Phương pháp nuôi cấy in vitro truyền thống (conventional micropropagation) vẫn còn một số hạn chế như: cây sống trong môi trường in vitro có sự khác biệt rất lớn so với cây sống ngoài môi trường tự nhiên. Kozai và cs. (2002) mô tả như sau: ựộ ẩm tương ựối cao ựến bão hòa, nhiệt ựộ ổn ựịnh, sự chênh lệch nồng ựộ CO2 giữa môi trường trong và ngoài bình nuôi cấy là rất lớn, sự tắch lũy khắ ethylene và những chất ựộc khác, không có sự hiện diện của vi sinh vật trong môi trường nuôi cấy.
Việc sử dụng bình nuôi cấy ựược bịt kắn làm cho ựộ ẩm trong bình nuôi cấy thường cao hơn 95% (Fujiwwara và Kozai, 1995). độ ẩm cao làm cho tốc ựộ thoát hơi nước của các khắ khổng kém. độ ẩm cao làm giảm tắch lũy chất khô và gây nên mất trật tự về sinh lý và cấu trúc hình thái (thủy tinh hóa). Các cây này sẽ bị mất nước nhanh chóng khi ựưa ra khỏi ống nghiệm, kết quả là tỷ lệ cây chết cao trong giai ựoạn thuần hóa ngoài nhà lưới. Trong ựó cây nuôi cấy in vitro trong ựiều kiện ẩm ựộ thấp giảm ựược sự mất nước quá ựộ từ lá và chống lại stress do mất nước khi chuyển trực tiếp từ ống nghiệm ra vườn ươm hay ựồng ruộng (Tanaka và cs., 1992).
Sự kém thông thoáng của bình nuôi cấy còn ảnh hưởng ựến thành phần không khắ trong hộp. Ngay sau khi bật ựèn, nồng ựộ CO2 trong ống nghiệm giảm xuống rất nhanh do hoạt ựộng quang hợp của cây cấy mô. Vì vậy trong suốt thời gian chiếu sáng cây trong ống nghiệm ở trạng thái ựói CO2 trầm trọng, nên chúng phải sử dụng ựường của môi trường (Nguyễn Văn Uyển, 1996). Cùng với sự giảm nồng ựộ CO2 là sự gia tăng tắch tụ khắ ethylen (C2H2). Ethylen ựược biết ựến như là một chất ựiều hòa tăng trưởng thực vật. Tuy nhiên ở nồng ựộ cao ethylen là một chất ựộc ựối với cây. Nồng ựộ ethylen trong bình nuôi cấy tăng dần theo thời gian ựến nồng ựộ 2-1ộmol (khoảng từ 21 Ờ 60 ngày sau khi cấy) (Nguyễn và Kozai, 1998). Nồng ựộ ethylen thường tăng cao trong các bình nuôi cấy kém thông thoáng (De Proft và cs., 1985).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 16
Nguyên nhân chắnh của những giới hạn này là do trong nuôi cấy in vitro
truyền thống, bình nuôi cấy luôn ựược ựậy kắn dẫn ựến tình trạng thiếu CO2 cần cho quang hợp. Thực vật cấy mô buộc phải sử dụng nguồn carbon hữu cơ lấy từ ựường ựể sinh trưởng. Vì vậy cây cấy mô thiếu khả năng tự dưỡng, bộ máy quang hợp của cây hầu như không họat ựộng, dẫn ựến việc cây cấy mô tăng trưởng chậm ở giai ựoạn vườn ươm với tỷ lệ sống không cao và ựòi hỏi nhiều công chăm sóc.
để cải tiến phương pháp nuôi cấy in vitro truyền thống nhằm khắc phục những hạn chế nêu trên nghiên cứu nuôi cấy in vitro thoáng khắ hay còn gọi là nuôi cấy in vitro quang tự dưỡng (photoautotrophic micropropagation). Phương pháp nuôi cấy in vitro thoáng khắ sử dụng màng Milliseal (Màng Milliseal có kắch thước lỗ thoáng là 0,5ộm giúp không khắ có thể ựi qua nhưng vi sinh vật và nấm mốc không qua ựược do công ty Millipore Ltd. của Nhật sản xuất) thay cho nút kắn và có thể kết hợp hoặc không kết hợp với sự làm giàu khắ CO2 trong hệ thống nuôi cấy (Jeong và cs., 1995).
được khởi ựầu từ đại học Chiba, Nhật Bản, tiếp tục ựược phát triển trong suốt thời gian vừa qua tại nhiều nơi trên thế giới như Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Ấn độ, Mỹ,... và ựược biết ựến như một trong những công nghệ mới trong lĩnh vực nông nghiệp công nghệ cao nhằm cải thiện chất lượng của cây cấy mô.
Hiện nay những cải tiến của bình Magenta, ựược thiết kế ựặc biệt ựể tăng cường sự thoáng khắ của không gian trong bình. Song song với sự phát triển các loại bình nuôi cấy, khoa học kỹ thuật ngày càng tiến bộ ựã tạo ra ựược nhiều vật liệu khác nhau phục vụ cho việc cải tiến các hệ thống nuôi cấy như màng thoáng khắ Milliseal. Hệ thống film thoáng khắ chứng tỏ có nhiều ưu ựiểm vượt trội so với các hệ thống cũ. Tuy nhiên, giá thành của hệ thống này còn quá cao do sử dụng vật liệu ựắt tiền. Do ựó, khó có thể ứng dụng thương mại trong ựiều kiện ở Việt Nam.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 17
Hầu hết các phòng nuôi cấy mô ở Việt Nam thường sử dụng bình thủy tinh. Gần ựây ựã có nghiên cứu trong việc sử dụng túi nilon trong công tác nuôi cấy in vitro ựã chứng tỏ tắnh ưu việt trong việc tiết kiệm chi phắ. Nhiều cơ sở còn tồn lại số lượng bình thủy tinh từ trước có thể tiết kiệm sử dụng nhưng thay nút kắn bằng nút thoáng khắ.
Ngoài ra, công nghệ nuôi in vitro quang tự dưỡng còn cho phép sử dụng hộp nuôi cấy lớn nên khả năng tự ựộng hoá quá trình nuôi cấy có thể thực hiện ựược dễ dàng, nhờ ựó chi phắ sản xuất cây cấy mô giảm và lợi nhuận của nhà sản xuất cây mô sẽ cao hơn.
Nuôi cấy thoáng khắ ựã ựược khảo sát rất nhiều và ựã ựược chứng minh rằng chúng có nhiều ưu ựiểm hơn so với kỹ thuật vi nhân giống truyền thống;
Trong tự nhiên, thành phần khắ CO2 trong không khắ rất quan trọng, nó cung cấp cho cây nguồn carbon ựể quang hợp. Sự giảm khắ CO2 trong môi trường nuôi cấy in vitro truyền thống dần làm cho cây giảm hoặc mất khả năng quang hợp và nồng ựộ hơi nước trong bình nuôi cấy bão hòa chắnh là hai nguyên nhân hàng ựầu dẫn tới tỷ lệ sống sót của cây in vitro rất thấp khi chuyển ra vườn ươm. Nồng ựộ khắ CO2 cao có lợi cho việc kéo dài chồi và sự phát triển của lá (Figueira và cs., 1991);
Kozai, Sekimot (1988) ựã công bố: Sự trao ựổi không khắ ựược gia tăng nhiều lần bằng việc sử dụng màng thoáng khắ Milliseal ựặt trên nắp hay trên thân của bình nuôi cấy;
Tốc ựộ trao ựổi không khắ gia tăng giúp tăng cường nồng ựộ CO2 thì khối lượng tươi, khối lượng khô, chiều cao, diện tắch lá và nồng ựộ chlorophyll (diệp lục) cũng gia tăng, khắ ethylene (nồng ựộ cao gây ựộc cho mẫu cấy) sinh ra trong quá trình nuôi cấy giảm không gây ựộc cho mẫu cấy. (Jeong và cs., 1996);
Các nghiên cứu cho thấy, sự tăng trưởng và phát triển của cây con trong
in vitro thoáng khắ có thể tốt hơn bởi việc tăng nồng ựộ CO2 và cường ựộ ánh sáng hay thay ựổi luồng photon (Photon flux - PPF) nhờ giảm ựộ ẩm tương
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 18
ựối trong các bình nuôi cấy. Khi các bình nuôi cấy ựược thông thoáng khắ, làm giảm bớt ựộ ẩm tương ựối trong bình và làm tăng tốc ựộ thoát hơi nước. (Chun and Kozai, 2001);
Công bố của Pruski và cs., (2002) chỉ ra rằng kỹ thuật vi nhân giống quang tự dưỡng cung cấp CO2 ựã ựược tiến hành trên giống khoai tây Russet Burbank và ựược ựề xuất trong sản xuất khoai tây giống;
M H Rahman and A A Alsadon (2007) khảo sát nhân giống cây khoai tây in vitro (03 giống: Hermes, Rosetta và Asterix) bằng nuôi cấy thoáng khắ có ựường, vitamin và không ựường, không vitamin, nuôi cấy truyền thống (kắn khắ) có ựường, có vitamin và không ựường, không vitamin trên nền môi trường MS. Kết quả thu ựược cả 3 giống khoai tây ựược nuôi cấy có ựường, có vitamin trên cả hai phương pháp thoáng khắ và truyền thống ựều cho kết quả tốt hơn nuôi cấy không ựường, không vitamin và có sự phát triển khác nhau giữa ba giống. Các kết quả chỉ ra rằng không có sự sai khác giữa số lá trung bình/chồi giữa các công thức. Tuy nhiên, ựường lại là 1 yếu tố quan trọng quyết ựịnh chiều dài và trọng lượng tươi của chồi làm nên sự phát triển khác nhau giữa ba giống;
Từ giữa thập niên 90 của thế kỷ XX, PGS.TS. Nguyễn Văn Uyển, ựã giới thiệu công nghệ nuôi cấy in vitro quang tự dưỡng ựến các nhà nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nước. Gần 20 năm qua, tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Sinh học nhiệt ựới, PGS.TS. Nguyễn Thị Quỳnh và các cs. ựã tập trung nghiên cứu ứng dụng vi nhân tổ hợp quang tự dưỡng trên nhiều ựối tượng cây trồng: cà phê (Coffea arabusta), hông (Paulownia fortunei), lõi thọ (Gmelina arborea), Neem (Azadirachta indica), tre tầm vông (Thyrsostachys siamensis Gamble), dâu tây (Fragaria x annanasa Duch.), nho không hạt (Vitis vitifera), khoai mỡ (Dioscorea alata), hoa ựồng tiền (Gerbera jamesonii), sa-lem (Limonium sinuatum), lan Dendrobium Burana White, và một số cây thảo dược. Các loại cây này ựều ựã ựược chứng minh có khả năng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 19
tăng trưởng tốt hơn thông qua phương pháp nuôi cấy trao ựổi khắ tự nhiên (không khắ trao ựổi bằng cách khuếch tán qua màng thoáng khắ millipore hay màng bằng giấy gắn trên nắp/thành hộp chứa cây). Sự tăng trưởng của cây in vitro nuôi cấy thoáng khắ trong bình nuôi cây do hoạt ựộng của bộ máy quang hợp ựược thúc ựẩy. điều này ựã khiến cây in vitro qua nuôi cấy quang tự dưỡng có chất lượng tốt hơn khi nuôi cấy theo kiểu truyền thống, dẫn ựến tỷ lệ sống cao hơn khi ựược ựưa ra vườn ươm.
Khả năng sinh trưởng phát triển của cây in vitro tăng cao, tỉ lệ chết sau thắch nghi giảm thấp, sự sinh trưởng phát triển tốt, cho cây khỏe mạnh sau thắch nghi là kết luận của các tác giả Nguyễn Thị Quỳnh, Phan Vũ Tiên, Trịnh Việt Nga. (2003) Nuôi cấy mô quang tự dưỡng cây lõi thọ (Gmelina arborea Roxb.), Nguyễn Thị Quỳnh và cs., (2005). Một số cây trồng có giá trị kinh tế cao, Nguyễn Thị Quỳnh và cs., (2005). Nuôi cấy lan Dendrobium, Nguyễn Thị Quỳnh, Nguyễn Thị Kim Linh, Thái Xuân Du, Nguyễn Văn Uyển, Toyoki Kozai (2006) nuôi cấy một số cây thân gỗ, Nguyễn Quốc Thiện, Dương Tấn Nhựt (2006) nuôi cấy cây dâu tây; Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Bá Nam (2009) nuôi cấy cây hoa cúc;