BAN ĐẦU CỦA POLYPHENOL OXIDASE TRÍCH LY TỪ KHOAI LANG TRẮNG
Sự thay đổi mật độ quang (OD) do phản ứng hoá nâu của PPO trong khoai lang khi catechol (cơ chất) chuyển hoá thành (benzoqiunone). Giá trị mật độ quang (ở bƣớc sóng 410 nm) đo đƣợc theo thời gian, thí nghiệm đƣợc tiến hành để xác định tốc độ phản ứng với các giá trị nồng độ cơ chất V=f([S]). Kết quả phân tích sự thay đổi mật độ quang nhằm xác định hoạt tính ban đầu của PPO trong khoai lang đƣợc thể hiện trong Bảng 4.1. Các thông số động học Km, Vmax đƣợc xác định theo phƣơng pháp Lineweaver – Burk (1934) bằng cách lập đồ thị 1/V = f(1/[S]) (Hình 4.4) dựa trên các giá trị nghịch đảo 1/V và 1/[S] đƣợc thể hiện trong Bảng 4.1.
Để xác định ảnh hƣởng của cơ chất (catechol) tác động vào các hoạt động PPO, hoạt tính của enzyme đƣợc khảo sát có nồng độ cơ chất dao động 0,01 ÷ 0,1 M. Từ đồ thị Hình 4.4 cho thấy, các thông số động học của PPO nhƣ Vmax và Km có thể đƣợc xác định thông qua phƣơng trình đƣờng thẳng y (1/[V]) = 3,6273x (1/[S]) + 132,5 với R2= 0,9791 có độ tin cậy ở mức chấp nhận. Đồ thị xác định các thông số động học Km và Vmax đƣợc thể hiện theo Hình 4.4.
Hình 4.4: M hình ác định các th ng số động học Vmax, Km của PPO trong khoai lang đồ thị Lineweaver-Burk)
Qua kết quả phân tích, các thông số động học của PPO đƣợc xác định với hằng số Km là 27,4.10-3 M và Vmax có giá trị tƣơng ứng là 7,55.10-3 OD/giây = 7,55 đơn vị (U). Đồng thời, giá trị Vmax cũng tìm đƣợc dựa trên định nghĩa đã nêu, hoạt tính PPO tƣơng ứng trong 0,1 mL dịch trích đƣợc tính là:
a = 7,55 (10-3 OD/giây) x (60 giây/1 phút) x 1000/0,1 mL dịch enzyme phản ứng = 4530 U/min/mL.
Với thể tích dịch trích V thu đƣợc là 54,5 mL, tƣơng ứng với khối lƣợng mẫu ban đầu là 25,5 g và độ ẩm trung bình của khoai lang là 64,47% (dựa trên kết quả phân tích thành phần ẩm trong khoai lang trắng). Do đó, hoạt tính PPO thô trong khoai lang ban đầu đạt 256,92 (U/g chất khô của khoai lang, CKNL). Nghiên cứu Manohan và Wai (2012) không xác định tổng lƣợng PPO có trong khoai lang mà chỉ khảo sát hoạt tính PPO trong 0,1 mL thể tích dịch trích, cho thấy giá trị PPO đo đƣợc là 3720 EU/min/mL. Đồng thời giá trị Km của khoai lang ở điều kiện khảo sát là 27,4 mM cao hơn nhiều lần so với giá trị Km theo nghiên cứu của Manohan và Wai (2012) là 3,57 mM. Điều này có thể là do sự khác biệt về điều kiện thổ nhƣỡng, giống khoai lang, cách xử lý nguyên liệu sau thu hoạch và phƣơng pháp trích ly PPO thô. Km đƣợc gọi hằng số Michelis Menten đặc trƣng cho mỗi enzyme, hằng số tốc độ phản ứng cho ái lực của enzyme với cơ chất. Km trong nghiên cứu có giá trị tƣơng đối lớn, vì thế ái lực của enzmye với cơ chất càng nhỏ, vân tốc của phản ứng càng nhỏ. Ngoài ra, hoạt tính của enzyme còn phụ thuộc rất lớn vào các yếu tố nhiệt độ và pH cũng nhƣ tác động của các thành phần đóng vai trò là chất hoạt hóa và ức chế lên hoạt động của khoai lang trắng. Trong nghiên cứu của Gao et al., 2011, giá trị Km từ PPO từ quả đào chua đƣợc tìm thấy là 3,5 mM, sử dụng catechol làm cơ chất. Các giá trị của Km của PPO từ artisô (10,2 mM) (Aydemir, 2004), lá trà (12,5 mM) (Halder et al., 1998), hạt đậu tƣơng (10,5 mM) (Paull và Gowda., 2000), táo (34 mM) (Oktay et al., 1995).
Bảng 4.1: Sự thay đổi mật độ quang trong quá trình ác định hoạt tính của polyphenol oxydase trong khoai lang trắng Thời gian Nồng độ catechol (M) 0,1 0,09 0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 15 0,2933 0,2787 0,2547 0,2700 0,2137 0,1893 0,1907 0,1907 0,1587 0,0877 30 0,2937 0,2777 0,2557 0,2657 0,2187 0,1917 0,1983 0,1983 0,1727 0,0973 45 0,2870 0,2670 0,2503 0,2537 0,2133 0,1857 0,1870 0,1870 0,1593 0,0890 60 0,2810 0,2593 0,2460 0,2453 0,1997 0,1810 0,1790 0,1790 0,1523 0,0877 75 0,2760 0,2520 0,2413 0,2377 0,1943 0,1763 0,1723 0,1723 0,1467 0,0820 90 0,2720 0,2463 0,2380 0,2310 0,1900 0,1717 0,1670 0,1670 0,1397 0,0780 105 0,2687 0,2413 0,2347 0,2397 0,1843 0,1690 0,1620 0,1620 0,1347 0,0757 120 0,2653 0,2367 0,2320 0,2207 0,1790 0,1663 0,1573 0,1573 0,1307 0,0740 V(OD/s) 0,0065 0,0061 0,0056 0,0058 0,0047 0,0042 0,0042 0,0042 0,0035 0,0020 1/V 154,2091 165,0963 177,0168 172,2710 213,0419 239,4646 239,0314 239,0314 282,7675 505,5267 1/[S] 10 11,1111 12,5 14,2857 16,6667 20 25 33,3333 50 100
Mặc dù PPO có giá trị Km khá lớn, ái lực của enzyme với cơ chất nhỏ nhƣng sự hóa nâu do tác động của PPO trong quá trình chế biến các sản phẩm từ khoai lang vẫn là điều cần đƣợc quan tâm, đặc biệt khi nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động của PPO từ khoai lang trắng ở điều kiện nhiệt độ phòng (30C) và độ bền nhiệt của enzyme cao. Chính vì vậy, việc nghiên cứu tìm giải pháp thích hợp nhằm ngăn cản sự hóa nâu của enzyme cần đƣợc quan tâm. Trong đó, việc sử dụng các chất phụ gia đóng vai trò chất ức chế phản ứng hóa nâu do tác động của PPO là một giải pháp.