Nhân giống in vitro cây khoai lang trên thế giới ựã có nhiều tác giả nghiên cứu thành công trong ựó nổi bật là các nghiên cứu:
Yamaguchi và cs. (1974) lần ựầu tiên nghiên cứu về nhân tổ hợp in vitro
khoai lang từ mô sẹo. Kết quả cho thấy sự hình thành mô sẹo từ rễ củ trên môi trường White có bổ sung 1 mg/l NAA và tái sinh chồi trên môi trường MS có bổ sung 1 mg/l ABA, 0,02 mg/l kinetin và 0,04 mg/l 2,4-D;
Nhân giống in vitro giống khoai lang từ mô sẹo là nghiên cứu sớm nhất của cây khoai lang do Yamaguchi và cs. công bố vào năm 1974. Kết quả cho thấy sự hình thành mô sẹo từ rễ củ khoai lang trên môi trường White có bổ sung 1 mg/l α-NAA và tái sinh chồi trên môi trường MS có bổ sung 1 mg/l
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 20
ABA, 0,02 mg/l KIN và 0,04 mg/l 2,4-D. Năm 1984, sự tái sinh chồi qua mô sẹo từ lá, ựỉnh chồi, thân và rễ cũng thực hiện bởi Liu và Cantiliffe trên môi trường MS có bổ sung 0,5 ựến 2 mg/l 2,4-D.
Năm 1975, Alconero và cs. ựã kết hợp phương pháp nuôi cấy ựỉnh sinh trưởng và xử lý nhiệt ựể loại trừ virus cây khoai lang. đỉnh sinh trưởng có kắch thước từ 0,4 - 0,8 mm ựược cấy trên môi trường MS, bổ sung kinetin và auxin (NAA, IAA). Sau thời gian 20 - 50 ngày, ựỉnh sinh trưởng hình thành mô sẹo. Trong số cây con ựược kiểm tra virus thì có 47% không nhiễm bệnh;
Năm 1983, Hwang và cs. công bố tái sinh chồi khoai lang invitro từ các ựoạn rễ có kắch thước 2-3cm trên môi trường MS có bổ sung 100 mg/l meo- inositol, 2 mg/l BA, 0,1 mg/l NAA, 30 mg/l ựường và 10 g/l agar từ các nốt rễ tạo mô sẹo và các vùng giống như mô phân sinh ựể phát triển tiếp thành chồi;
Hwang và cs. (1983) nghiên cứu tái sinh chồi khoai lang in vitro từ các ựoạn rễ có kắch thước 2 Ờ 3 cm ựược nuôi cấy lên môi trường MS biến ựổi có bổ sung nồng ựộ muối khoáng cao, 100 mg/l meo-inositol, 2 mg/l BA, 0,1 mg/l NAA, 30 mg/l ựường và 10 g/l agar;
Các nghiên cứu của Anura Hettiarachchi và Sri Lanka (1988), Castro và Andrate (1995) trên các giống khoai lang khác nhau: Kết quả ựều không thấy sự khác biệt giữa các giống;
Anura Hettiarachchi và Sri Lanka (1988), sử dụng môi trường MS bổ sung auxin 2,4-D, cytokinin: KIN và BAP, GA3 với nồng ựộ 0,1 mg/l ựể nuôi cấy ựỉnh sinh trưởng cây khoai lang. Kết quả thắ nghiệm cho thấy 2,4-D tối ưu ở nồng ựộ1,0 mg/l và BAP 0,25 mg/l tạo cây con tốt hơn. Trường hợp 2,4-D và KIN ở nồng ựộ cao hơn tương ứng 2,5 mg/l và 1,5 mg/l sẽ tạo ra mô sẹo;
Mười năm sau, Berlamino (1993) thực hiện lại quá trình tái sinh chồi từ các nốt rễ khoai lang invitro trên giống Benniazuma thông qua nuôi cấy trên môi trường MS + 0,5 mg/l + 2,4-D + 0,1 mg/l BA và thu tần số tái sinh là 60% với 9 chồi/rễ;
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 21
Kết quả nghiên cứu nuôi cấy ựỉnh sinh trưởng của Castro và Andrate (1995) ựã chỉ ra trên môi trường MS bổ sung 0,005 mg/l NAA, 0,5 mg/l BA và 0,25 mg/l GA3 cho kết quả tốt;
Desai và cs., (1995), công bố sự tái sinh khoai lang qua cuống lá ựược thực hiện thành công trên 27 giống. Giai ựoạn ựầu, các lá cấy lên môi trường MS có bổ sung 0,1 mg/l 2,4 Ờ D và 0,2 mg/l zeatin cho tới khi cuống lá bắt ựầu phình lên (2 Ờ 4 ngày). Giai ựoạn thứ hai, cấy chuyển chúng sang môi trường MS có bổ sung 0,8 mg/l zeatin và ựạt tần số tái sinh chồi cao;
Một tần số tái sinh cây cao ựược thiết lập từ các mô sẹo có nguồn gốc từ các mảnh lá khoai lang in vitro nuôi cấy trên môi trường LS có bổ sung 0,5 mg/l 2,4 Ờ D, 3g/l dịch chiết nấm men, 50 g/l ựường và chuyển sang môi trường thứ hai gồm khoáng LS có bổ sung 2 mg/l ABA hoặc 2 mg/l AgNO3 ựể tái sinh thành cây khoai lang hoàn chỉnh (Otani và cs., 1996);
Một quy trình tái sinh cây trực tiếp gồm 2 giai ựoạn cũng ựược công bố bởi Prakash và cs. (1996). Các mô cuống lá trong môi trường MS có bổ sung 2,4 Ờ D trong giai ựoạn ựầu tiên và TDZ trong giai ựoạn thứ hai. Công bố này cho thấy khả năng tái sinh cây phụ thuộc vào kiểu di truyền, giai ựoạn phát triển và hướng ựặt mô cuống lá trên môi trường nuôi cấy;
Năm 1997, Liu và cs. ựã thiết lập thành công một hệ thống hiệu quả qua nuôi cấy dịch huyền phù tế bào có khả năng phát sinh phôi và tái sinh thành cây khoai lang bằng cách sử dụng 2,4ỜD và ABA. Cũng trong năm 1997, Sihachakr nghiên cứu thành công hệ thống tái sinh cây khoai lang qua con ựường phát sinh phôi. Các nhân tố ảnh hưởng ựến việc tạo mô sẹo và hình thành chồi cũng ựược thực hiện. Công bố này ựã cung cấp một loại môi trường cải biên trong nghiên cứu tái sinh khoai lang, môi trường SPM (Standard Sweet Potato Medium). SPM là môi trường MS có bổ sung vitamin Dtaba 100mg/l; myo Ờ inositol 50mg/l và 30g/l ựường. Kết quả cho thấy trên môi trường SPM có bổ sung tổ hợp của 0,5 mg/l kinetin và 0,1 mg/l 2,4 Ờ D mô sẽ tái tạo chồi;
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22
Alex (2007), Nghiên cứu tối ưu hóa ựiều kiện phát triển khoai lang trong nhân giống in vitro truyền thống tác giả sử dụng ựốt thân khoai lang sạch virus ựược nuôi cấy trong môi trường MS bổ sung 0,5mg/l IAA, NAA, GA3 trong một tuần sau ựó cấy sang môi trường MS bổ sung 20-60g sucrose bổ sung 0,1mg/l BA;
Nguyễn Thị Hoài An (2011) sử dụng các ựốt thân khoai lang HL518 sạch virus tác giả khảo sát sự ảnh hưởng của môi trường MS, MS1/2, MS1/8, Whaite, Went và B5 ựể ựánh giá sự ảnh hưởng của các môi trường khoáng khác nhau lên sự sinh trưởng phát triển của cây khoai lang HL518 in ivitro. Kết quả cho thấy chồi khoai lang HL518 sinh trưởng phát triển tốt ở ba loại môi trường MS, MS1/2 và B5 trong ựó môi trường MS là tốt nhất;
Năm 2010, Iftekhar Alam và cs., nghiên cứu ảnh hưởng của các chất ựiều tiết sinh trưởng ựến nhân nhanh in vitro cây khoai lang từ ựỉnh sinh trưởng. Tác giả cho biết khử trùng bằng HgCl2 0,1% + 2 giọt tween trong 6 phút sau ựó rửa sạch bằng nước cất vô trùng 4-5 lần. Họ khảo sát nồng ựộ Kinetin và GA3 riêng rẽ và kết hợp với các ngưỡng khác nhau trên nền môi trường MS bổ sung 3% sucrose, 0,8% agar pH = 5,7. Nhiệt ựộ nuôi cấy 250C, 16/8h sáng/tối ánh sáng ựèn huỳnh quang. Kết quả cho thấy 2,0mg/l Kinetin + 0,5mg/l GA3 trong môi trường lỏng cho hiệu quả tối ưu trong bật chồi từ ựỉnh sinh trưởng và nhân trong môi trường kéo dài MS + 3% sucrose + 0,8% agar + 2,5mg/l Kinetin + 0,5mg/l GA3, pH = 5,7 cho sự tăng trưởng thắch hợp của chồi khoai lang sau 3-4 tuần. Kết quả khảo sát nồng ựộ Kinetin và NAA cho thấy môi trường thắch hợp cho việc ra rễ của cây khoai lang là MS + 3% sucrose + 0,8% agar + 3,0mg/l Kinetin + 0,5mg/l NAA. Trong kết luận tác giả cho biết mô phân sinh ựỉnh ựược tái sinh tốt nhất trong môi trường lỏng có bổ sung 2,0mg/l Kinetin + 0,5mg/l GA3;
Nguyễn Ngọc Khuê, Nguyễn đình San, (2012). Tác giả sử dụng ựỉnh sinh trưởng và các ựoạn thân mang chồi nách của cây khoai lang tắm Nhật Beniazuma làm vật liệu với môi trường nền là: MS + Saccarose 3% + Agar 0,8% + 1 mg/l GA3. Khảo sát khử trùng bằng hóa chất H2O2 10% và HgCl2
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23
0,1% cho kết quả tối ưu bởi HgCl2 0,1% trong 10 phút. Khi khảo sát chất ựiều tiết sinh trưởng GA3 và nước dừa cho giai ựoạn tái sinh chồi tác giả công bố hàm lượng tối ưu ở nồng ựộ 1,mg/l GA3 kết hợp với 150% nước dừa. Trong giai ựoạn nhân nhanh tác giả khảo sát sự ảnh hưởng của Kinetin tác giả cho biết sử dụng nồng ựộ 6mg/l là tốt nhất cho chiều cao chồi lên tới 7,55cm chứa 9,06 mắt ngủ và hệ số nhân chồi lên tới 5,18 lần. Sử dụng IAA tác giả ựã thu ựược nồng ựộ tối ưu là 1,0mg/l cho hệ số nhân chồi 4,7 lần và chiều cao chồi ựạt 4,44cm chứa 6,72 mắt ngủ. Khi so sánh hai chất ựiều tiết sinh trưởng này tác giả ựã ựưa ra kết luận môi trường nhân nhanh cây khoai lang in vitro MS + Saccarose 3% + Agar 0,8% + 1 mg/l GA3 + 6 mg/l Kinetine. Trong khi tác giả không ựánh giá sự ảnh hưởng ựồng thời của GA3 và Kinetin. Giai ựoạn tạo rễ tác giả khảo sát sự ảnh hưởng của α Ờ NAA và tổ hợp α Ờ NAA + than hoạt tắnh tới khả năng ra rễ của chồi khoai lang ựược công bố môi trường thắch hợp cho sự ra rễ của cây khoai lang là: MS + Saccarose 3% + Agar 0,8% + 10% nước dừa + 0,5 mg/l α Ờ NAA + 1,0 g/l than hoạt tắnh. Khảo sát sự thắch nghi của cây khoai lang ex vitro tác giả sử dụng ba loại giá thể là cát, ựất thịt và cát + ựất thịt với tỉ lệ 1:1. Kết quả ựược công bố cây khoai lang ex vitro
thắch hợp với ựất thịt ựạt tỷ lệ sống tới 95% ựạt chiều cao 7,93cm sau 4 tuần; Phạm Văn Linh và cs., (2014), tác giả nuôi cấy ựỉnh sinh trưởng của 6 giống khoai lang KCL266, KTB2, Chiêm dâu, KL5, KB1 và Hoàng Long. Cụ thể, sử dụng củ ựạt chất lượng ựúng giống gốc ban ựầu ươm trồng trong chậu cát vô trùng cho tới khi cây ựạt 15-20cm thì cắt ngọn 4-5cm, rửa bằng nước xà phòng loãng lắc nhẹ 15-20 phút, rửa sạch dưới vòi nước chảy. Khử trùng bằng cồn 700 trong 60 giây, lắc nhẹ sau ựó rửa sạch bằng nước cất vô trùng 2-3 lần. Khử trùng bằng dung dịch Ca(Ocl)2 10% và HgCl2 0,1% với các khoảng thời gian khác nhau sau ựó rửa lại bằng nước cất vô trùng 2-3 lần, mẫu ựược cấy trên môi trường MS nuôi dưỡng trong ựiều kiện chiếu sáng 16h/ngày, cường ựộ 3000lux, nhiệt ựộ 25-280C theo dõi kết quả sau 4-7 tuần. Kết quả thu ựược như sau: Khử trùng bằng HgCl2 0,1% ở ba mức thời gian 6-8 phút, 8-10 phút và 10- 12 phút cho tỉ lệ sống cao nhất ở mức thời gian 8-10 phút với cả 6 giống ựạt tỷ lệ
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24
mẫu sống từ 20-30% tùy giống. Khử trùng bằng Ca(OCl)2 10% ở ba mức thời gian 10 phút, 15 phút và 20 phút cho tỷ lệ mẫu sống ở các giống với các khoảng thời gian là khác nhau nhưng tỷ lệ mẫu sống cao nhất chỉ ựạt 20%. Khi tiến hành khảo sát môi trường thắch hợp ựối với nhân nhanh các giống khoai lang tác giả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ựộ BAP, Kinetin, IAA và GA3 trên môi trường nền là MS + 20% ND + 30g saccarozo + 8-9g agar kết quả cho thấy, môi trường nhân nhanh thắch hợp ựối với 6 giống khoai lang là khác nhau. Giống KTB2 và KL5 ựều thắch hợp với chất kắch thắch sinh trưởng GA3 (1ppm) kết hợp với IAA (2ppm); giống Hoàng Long thắch hợp với chất kắch thắch sinh trưởng GA3 (1ppm) kết hợp với IAA (0,5ppm); giống KLC266 thắch hợp với chất kắch thắch sinh trưởng Kinetin (1,5ppm) kết hợp với IAA (1ppm); giống Chiêm dâu thắch hợp với chất kắch thắch sinh trưởng Kinetin (1ppm) kết hợp với IAA (0,5ppm) và giống KB1 thắch hợp với chất kắch thắch sinh trưởng GA3 (1ppm) kết hợp với IAA (2ppm);
Tuy nhiên hầu hết các báo cáo khác nhau về nuôi cấy từ mô phân sinh khoai lang sử dụng NAA, IAA, BAP và 2,4D cho nuôi cấy ựỉnh sinh trưởng. (Hettiarachchi, 1988; Garrido vaf Casares, 1989; Dagnino và cs., 1991);
Sự phát triển của cây khoai lang in vitro ựược cải thiện dưới các ựiều kiện vi nhân giống quang tự dưỡng (Kozai và ctv, 1993);
Năm 1996, Kozai, T .; Kitaya, Y .; Kubota, C .; Kobayashi, R .; Watanabe, S., công bố công trình tối ưu hóa các ựiều kiện vi nhân tổ hợp quang tự dưỡng cho khoai lang Beniazuma;
Năm 1999, Heo và Kozai công bố quy trình nuôi cấy quang tự dưỡng trên cây khoai lang và khoai tây;
S. M. A. Zobyed, F Afreen, C. Kubota and T. Kozai, (2000) nuôi cấy khoai lang bằng phương pháp quang tự dưỡng có ựiều chỉnh thoáng gió cho kết quả sau 21 ngày nuôi cấy cây con sinh trưởng tốt hơn nuôi cấy truyền thống 1,2 lần. Số lượng lá trung bình là 5,7 lá/cây. Chiều cao cây cũng có sự sai khác lớn tăng trưởng gần gấp 2 lần. Sau khi chuyển cây con từ phòng thắ nghiệm sang nhà lưới ựể thắch nghi thì tỉ lệ sống của cây nuôi cấy thoáng khắ
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25
gần như ựạt 100% trong khi nuôi cấy truyền thống chỉ ựạt khoảng 67%. Lá cây nuôi cấy thoáng khi khi huấn luyện ra nhà lưới không bị héo và cây con sinh trưởng phát triển nhanh hơn nhiều so với cây con nuôi cấy truyền thống;
Hiện nay, cây khoai lang chưa ựược nghiên cứu nhiều ở nước ta. đặc biệt là nghiên cứu tái sinh in vitro thoáng khắ, tuy nhiên vẫn có một số tác giả nghiên cứu:
Năm 2003, Nguyễn Thị Quỳnh, Nguyễn Thị Thảo, Trần Sỹ Tuệ, Nguyễn Thị Hằng. Ứng dụng phương pháp nuôi cấy quang tự dưỡng trong nhân tổ hợp
in vitro một số cây nhiệt ựới: tre tầm vong, lõi thọ, khoai mỡ và khoai lang. Tác giả cho biết, chất lượng và sự thắch nghi của các tổ hợp tăng ựáng kể;
Nguyễn Mỹ Uyên và cs., (2006) khảo sát sự tăng trưởng in vitro cây khoai lang Ipomoea batatas L. trong ựiều kiện chiếu sáng tự nhiên. Tác giả công bố hàm lượng chất khô của cây khoai lang tăng ựáng kể khi nuôi cấy bằng ánh sáng tự nhiên. Cây khoai lang phát triển tốt trong ựiều kiện nuôi cấy không ựường, khả năng thắch nghi cao khi ựưa ra vườn ươm.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU