Xử lý sơ bộ Trích ly enzyme thô
Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme polyphenol oxydase trong khoai lang.
Giá trị nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động của enzyme PPO
Hình 3.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2
* Các chỉ tiêu theo dõi: Độ hấp thu A của PPO tƣơng ứng với từng điều kiện nhiệt độ khảo sát. Hoạt tính PPO đƣợc xác định dựa trên tính toán tỷ lệ % hoạt tính PPO còn lại ở giá trị nhiệt độ tối ƣu.
* Kết quả thu nhận: Nhiệt độ tƣơng ứng với hoạt tính enzyme cao nhất.
3.3.4 Thí nghiệm 3: Xác định độ bền nhiệt của enzyme PPO thu nhận từ khoai lang trắng khoai lang trắng
* Mục đích: Xác định khả năng chịu nhiệt của enzyme PPO trong các điều kiện xử lý khác nhau.
* Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí với 1 nhân tố
Nhân tố C: Nhiệt độ (ºC), thí nghiệm đƣợc bố trí ở 7 mức nhiệt độ
C1: 4 C2: 30 C3: 40 C4: 50
C5: 60 C6: 70 C7: 80 Tổng số nghiệm thức: 7 nghiệm thức
Tổng số mẫu thí nghiệm: 7 nghiệm thức x 3 lần lặp lại = 21 mẫu B2 B3 B….
Tổng khối lƣợng mẫu thí nghiệm: 21 mẫu x 100 g/ mẫu = 2.100 g * Sơ đồ bố trí thí nghiệm Khoai lang trắng Xử lý sơ bộ Trích ly enzyme thô
Thí nghiệm 3: Xác định độ bền nhiệt của enzyme PPO trong khoai lang.
Hoạt tính enzyme sau quá trình xử lý nhiệt
Hình 3.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3
* Tiến hành thí nghiệm: Tiến hành ly trích enzyme thô, dịch trích sau khi ly tâm đƣợc cho vào các ống nghiệm và xử lý trong bể điều nhiệt ở các mức nhiệt độ khác nhau từ 4 ÷ 55ºC nhƣ đã bố trí (mẫu xử lý ở 4ºC đƣợc điều chỉnh nhiệt độ bằng nƣớc đá, dao động nhiệt độ tối đa là 1ºC) trong 60 phút. Tiến hành cho phản ứng giữa cơ chất-enzyme và xác định cƣờng độ hấp thu ở bƣớc sóng 410 nm.
* Các chỉ tiêu theo dõi: Độ hấp thu A của PPO tƣơng ứng với từng điều kiện nhiệt độ ủ. Hoạt tính PPO đƣợc xác định dựa trên tính toán tỷ lệ % hoạt tính PPO còn lại ở giá trị nhiệt độ tối thích cho hoạt động của PPO đã đƣợc xác định ở thí nghiệm 2.
* Kết quả thu nhận: Độ bền nhiệt của PPO từ khoai lang trắng
3.3.5 Thí nghiệm 4: Thiết lập các th ng số động học và hoạt tính enzyme ban đầu của nguyên liệu khoai lang
* Mục đích: Thiết lập các thông số động học Vmax (vận tốc phản ứng cực đại), Km (hằng số tốc độ phản ứng) của PPO từ khoai lang trắng.
* Tiến hành thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc thực hiện tƣơng tự các thí nghiệm trên (thí nghiệm 1 và 2). Tuy nhiên, catechol đƣợc pha loãng ở các nồng độ khác nhau từ 0,01 đến 0,1 M. Nhiệt độ phản ứng đƣợc lựa chọn từ thí nghiệm 2 và pH tối ƣu đƣợc xác định từ thí nghiệm 1. Ghi nhận giá trị độ hấp thu tƣơng ứng với từng nồng độ catechol khảo sát sau mỗi 15 giây phản ứng ở bƣớc sóng 410 nm (Chikezie, 2006).
* Kết quả thu nhận:
Vận tốc phản ứng V (U, 10-3
OD/giây) tƣơng ứng với sự thay đổi nồng độ catechol. C2 C… C….
Vẽ đồ thị biểu diễn và xác định hệ số góc của đƣờng đo độ hấp thu của PPO theo thời gian. Xác định các thông số động học Km, Vmax, hoạt tính ban đầu của PPO trong khoai lang trắng theo phƣơng pháp Lineweaver – Burk.
3.3.6 Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hƣởng của các phụ gia khác nhau đến hoạt tính của enzyme polyphenol oxydase ở các nồng độ khác nhau hoạt tính của enzyme polyphenol oxydase ở các nồng độ khác nhau
* Mục đích: Nghiên cứu tác động của các chất ức chế đến hoạt tính enzyme PPO ở các nồng độ xử lý khác nhau.
* Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí với 1 nhân tố và 3 lần lặp lại. Nhân tố D: Nồng độ của các phụ gia sử dụng
Nhân tố D1: Nồng độ acid citric (mM) trong dịch ngâm
D1.1: 10 D1.3: 15 D1.2: 20 D1.4: 25 Nhân tố D2: Nồng độ acid ascorbic (mM) trong dịch ngâm
D2.1: 0,2 D2.3: 0,8 D2.2: 0,5 D2.4: 1,0 Nhân tố D3: Nồng độ NaCl (mM) trong dịch ngâm
D3.1: 25 D3.3: 75 D3.2: 50 D3.4: 100 Nhân tố D4: Nồng độ NaHSO3 (mM) trong dịch ngâm
D4.1: 0,1 D4.3: 0,5 D4.2: 0,3 D4.4: 0,7 Và D0: Đối chứng (không xử lý) * Sơ đồ bố trí thí nghiệm Khoai lang trắng Xử lý sơ bộ Trích ly enzyme thô
Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng của các chất ức chế đến hoạt tính của enzyme polyphenol oxydase trong khoai lang.
Khả năng ức chế hoạt động của enzyme PPO bằng các phụ gia riêng lẻ
Hình 3.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 5
D2
D1 D3 D4
D1.2
Tổng số nghiệm thức: 4 x 4 + 1 = 17 nghiệm thức
Tổng số mẫu thí nghiệm: 17 nghiệm thức x 3 lần lặp lại = 51 mẫu Tổng khối lƣợng mẫu thí nghiệm: 51 mẫu x 100 g/ mẫu = 5.100 g
* Tiến hành thí nghiệm: tiến hành thí nghiệm tƣơng tự thí nghiệm 1 và 2. Dịch trích enzyme thô thu đƣợc cho vào các ống nghiệm, thêm các chất phụ gia riêng lẻ ở các nồng độ khác nhau. Tiến hành cho phản ứng giữa cơ chất - enzyme và xác định cƣờng độ hấp thu ở bƣớc sóng 410 nm.
* Các chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ hoạt tính PPO còn lại sau quá trình xử lý, so sánh với mẫu PPO đối chứng (không xử lý).
* Kết quả thu nhận: Xác định tác động của các phụ gia riêng lẻ đến hoạt tính của enzyme PPO.
CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1 GIÁ TRỊ pH TỐI THÍCH CHO HOẠT ĐỘNG CỦA POLYPHENOL OXIDASE TRÍCH LY TỪ KHOAI LANG TRẮNG OXIDASE TRÍCH LY TỪ KHOAI LANG TRẮNG
Giá trị pH là một trong những yếu tố quan trọng có ảnh hƣởng đến hoạt động của enzyme PPO. Nhìn chung, hoạt tính PPO thay đổi ở các điều kiện pH khác nhau. Kết quả phân tích đánh giá sự ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính tƣơng đối của PPO trong khoai lang trắng đƣợc thể hiện ở Hình 4.1.
Hình 4.1: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính tƣơng đối PPO trích ly từ khoai lang
Dựa vào kết quả đƣợc thể hiện ở Hình 4.1 nhận thấy, hoạt tính tƣơng đối PPO trong khoai lang trắng có xu hƣớng tăng từ trong khoảng pH từ 6,0 ÷ 8,0 và đạt giá trị cao nhất ở bằng 8,0 và sau đó giảm chậm dần khi giá trị pH tăng đến 10,0. Hoạt tính tƣơng đối đạt giá trị thấp nhất ở pH bằng 6,0 trong các khoảng pH khảo sát. Ở các giá trị pH kiềm hoạt tính enzyme đạt trên 80% so với pH tối ƣu. Giá trị pH môi trƣờng làm thay đổi trạng thái ion hóa của các acid amin có tính acid hoặc trạng thái hoạt động cơ bản của enzyme. Điều này dẫn đến sự thay đổi cấu trúc bề mặt của enzyme, ngoài ra, sự thay đổi giá trị pH không chỉ ảnh hƣởng đến khả năng hòa tan enzyme trong dung dịch đệm mà còn ảnh hƣởng đến sự phân bố của enzyme, các hợp chất phenolic và các sản phẩm sau quá trình phản ứng (Serradell
et al., 2000; Cano et al., 1996).
Enzyme rất nhạy với pH của môi trƣờng, do đó pH có tác động rất quan trọng đối với tốc độ phản ứng của enzyme. Mỗi enzyme đều có một số giá trị pH thích hợp cho sự hoạt động và tại đó tốc độ phản ứng xảy ra nhanh nhất. Ngoài trị số pH tối
thích, hoạt tính của enzyme giảm dần. Giá trị pH môi trƣờng làm thay đổi trạng thái ion hóa của phân tử enzyme, nhất là trung tâm hoạt động, các nhóm chức và cơ chất (Serradell et al., 2000). Ngoài ra, pH còn ảnh hƣởng đến sự kết hợp giữa phần protein và phần phụ không phải protein (coenzyme) của enzyme, vì thế làm giảm hoạt tính enzyme tại những giá trị pH nằm ngoài khoảng giá trị pH tối thích (Lê Ngọc Tú và cộng sự, 2005).
Kết quả thu đƣợc phù hợp với các khảo sát trƣớc đó về pH tối ƣu cho hoạt động của PPO. Hoạt tính PPO trong các loài thực vật thƣờng đạt cao nhất ở giá trị pH từ 5,0 ÷ 8,0, các giá trị này nằm trong khoảng trung tính (Aetrosian et al., 1960, Cash
et al., 1976, Chan et al., 1971). Tuy nhiên, enyme có giá trị pH cao hoặc thấp hơn ở một số loài nhƣ dâu tây (pH = 4,5) (Oktay et al., 1995) hoặc táo (pH = 9,0) (Wesche-EAling và Montgomery, 1990). Những nghiên cứu liên quan đến PPO thu đƣợc từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau: nho là 6,0 (Lee et al., 1983), trong ổi là 7,0 (Ausin et al., 1995), trong khoai tây là 6,8 (Kiattisak et al., 1999) giá trị pH tối ƣu của PPO khi sử dụng catechol nhƣ chất nền ở các nguồn nguyên liệu khác. Bên cạnh đó, cơ chất dùng cho phản ứng và phƣơng pháp trích ly cũng ảnh hƣởng đến hoạt tính PPO. Theo Alyward và Haisman (1969), pH tối thích cho hoạt động của PPO trong thực vật trong dãy từ 5,0 đến 7,0 và phụ thuộc vào mức độ tinh sạch enzyme, loại đệm sử dụng và cơ chất đƣợc sử dụng trong nghiên cứu.
Dựa trên kết quả khảo sát, pH thích hợp cho hoạt động của PPO đƣợc trích ly từ khoai lang trắng đƣợc lựa chọn là 8,0. Sử dụng giá trị pH này để tiến hành xác định các tính chất khác của PPO.
4.2 ẢNH HƢỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ ĐẾN HOẠT TÍNH PPO TRÍCH LY TỪ
KHOAI LANG TRẮNG
Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hƣởng lớn đến hoạt tính xúc tác enzyme. Khi tăng nhiệt độ, tốc độ phản ứng giữa enzyme và cơ chất tăng theo quy luật Vant- Hoff. Tuy nhiên khi tăng đến một mức độ nhất định, hoạt tính enzyme bắt đầu giảm do sự biến tính của enzyme. Nhiệt độ thích hợp của mỗi enzyme không nhất định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác, thời gian tác dụng càng dài thì nhiệt độ thích hợp càng thấp (Martinez, 1995). Nồng độ enzyme và cơ chất hoặc dạng tồn tại của enzyme cũng làm thay đổi đến nhiệt độ hoạt động thích hợp của enzyme. Kết quả ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme polyphenol oxydase đƣợc trình bày ở Hình 4.2.
Hình 4.2: Đồ thị biểu diễn sự ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính tƣơng đối PPO từ dịch trích khoai lang trắng
Từ kết quả ở Hình 4.2 cho thấy, enzyme PPO hoạt động mạnh ở các khoảng nhiệt độ từ 30 ÷ 35ºC và đạt giá trị cao nhất ở 30ºC và giảm ở các giá trị nhiệt độ khảo sát còn lại. Hoạt tính PPO giảm khi gia tăng nhiệt độ lớn hơn 35ºC, phần trăm hoạt tính còn lại nằm trong khoảng từ 75,27 ÷ 79,06%. Nhiệt độ môi trƣờng phản ứng tăng, không chỉ làm tăng tốc độ phản ứng mà còn thúc đẩy quá trình biến tính protein, các phân tử đóng vai trò trung tâm hoạt động PPO bị phá vỡ bởi nhiệt. Vì vậy, enzyme biến đổi tính chất và mất đi vai trò xúc tác quá trình chuyển hóa o- diphenol thành o-quinone (Alyward et al., 1969). Ở nhiệt độ thấp hơn (25ºC), các thành phần cấu tạo PPO có ít năng lƣợng để di chuyển so với các nhiệt độ khảo sát khác do đó tốc độ phản ứng chậm hơn, hoạt tính của enzyme PPO chỉ đạt 67,97%. Kết quả khảo sát trùng hợp với nghiên cứu của Deepaa Manohan và Wong Chen Wai (2012) khi xác định nhiệt độ thích hợp trên khoai lang cũng là 30ºC.
Nhiệt độ tối ƣu của PPO trên một số loại thực vật khác cũng đƣợc nghiên cứu, kết quả nghiên cứu cho thấy, phần lớn các enzyme PPO trích ly có nhiệt độ tối ƣu trong khoảng 30°C đến 40°C (Matheis and Whitaker, 1987; Yang., 2001). Nghiên cứu gần đây của Lim (2011) nhiệt độ tối ƣu cho enzyme PPO trên lá khoai lang là 45°C. Nhiệt độ tối ƣu PPO ở các loại củ khác nhau nhƣ sắn (Aarthet et al., 1997), khoai môn (Kiattisak et al., 1999) và khoai lang (Shuji Fujita et al., 2006) có nhiệt độ tối ƣu là 30°C, PPO từ một số loại quả, điển hình nhƣ táo (Zhao et al., 2005), chuối (Yang et al., 2001) và xoài (RoAinson et al., 1981) có nhiệt độ tối ƣu cũng đƣợc xác định ở 30°C. Khác hơn củ và một số quả, PPO từ hạt ca cao (Lee et al., 1991) và hƣớng dƣơng (Wlazly et al., 2000) đạt giá trị tối ƣu ở 45°C ở các điều kiện khảo sát. Điều này cho thấy, hoạt tính enzyme PPO còn phụ thuộc vào nguồn
gốc, giống, điều kiện canh tác và nhiệt độ môi trƣờng sống (Hasegawa et al.,1980). Kết quả khảo sát cho thấy, với nhiệt độ tối thích 30°C gần nhƣ cân bằng với nhiệt độ môi trƣờng bên ngoài ở Việt Nam, đồng thời khi xử lý nhiệt đến 55°C, hoạt tính của PPO từ khoai lang trắng vẫn duy trì ở mức cao (gần 80% hoạt tính PPO vẫn đƣợc duy trì). Điều này cho thấy, khoai lang trắng chính là đối tƣợng cho hoạt động hóa nâu do tác động của PPO. Một trong những vấn đề cần đƣợc quan tâm tiếp theo là khả năng chịu nhiệt của enzyme này, từ đó việc thiết lập phƣơng thức xử lý chống hóa nâu enzyme.
4.3 XÁC ĐỊNH ĐỘ BỀN NHIỆT CỦA POLYPHENOL OXYDASE THU NHẬN TỪ KHOAI LANG TRẮNG NHẬN TỪ KHOAI LANG TRẮNG
Tiến hành đánh giá độ bền nhiệt của PPO từ khoai lang trắng bằng cách ủ mẫu ở nhiệt độ khác nhau trong thời gian 1 giờ. Sự thay đổi hoạt tính của PPO khi so sánh với hoạt tính PPO ở nhiệt độ tối ƣu (trƣờng hợp khảo sát là 30C) đƣợc thể hiện ở Hình 4.3.
Hình 4.3: Độ bền nhiệt của PPO sau quá trình xử lý nhiệt
Qua kết quả ở Hình 4.3 nhận thấy, hoạt tính của PPO trong dịch trích enzyme từ khoai lang trắng giảm khi nhiệt độ tăng từ 30ºC đến 80ºC trong thời gian xử lý là 1 giờ. Khi tăng nhiệt độ đến 80ºC, hoạt tính PPO còn lại 21,86% so với khi xử lý ở nhiệt độ phòng. Đặc biệt, điều kiện nhiệt độ thấp (4C) là điều kiện thích hợp giúp duy trì hoạt động của PPO, hoạt tính PPO trong dịch trích đƣợc trữ ở 4C trong 1 giờ cao hơn (103,31%) cả ở chế độ nhiệt tối ƣu cho hoạt động của PPO (30C). Kết quả khảo sát trên cũng xác định rằng enzyme PPO trong khoai lang trắng là tƣơng đối bền với nhiệt. Enzyme polyphenol oxydase hoạt động phụ thuộc vào nhiệt độ và cơ chất đƣợc sử dụng. Ở nhiệt độ cao hơn 60ºC, enzyme bắt đầu biến
tính và bị vô hoạt khi nâng đến nhiệt độ cao hơn. Theo nghiên cứu của Stauffer (1989), sự biến tính là do tác động nhiệt, sự biến tính không thuận nghịch làm thay đổi cấu trúc protein trong đại phân tử enzyme sẽ không còn chức năng và không thể hoạt động lại. Kết quả của các nghiên cứu khả năng bền nhiệt cho thấy PPO thuộc nhóm enzyme bền với nhiệt. Ở các nguồn nguyên liệu khác nhau, độ bền nhiệt của PPO là khác nhau, sự tiếp xúc nhiệt trong thời gian ngắn ở nhiệt độ cao hơn 90°C có thể đủ để vô hoạt một phần hay toàn bộ hoạt tính của enzyme. Quá trình xử lý còn phụ thuộc vào sự ổn định của nhiệt độ, độ tuổi của nguyên liệu, một số trƣờng hợp còn phụ thuộc vào pH nguyên liệu (Lee et al,. 1983, Austin et al., 1995).
Thời gian và nhiệt độ xử lý cần thiết cho quá trình khảo sát độ bền của các enzyme trong các nguồn nguyên liệu là khác nhau. Trong một vài nghiên cứu về sự ổn định nhiệt cho thấy, ở quả nho hoạt tính PPO giảm 50% ở 65°C xử lý trong 20 phút và ngừng hoạt động hoàn toàn ở 75°C sau 15 phút (Valero et al., 1998). Ở 60°C, hoạt tính PPO trong táo hoàn toàn bị vô hoạt sau 30 phút (Zhao et al., 2005). PPO trong vỏ xoài tƣơng đối bền với nhiệt, xử lý ở 80°C sau 15 phút thì hoạt tính giảm 50% (RoAinson et al., 1992). Ngoài ra, theo nghiên cứu của Lourenco et al., trong khi làm việc trên PPO từ nhiều giống khoai lang, đƣợc tìm thấy rằng đƣờng và muối trong nguyên liệu có chức năng bảo vệ các enzyme chống lại sự biến tính nhiệt (Kim et al., 2001).
4.4 XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ ĐỘNG HỌC Km, Vmax VÀ HOẠT TÍNH BAN ĐẦU CỦA POLYPHENOL OXIDASE TRÍCH LY TỪ KHOAI BAN ĐẦU CỦA POLYPHENOL OXIDASE TRÍCH LY TỪ KHOAI LANG TRẮNG
Sự thay đổi mật độ quang (OD) do phản ứng hoá nâu của PPO trong khoai lang khi catechol (cơ chất) chuyển hoá thành (benzoqiunone). Giá trị mật độ quang (ở bƣớc sóng 410 nm) đo đƣợc theo thời gian, thí nghiệm đƣợc tiến hành để xác định tốc độ phản ứng với các giá trị nồng độ cơ chất V=f([S]). Kết quả phân tích sự thay đổi