Khoai lang trắng đƣợc thu nhận từ huyện Bình Tân (Vĩnh Long), độ tuổi (90 ÷ 105 ngày), bao gói bằng bao bì PE và bảo quản ở nhiệt độ thƣờng (30 ± 2ºC), sau đó vận chuyển về phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ thực phẩm, trƣờng Đại học Cần Thơ. Thời gian vận chuyển tối đa 1 ÷ 1,5 giờ.
Nguyên liệu sau khi lấy về đến phòng thí nghiệm tiến hành xử lý sơ bộ và phân tích các chỉ tiêu ban đầu. Chú ý chỉ lấy những củ khoai còn nguyên vẹn, không bị trầy xƣớc nhằm đảm bảo sự ổn định của các kết quả khảo sát.
3.1.4 Phƣơng pháp chuẩn ị dịch trích enzyme PPO th từ khoai lang trắng
Phƣơng pháp chuẩn bị dịch trích ly PPO thô đƣợc tiến hành dựa trên phƣơng pháp của Chikezie (2006). Mẫu khoai lang cần xác định hoạt tính PPO đƣợc cân với khối lƣợng xác định (khoảng 100 g), cắt nhỏ và ngâm trong dung dịch sodium sulfite (10 g/mL) với tỷ lệ nguyên liệu: dịch ngâm là 1: 2 (đảm bảo mẫu đƣợc ngâm ngập hoàn toàn), giữ lạnh (ở nhiệt độ dƣới 4C, sử dụng nƣớc đá) trong thời gian 20 phút, sau đó vớt ráo và rửa lại bằng nƣớc cất.
Cân 25 g mẫu (m, g) sau khi xử lý trong sodium sulfile, nghiền trong cối sứ, bổ sung 50 mL dung dịch đệm phosphate pH 7, đồng nhất mẫu bằng máy xay sinh tố (tốc độ 1500 rpm), sau đó giữ lạnh mẫu trong thời gian 3 phút. Lọc hỗn hợp bằng thiết bị lọc chân không, chú ý giữ lạnh trong thời gian lọc. Dịch lọc đƣợc tiến hành ly tâm với tốc độ 2500 rpm trong thời gian 10 phút ở nhiệt độ 4C, thu dịch lọc chứa enzyme polyphenol oxydase thô. Ghi nhận lại thể tích dịch trích enzyme V thu đƣợc, sử dụng để tính toán hoạt tính PPO có trong nguyên liệu.
3.1.5 Xác định hoạt độ của PPO
Hoạt tính của PPO (U/g) đƣợc tính toán dựa vào phƣơng pháp của Ensimiger và Vamos–Vigyazo (1995, trích dẫn bởi Chikezie, 2006).
Chuẩn bị dung dịch catechol có nồng độ 0,05 M. Mỗi ống nghiệm đƣợc thêm vào 1 mL dung dịch catechol. Sau đó bổ sung lần lƣợt 3,9 mL 0,1 M đệm phosphate (ở
pH tối ƣu) và phản ứng enzyme đƣợc bắt đầu bằng việc bổ sung 0,1 mL dịch trích enzyme thô PPO. Hỗn hợp này đƣợc nhanh chóng chuyển vào cuvette và đo quang phổ hấp thu ở bƣớc sóng 410 nm sau mỗi 15 giây phản ứng. Hoạt tính PPO tỷ lệ thuận với cƣờng độ hấp thu cực đại của benzoquinones. Một đơn vị enzyme (U) là lƣợng enzyme cần thiết cho phản ứng oxy hóa quinone để mật độ quang cƣờng độ hấp thu tại cực đại của sản phẩm tạo thành benzoquinone tại bƣớc sóng 410 nm lên 0,001 đơn vị trong 1 giây trong điều kiện phản ứng 25o
C, pH tối ƣu. Nhƣ vậy, một đơn vị enzyme U = 10-3
.OD/ giây (Chikezie, 2006; Phan Thanh Bình và ctv, 2009).
C ng thức tính hoạt tính của PPO
Hoạt tính của PPO đƣợc tính dựa trên khối lƣợng khoai lang khô, theo công thức:
𝐴 U/gkhoai lang khô = 𝑎. 𝑉. 100 𝑚 100 − 𝑋
Với a: hoạt tính của PPO trong 1 mL dịch trích (U/mL); V: thể tích dịch trích thu đƣợc (mL) ứng với khối lƣợng khoai lang tƣơi (m, g), X là độ ẩm của khoai lang trong mẫu khảo sát (%).
3.1.6 Phƣơng pháp ác định các th ng số động học Vmax, Km của PPO khoai lang trắng
Sơ đồ phản ứng của polyphenol oxydase xúc tác chuyển hóa catechol thành benzoquinones đƣợc giả thiết theo cơ chế Michealis – Menten (cho phản ứng hai giai đoạn). Sự phụ thuộc giữa vận tốc phản ứng và nồng độ cơ chất đƣợc biểu diễn bằng phƣơng trình Mischaelis-Menten: 𝐸 + 𝑆 𝑘−1 𝑘+1 𝐸𝑆 𝐸 + 𝑃 𝑘2 𝑉 = 𝑉𝑚𝑎𝑥[𝑆] 𝐾𝑚 + [𝑆] 1 𝑉 = 1 𝑉𝑚𝑎𝑥 + 𝐾𝑚 𝑉𝑚𝑎𝑥 ∙ 1
[𝑆] (phƣơng trình Lineweaver – Burk ) Trong đó : Vmax : vận tốc cực đại của phản ứng (U, 10-3
OD/giây) ; Km : hằng số Michaelis-Menten (M) với cơ chất là catechol; [S]: nồng độ cơ chất (catechol, M);
V: vận tốc phản ứng (U, 10-3
OD/giây) tƣơng ứng với sự thay đổi nồng độ catechol.
Vẽ đồ thị biểu diễn độ hấp thụ của PPO theo thời gian. Dựa vào đồ thị tính Vmax, Km vàhoạt tính của enzyme PPO thô. Hoạt tính của PPO đƣợc xác định bằng cách
tính toán hệ số gốc của đƣờng đo độ hấp thụ theo thời gian. Các thông số động học Km, Vmax đƣợc xác định bằng cách vẽ đồ thị theo phƣơng pháp Lineweaver – Burk
Hình 3.1: Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào nồng độ cơ chất theo phƣơng trình Lineweaver – Burk
(Nguồn: Phan Thanh Bình và ctv, 2009)
3.1.7 Chỉ tiêu và các phƣơng pháp phân tích
Các chỉ tiêu cơ bản đƣợc phân tích và đo đạc theo các phƣơng pháp đƣợc trình bày ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1: Phƣơng pháp phân tích và đo đạc các chỉ tiêu
STT Chỉ tiêu Phƣơng pháp
1 Độ ẩm (%) Sấy khô ở nhiệt độ 105oC đến khối lƣợng không đổi theo phƣơng pháp AOAC 934.06
2 Giá trị pH Sử dụng pH kế, theo ISO 2917:1999(E) 3 Dung dịch đệm Chuẩn bị dung dịch đệm theo TCVN 4320-86
3.1.8 Phƣơng pháp thu thập và xử lý số liệu
Các thí nghiệm đƣợc tiến hành trên cơ sở thay đổi một nhân tố và cố định các nhân tố còn lại. Kết quả của thí nghiệm trƣớc đƣợc sử dụng làm thông số cố định cho thí nghiệm kế tiếp. Các thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, riêng thí nghiệm phân tích thành phần ban đầu (độ ẩm và giá trị pH nguyên liệu) đƣợc thực hiện 5 lần. Số liệu đƣợc thu thập và xử lý bằng phần mềm Graphpad Prism 5.01 để vẽ mô hình Mischealis- Menten, Lineweaver – Burk và xác định các thông số động học ban đầu trong nguyên liệu.
3.3 PHƢƠNG PHÁP BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 3.3.1 Quy trình tổng quát 3.3.1 Quy trình tổng quát
Khoai lang (sau thu hoạch)
Xử lý sơ bộ Phân tích ẩm ban đầu
TN {1} {2}, {3}, {4}: Tính chất cơ bản của PPO trong nguyên liệu
Nồng độ cơ chất Nhiệt độ tối thích pH tối thích Chất ức chế Độ bền nhiệt Vmax, Km của enzyme PPO
Hình 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
3.3.2 Thí nghiệm 1: Xác định ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính enzyme polyphenol oxydase trích ly từ khoai lang polyphenol oxydase trích ly từ khoai lang
* Mục đích: Tìm ra pH tối thích cho hoạt động của enzyme PPO trích ly từ khoai lang trắng, trên cơ sở đó, đề xuất pH thích hợp để xác định các thông số động học của PPO từ khoai lang trắng tiếp theo.
* Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí với 1 nhân tố Nhân tố A: Giá trị pH, khảo sát ở 9 mức độ
A1: 6,0 A2: 6,5 A3: 7,0 A4: 7,5 A5: 8,0 A6: 8,5 A7: 9,0 A8: 9,5 A9: 10,0
Tổng số nghiệm thức: 9 nghiệm thức
Tổng số mẫu thí nghiệm: 9 x 3 lần lặp lại = 27 mẫu
Tổng khối lƣợng mẫu thí nghiệm: 27 mẫu x 100 g/mẫu = 2.700 (g)
* Tiến hành thí nghiệm: Nguyên liệu đƣợc thu nhận từ một số địa phƣơng, vận chuyển về phòng thí nghiệm, xử lý sơ bộ (rửa sạch, loại bỏ bùn, đất bám bên ngoài) và phân tích độ ẩm nguyên liệu ban đầu. Tiến hành ly trích enzyme PPO thô theo mục 3.2.2 và đo hoạt tính PPO theo phƣơng pháp mô tả ở mục 3.2.3. Ở mỗi ống nghiệm cho vào lần lƣợt 3,9 mL đệm phosphate 0,1 M có pH thay đổi từ 6 ÷ 10, 1 mL dung dịch catechol nồng độ 0,05 M. Phản ứng enzyme đƣợc bắt đầu bằng việc bổ sung 0,1 mL dịch trích enzyme thô PPO. Hỗn hợp đƣợc nhanh chóng
chuyển vào cuvette và đo quang phổ hấp thu. * Sơ đồ bố trí thí nghiệm Khoai lang trắng Xử lý sơ bộ Trích ly enzyme thô
Thí nghiệm 1: Xác định ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính của enzyme polyphenol oxydase trong khoai lang.
Giá trị pH tối ƣu cho hoạt động của enzyme PPO
Hình 3.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1
* Các chỉ tiêu theo dõi: Độ hấp thu A của PPO tƣơng ứng với từng điều kiện pH khảo sát. Hoạt tính PPO đƣợc xác định dựa trên tính toán tỷ lệ % hoạt tính PPO còn lại ở giá trị pH tối ƣu.
* Kết quả thu nhận: Giá trị pH tối ƣu cho hoạt động của enzyme
3.3.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme polyphenol oxydase trích ly từ khoai lang polyphenol oxydase trích ly từ khoai lang
* Mục đích: Xác định nhiệt độ tối thích của PPO đến hoạt tính enzyme PPO trích ly từ khoai lang trắng.
* Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 3 lần lặp lại.
Nhân tố B: Nhiệt độ (ºC), thí nghiệm đƣợc bố trí ở 7 mức nhiệt độ
B1: 25 B2: 30 B3: 35 B4: 40
B5: 45 B5: 50 B6: 55 Tổng số nghiệm thức: 7 nghiệm thức
Tổng số mẫu thí nghiệm: 7 nghiệm thức x 3 lần lặp lại = 21 mẫu Tổng khối lƣợng mẫu thí nghiệm: 21 mẫu x 100 g/ mẫu = 2.100 g
A2 A3 A…
.
* Tiến hành thí nghiệm: Sau khi xác định đƣợc pH tối ƣu cho hoạt động của enzyme, tiến hành thí nghiệm 2 tƣơng tự thí nghiệm 1, tuy nhiên sử dụng dung dịch đệm có pH thích hợp đã đƣợc xác định ở thí nghiệm 1. Dịch trích enzyme thô sau khi ly tâm đƣợc cho vào các ống nghiệm và xử lý trong bể điều nhiệt ở các mức nhiệt độ khác nhau từ 25 ÷ 55ºC (mẫu xử lý ở 25ºC đƣợc điều chỉnh nhiệt độ bằng nƣớc đá, dao động nhiệt độ tối đa là 1ºC) trong 10 phút trƣớc khi tiến hành phản ứng. Xác định cƣờng độ hấp thu của phản ứng ở bƣớc sóng 410 nm. * Sơ đồ bố trí thí nghiệm Khoai lang trắng Xử lý sơ bộ Trích ly enzyme thô
Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme polyphenol oxydase trong khoai lang.
Giá trị nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động của enzyme PPO
Hình 3.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2
* Các chỉ tiêu theo dõi: Độ hấp thu A của PPO tƣơng ứng với từng điều kiện nhiệt độ khảo sát. Hoạt tính PPO đƣợc xác định dựa trên tính toán tỷ lệ % hoạt tính PPO còn lại ở giá trị nhiệt độ tối ƣu.
* Kết quả thu nhận: Nhiệt độ tƣơng ứng với hoạt tính enzyme cao nhất.
3.3.4 Thí nghiệm 3: Xác định độ bền nhiệt của enzyme PPO thu nhận từ khoai lang trắng khoai lang trắng
* Mục đích: Xác định khả năng chịu nhiệt của enzyme PPO trong các điều kiện xử lý khác nhau.
* Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí với 1 nhân tố
Nhân tố C: Nhiệt độ (ºC), thí nghiệm đƣợc bố trí ở 7 mức nhiệt độ
C1: 4 C2: 30 C3: 40 C4: 50
C5: 60 C6: 70 C7: 80 Tổng số nghiệm thức: 7 nghiệm thức
Tổng số mẫu thí nghiệm: 7 nghiệm thức x 3 lần lặp lại = 21 mẫu B2 B3 B….
Tổng khối lƣợng mẫu thí nghiệm: 21 mẫu x 100 g/ mẫu = 2.100 g * Sơ đồ bố trí thí nghiệm Khoai lang trắng Xử lý sơ bộ Trích ly enzyme thô
Thí nghiệm 3: Xác định độ bền nhiệt của enzyme PPO trong khoai lang.
Hoạt tính enzyme sau quá trình xử lý nhiệt
Hình 3.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3
* Tiến hành thí nghiệm: Tiến hành ly trích enzyme thô, dịch trích sau khi ly tâm đƣợc cho vào các ống nghiệm và xử lý trong bể điều nhiệt ở các mức nhiệt độ khác nhau từ 4 ÷ 55ºC nhƣ đã bố trí (mẫu xử lý ở 4ºC đƣợc điều chỉnh nhiệt độ bằng nƣớc đá, dao động nhiệt độ tối đa là 1ºC) trong 60 phút. Tiến hành cho phản ứng giữa cơ chất-enzyme và xác định cƣờng độ hấp thu ở bƣớc sóng 410 nm.
* Các chỉ tiêu theo dõi: Độ hấp thu A của PPO tƣơng ứng với từng điều kiện nhiệt độ ủ. Hoạt tính PPO đƣợc xác định dựa trên tính toán tỷ lệ % hoạt tính PPO còn lại ở giá trị nhiệt độ tối thích cho hoạt động của PPO đã đƣợc xác định ở thí nghiệm 2.
* Kết quả thu nhận: Độ bền nhiệt của PPO từ khoai lang trắng
3.3.5 Thí nghiệm 4: Thiết lập các th ng số động học và hoạt tính enzyme ban đầu của nguyên liệu khoai lang
* Mục đích: Thiết lập các thông số động học Vmax (vận tốc phản ứng cực đại), Km (hằng số tốc độ phản ứng) của PPO từ khoai lang trắng.
* Tiến hành thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc thực hiện tƣơng tự các thí nghiệm trên (thí nghiệm 1 và 2). Tuy nhiên, catechol đƣợc pha loãng ở các nồng độ khác nhau từ 0,01 đến 0,1 M. Nhiệt độ phản ứng đƣợc lựa chọn từ thí nghiệm 2 và pH tối ƣu đƣợc xác định từ thí nghiệm 1. Ghi nhận giá trị độ hấp thu tƣơng ứng với từng nồng độ catechol khảo sát sau mỗi 15 giây phản ứng ở bƣớc sóng 410 nm (Chikezie, 2006).
* Kết quả thu nhận:
Vận tốc phản ứng V (U, 10-3
OD/giây) tƣơng ứng với sự thay đổi nồng độ catechol. C2 C… C….
Vẽ đồ thị biểu diễn và xác định hệ số góc của đƣờng đo độ hấp thu của PPO theo thời gian. Xác định các thông số động học Km, Vmax, hoạt tính ban đầu của PPO trong khoai lang trắng theo phƣơng pháp Lineweaver – Burk.
3.3.6 Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hƣởng của các phụ gia khác nhau đến hoạt tính của enzyme polyphenol oxydase ở các nồng độ khác nhau hoạt tính của enzyme polyphenol oxydase ở các nồng độ khác nhau
* Mục đích: Nghiên cứu tác động của các chất ức chế đến hoạt tính enzyme PPO ở các nồng độ xử lý khác nhau.
* Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí với 1 nhân tố và 3 lần lặp lại. Nhân tố D: Nồng độ của các phụ gia sử dụng
Nhân tố D1: Nồng độ acid citric (mM) trong dịch ngâm
D1.1: 10 D1.3: 15 D1.2: 20 D1.4: 25 Nhân tố D2: Nồng độ acid ascorbic (mM) trong dịch ngâm
D2.1: 0,2 D2.3: 0,8 D2.2: 0,5 D2.4: 1,0 Nhân tố D3: Nồng độ NaCl (mM) trong dịch ngâm
D3.1: 25 D3.3: 75 D3.2: 50 D3.4: 100 Nhân tố D4: Nồng độ NaHSO3 (mM) trong dịch ngâm
D4.1: 0,1 D4.3: 0,5 D4.2: 0,3 D4.4: 0,7 Và D0: Đối chứng (không xử lý) * Sơ đồ bố trí thí nghiệm Khoai lang trắng Xử lý sơ bộ Trích ly enzyme thô
Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng của các chất ức chế đến hoạt tính của enzyme polyphenol oxydase trong khoai lang.
Khả năng ức chế hoạt động của enzyme PPO bằng các phụ gia riêng lẻ
Hình 3.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 5
D2
D1 D3 D4
D1.2
Tổng số nghiệm thức: 4 x 4 + 1 = 17 nghiệm thức
Tổng số mẫu thí nghiệm: 17 nghiệm thức x 3 lần lặp lại = 51 mẫu Tổng khối lƣợng mẫu thí nghiệm: 51 mẫu x 100 g/ mẫu = 5.100 g
* Tiến hành thí nghiệm: tiến hành thí nghiệm tƣơng tự thí nghiệm 1 và 2. Dịch trích enzyme thô thu đƣợc cho vào các ống nghiệm, thêm các chất phụ gia riêng lẻ ở các nồng độ khác nhau. Tiến hành cho phản ứng giữa cơ chất - enzyme và xác định cƣờng độ hấp thu ở bƣớc sóng 410 nm.
* Các chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ hoạt tính PPO còn lại sau quá trình xử lý, so sánh với mẫu PPO đối chứng (không xử lý).
* Kết quả thu nhận: Xác định tác động của các phụ gia riêng lẻ đến hoạt tính của enzyme PPO.
CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1 GIÁ TRỊ pH TỐI THÍCH CHO HOẠT ĐỘNG CỦA POLYPHENOL OXIDASE TRÍCH LY TỪ KHOAI LANG TRẮNG OXIDASE TRÍCH LY TỪ KHOAI LANG TRẮNG
Giá trị pH là một trong những yếu tố quan trọng có ảnh hƣởng đến hoạt động của enzyme PPO. Nhìn chung, hoạt tính PPO thay đổi ở các điều kiện pH khác nhau. Kết quả phân tích đánh giá sự ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính tƣơng đối của PPO trong khoai lang trắng đƣợc thể hiện ở Hình 4.1.
Hình 4.1: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính tƣơng đối PPO trích ly từ khoai lang
Dựa vào kết quả đƣợc thể hiện ở Hình 4.1 nhận thấy, hoạt tính tƣơng đối PPO trong khoai lang trắng có xu hƣớng tăng từ trong khoảng pH từ 6,0 ÷ 8,0 và đạt giá trị cao nhất ở bằng 8,0 và sau đó giảm chậm dần khi giá trị pH tăng đến 10,0. Hoạt