệu.
3.1.5 Xác định hoạt độ của PPO