6. Dự kiến cấu trúc luận văn
3.3.3. Chất AC9: β-sitosterol-3-O-β–D-glucopyranosid (β-sitosterol glucosid)
Kết hợp số liệu phổ 1
H-NMR, DEPT, 13C-NMR và DEPT (bảng 3.3, 3.4) chúng tôi đã xác định được công thức cấu tạo của chất AC9 như sau:
3.3.3.1. Phân tích phổ 1H-NMR (DMSO-d6, δH ppm) của chất AC9
Bảng 3.5. Số liệu phổ 1H của chất AC9
Vị trí Số liệu phổ 1H của chất AC9 (CDCl3) δH 6 5.33 (1H, br s) 1’ 4.24 (1H, d, J = 8.0 Hz) 6’ 3.67 (1H, d, J = 10.5 Hz) 6’ 3,47 (1H, m,) 3 δH = 3,07 (1H, m, H-3) 19 0.98 (3H, s) 21 0.92 (3H, d, J = 6.5 Hz) 27 0,83 (3H, d, J = 7,0 Hz) 29 δH = 0,83 (3H, t, J = 7,5 Hz). 26 δH = 0,82 (3H, d, J = 7,0 Hz); 18 0.67 (3H, s)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 48 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.10. Phổ 1H–NMR của chấtAC9
Phổ 1
H- NMR của chất AC9 cho thấy có hai nhóm metyl bậc bốn với các tín hiệu singlet tại δH = 0,67 (3H, s, H-18) và 0,98 (3H, s, H-19); ba nhóm metyl gắn với –CH với các tín hiệu doublet tại δH = 0,82 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-26); 0,83 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-27) và 0,92 (3H, d, J = 6,5 Hz, H- 21) và một nhóm metyl gắn với –CH2 với tín hiệu triplet tại δH = 0,83 (3H, t, J = 7,5 Hz, H-29). Ở vùng trường thấp cho tín hiệu cộng hưởng của một proton vinylic tại δH = 5.33 (1H, br s, H-6), một nhóm oxymetin tại δH = 3,07 (1H, m, H-3) (trùng với tín hiệu của metanol trong dung môi). Các tín hiệu khác trong khoảng δH = 3,47- 5,70 ppm là các tín hiệu đặc trưng của đường glucose. Trong đó gồm: tín hiệu cộng hưởng của nhóm metilen mang oxi tại δH = 3,67 (1H, br d, J = 10,5 Hz, H-6’A – Glc) và 3,47 (1H, m, H-6’B-Glc), tín hiệu của proton anomeric tại δH = 4,24 (d, J = 8,0 Hz, H-1’), tín hiệu của bốn nhóm oxymetin và các nhóm OH của đường.
3.3.3.2. Phân tích phổ 13C-NMR và DEPT (DMSO-d6, δC ppm)
Bảng 3.6. Số liệu phổ 13
C-NMR của chất AC9
Vị trí Số liệu phổ của chất AC9 Vị trí Số liệu phổ của chất AC9
δC δC
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 49 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2 29,02 14 55,95 2’ 73,31 15 23,52 3 76,89 16 27,35 3’ 76,66 17 55,32 4 38.17 18 11,35 4’ 70,14 19 18,32 5 140,34 20 35,12 5’ 76,66 21 18,71 6 120,71 22 33,23 6’ 61,06 23 25,63 7 31,09 24 45,06 8 31,23 25 28,70 9 49,46 26 19,30 10 35,97 27 22,47 11 20,32 28 73,31 12 39,33 29 11,46 Hình 3.11. Phổ 13 C-NMR của chất AC9
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 50 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.12.Phổ 13
C-NMR và DEPT của chất AC9
Trên phổ 13C-NMR của hợp chất AC9 cho thấy sự xuất hiện của 35 cacbon trong đó có 29 cacbon của aglycon và 6 cacbon của một nhánh đường. Các tín hiệu của aglycon gồm tín hiệu của liên kết olefin >C=CH- tại δC = 140.34 (C-5) và 120.71 (C-6), tín hiệu của một nhóm metin mang oxi tại δC = 70.14 (C-3) cùng các tín hiệu của 6 nhóm metyl, 11 cacbon metylen, 7 cacbon metin và 2 cacbon bậc bốn. Ngoài ra phổ 13
C-NMR còn có tín hiệu của 1 cacbon anome tại δC= 100.68 (C-1’) cùng với 4 metin mang oxi tại δC= 76.89, 76.66, 76.41 và 73.31; 1 nhóm metylen mang oxi tại δC = 61.06.
Kết hợp các dữ liệu phổ 1
H-NMR, 13C- NMR, phổ DEPT và so sánh với tài liệu tham khảo [23]. Chất AC9 được xác định là β-sitosterol-3-O-β–D- glucopyranosid (hay daucosterol). Công thức cấu tạo của daucosterol được mô tả như (hình 3.13)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 51 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.13. Công thức cấu tạo của chất AC9
Daucosterol là một sterol quý, có liên quan tới sex-steroid nên có khá năng chữa chứng rối loạn tình dục. Daucosterol cũng có trong thành phần của một số dược liệu quý như đông trùng hạ thảo [1], cỏ mực Eclipta albaL; cây Gạo Bombax malabaricum DC [5] rau má Hydrocotyle bonariensis Comm. ex. Lam và lá sen Hydrocotyle vulgaris L. [4]…
3.4. Kết quả thử hoạt tính sinh học từ dịch chiết nƣớc thân loài Adenosma indiana (Lour.) Merr.
Do loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. được coi là một vị thuốc dùng trong y dược, trong đời sống người dân vẫn sử dụng thân cây khô để đun nước uống hàng ngày. Chúng tôi tiến hàng nghiên cứu khả năng ức chế peroxy hoá lipit của dịch chiết nước phần thân của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. dạng tươi và dạng khô, nhằm so sánh khả năng oxi hóa của hai dạng tươi và dạng khô và nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme α- glucosidase của mẫu phần thân của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. khô từ đó khuyến cáo cách sử dụng loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. trong thực tế.
3.4.1. Kết quả xác định khả năng ức chế peroxy hoá lipid (thử nghiệm MDA)
3.4.1.1. Chuẩn bị mẫu thử và cách xác định giá trị IC50
Chúng tôi tiến hành xác định khả năng ức chế peroxy hoá lipid của dịch chiết nước phần thân của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. dạng tươi và khô qua việc xác định hàm lượng malonyl dialdehit (MDA), là sản phẩm của quá trình peroxy hoá lipit màng tế bào. MDA có khả năng phản ứng với axit
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 52 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
thiobarbituric để tạo thành phức hợp trimethin (có màu hồng) có đỉnh hấp thu cực đại ở λ = 532 nm.
Chuẩn bị mẫu thử nghiệm
Thí nghiệm được thử nghiệm trên não dòng chuột thuần chủng BALB, mỗi mẫu thử được pha ở 6 nồng độ khác nhau lần lượt: 4000 µg/ml, 2000 µg/ml, 1000 µg/ml, 500 µg/ml, 100 µg/ml, 50 µg/ml. Lấy 50 µl mẫu thử ở các nồng độ thử nghiệm được cho phản ứng với 250 µl dịch đồng thể não chuột trong đệm KCl 1,15% .
Chuẩn bị mẫu đối chứng
Trolox (Sigma Aldrich), đồng phân của vitamin E được sử dụng làm chất đối chứng tham khảo được pha ở 6 nồng độ tương ứng với nồng độ mẫu thử nghiệm: 4000 µg/ml, 2000 µg/ml, 1000 µg/ml, 500 µg/ml, 100 µg/ml, 50 µg/ml.
Công thức tính phần trăm hoạt tính chống oxi hoá (HTCO)
HTCO (%) = [(ODC – ODT)/ODC] × 100 ODC : Mật độ quang học của dung môi ODT : Mật độ quang học của mẫu thử
Các số liệu kết quả thử nghiệm được biểu thị bằng trị số trung bình của 3 lần đo khác nhau.
Cách tính giá trị IC50
Vẽ đồ thị biểu diễn tỷ lệ phần trăm khả năng dập tắt gốc tự do hay khả năng ức chế peroxy hoá lipid theo nồng độ khảo sát của chất cần thử nghiệm bằng phần mềm Excell. Từ đồ thị, nội suy ra giá trị nồng độ dập tắt 50% gốc tự do bằng cách tính phương trình hồi quy tuyến tính có dạng y = ax + b và thế y = 50 và để suy ra IC50.
3.4.1.2. Khả nă ng ứ c chế peroxy hoá lipid (thử nghiệ m MDA)
củ a dị ch chiế t nư ớ c phầ n thân củ a loài Adenosma indiana
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 53 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Tách não chuột và sử dụng cho thí nghiệm chống oxi hóa dập tắt gốc tự do hay khả năng ức chế peroxy hoá lipid với quy trình như đã trình bày ở phần phương pháp. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác của thí nghiệm và của dữ liệu thu được. Dưới đây là kết quả xác định IC50 của dịch chiết nghiên cứu.
Bảng 3.7. Kết quả xác định khả năng ức chế peroxy hoá lipid của dịch chiết nước
phần thân của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. dạng tươi và dạng khô
STT Nồng độ mẫu (µg/ml) HTCO (%) (mẫu A)* HTCO (%) (mẫu B)* Nồng độ Trolox (µg/ml) HTCO (%) của Trolox 1 200 73.16 74.07 2 100 62.87 63.39 100 76.29 3 50 56.35 59.87 50 63.69 4 25 50.62 51.53 25 54.48 5 12.5 41.63 42.41 12.5 41.41 6 5.0 21.04 31.47 5.0 27.42 7 2.5 11.27 14.14 2.5 15.13 IC50 g/ml) 33.48 27.65 21.06
(*) mẫu A : mẫu dịch chiết nước phần thân của loài Adenosma indiana
(Lour.) Merr. (Bồ bồ) dạng khô.
(*) mẫu B : mẫu dịch chiết nước phần thân của loài Adenosma indiana
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 54 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.14. MDA của dịch chiết nước phần thân của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. (Bồ bồ) dạng tươi và dạng khô
Vì mẫu thử được pha ở các nồng độ: 4000 µg/ml, 2000 µg/ml, 1000 µg/ml, 500 µg/ml, 100 µg/ml, 50 µg/ml nên sau khi cho 50µl mẫu thử ở các nồng độ vào trong 250µl dịch đồng thể não và 700µl KCl thì nồng độ mẫu chỉ còn là 200 µg/ml, 100 µg/ml, 50 µg/ml, 25 µg/ml, 12.5 µg/ml, 5 µg/ml và 2.5 µg/ml.
Kết quả thực nghiệm
Nhận xét
Qua số liệu xác định khả năng ức chế peroxy hoá lipid (khả năng thể hiện hoạt tính chống oxi hóa) của hai mẫu dịch nước phần thân của loài Adenosma
indiana (Lour.) Merr. dạng tươi và dạng khô, kết quả thể hiện trên bảng 3.7 và
hình 3.14 cho thấy:
Dịch chiết nước mẫu phần thân của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. dạng khô thể hiện hoạt tính chống oxi hóa thông qua phép thử MDA với IC50 là 33.48 µg/ml. So với chất đối chứng là Trolox có IC50 là 21.06 µg/ml thì khả năng thể hiện hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết nước mẫu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 55 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
phần thân của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. dạng khô bằng 63% so
với chất chuẩn Trolox.
Dịch chiết nước mẫu phần thân của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. dạng tươi thể hiện hoạt tính chống oxi hóa thông qua phép thử MDA với IC50 là 27.65 µg/ml. So với chất đối chứng là Trolox có IC50 là 21.06 µg/ml thì khả năng thể hiện hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết nước mẫu phần thân của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. dạng tươi bằng 76,2%
so với chất chuẩn Trolox.
Kết luận
Dịch chiết nước phần thân của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. dạng tươi và khô đều thể hiện hoạt tính chống oxi hóa rất tốt, với các giá trị IC50
(µg/ml) lần lượt là 33.48 và 27.65. Kết quả cho thấy: Dịch chiết nước phần thân của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. dạng tươi thể hiện hoạt tính chống oxi hóa tốt hơn dạng khô là 1,21 lần.
3.4.2. Kết quả nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme α- glucosidase của dịch chiết nƣớc phần thân của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. dạng khô chiết nƣớc phần thân của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. dạng khô
3.4.2.1. Chuẩn bị mẫu thử và cách xác định giá trị IC50
Chuẩn bị mẫu thử nghiệm
Mẫu thử được hòa tan trong DMSO và pha loãng trong phosphate buffer 10 mM (pH 6.8) để có nồng độ 1000 g/ml, 500 g/ml; 100 g/ml; 20 g/ml; 4 g/ml. Trộn đều mẫu thử với 20 µl α- glucosidase (0,5U/ml) và 120 µl phosphate buffer 100 mM (pH 6.8) được thêm vào mỗi giếng, trộn đều và ủ ở 37oC trong 15 phút. Cơ chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG) được đưa tiếp vào từng giếng thí nghiệm rồi ủ tiếp ở 37oC trong 60 phút.
Chuẩn bị mẫu đối chứng
Acarbose là thuốc đặc trị để điều trị bệnh tiểu đường, là một tetrasacharid, có khả năng ức chế men - glucosidase ruột đặc biệt là
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 56 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
sucrase, làm chậm tiêu hóa và hấp thu carbohydrat. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo sự chính xác và đo OD ở bước sóng 405 nm bằng máy đo ELISA Plate Reader (Bio-Rad).
Công thức tính phần trăm ức chếenzyme α-glucoside
Khả năng ức chế enzyme α- glucosidase của mẫu thử được xác định theo công thức sau:
% ức chế = (1 - Amẫu thử/ A đối chứng )*100 Trong đó: A đối chứng = OD đối chứng - OD blank Amẫu thử = ODmẫu thử - OD blank mauthu
Cách tính giá trị IC50
Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50%) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve. Số liệu được xử lí trên hệ thống Excel và GraphPad Prism.
3.4.2.2. Khả năng ức chế enzyme α-glucoside của dịch chiết nước phần thân của
loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. dạng khô
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác của thí nghiệm và dữ liệu. Kết quả thu được, sau khi xác định % ức chế enzyme α- glucosidase và tính giá trị IC50 được thể hiện ở bảng 3.8.
Bảng 3.8. Kết quả xác định khả năng ức chế enzyme α-glucoside của dịch chiết nước phần thân của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. dạng khô
Nồng độ (µg/ml)
% Ức chế
Adenosma indiana (Lour.)
Merr. (Bồ bồ) dạng khô Acarbose (Đối chứng)
500 50.98 89.76
100 22.10 32.82
20 9.85 8.07
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 57 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
IC50 481.78 199.47
Nhận xét
Qua số liệu xác định khả năng ức chế enzyme α- glucosidase của mẫu dịch nước phần thân của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. dạng khô, kết quả thể hiện trên bảng 3.8 cho thấy:
Dịch chiết nước phần thân của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. dạng khô có thể hiện hoạt tính ức chế enzyme α-glucoside với giá trị IC50 là 481.78 g/ml, so với chất đối chứng Acarbose là thuốc đặc trị ức chế enzyme α- glucosidase dùng cho bệnh tiểu đường thì có tác dụng bằng 41,4% Acarbose. Là mẫu chiết thô nên với mức thể hiện hoạt tính này, dịch chiết nước phần thân của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. dạng khô được xem là có hoạt tính ức chế
α -glucosidase.
3.4.3. Kết luận về hoạt tính sinh học của dịch chiết nƣớc phần thân của loài
Adenosma indiana (Lour.) Merr.
Về hoạt tính chống oxi hóa: Dịch chiết nước phần thân của loài Adenosma
indiana (Lour.) Merr. dạng khô và tươi đã thể hiện hoạt tính chống oxi hoá
rất tốt với IC50 là 33.48 và 27.65 µg/ml trong phép thử chống lipid hóa màng tế
bào. Dịch chiết nước phần thân của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. dạng tươi thể hiện hoạt tính chống oxi hóa tốt hơn dạng khô là 1,21 lần.
Về khả năng ức chế enzyme α-glucoside: Dịch chiết nước phần thân của loài
Adenosma indiana (Lour.) Merr. khô đã thể hiện hoạt tính ức chế α-glucoside
với IC50 là 481.78 µg/ml.
Dịch chiết nước phần thân của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. có khả năng ức chế men α-glucosidase do làm chậm tiêu hóa các đường đôi và kéo dài thời gian tiêu hóa các đường đôi dẫn đến giảm thu hấp glucose, do đó làm chậm sự gia tăng glucose máu sau ăn.
Với kết quả nghiên cứu trên, có thể thấy rằng việc sử dụng phần thân của loài
Adenosma indiana (Lour.) Merr. ở dạng tươi sẽ có tác dụng chống oxi hóa tốt hơn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 58 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
đất trồng nên có thể sử dụng làm loại cây đun nước uống hàng ngày, có tác dụng bảo vệ sức khỏe tốt do hoạt tính chống oxi hóa và phòng chống bệnh tiểu đường.
KẾT LUẬN
1- Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên về sự phân bố, định danh của chi
Adenosma tại huyện Đại Từ- tỉnh Thái Nguyên. Kết quả cho thấy trên địa bàn
huyện Đại từ- tỉnh Thái Nguyên phân bố hai loài của chi Adenosma là Adenosma
caeruleum R. Br. (Nhân trần) và Adenosma indiana (Lour.) Merr. (Bồ bồ);
2- Từ phần thân của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. được thu hái tại huyện Đại Từ- tỉnh Thái Nguyên; đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học được 03 chất trong cặn etyl axetat:
- Chất AC4: 2-(4’-hydroxyphenyl)etyl triacontanoat - Chất AC1: Axit betulinic
- Chất AC9 : β-sitosterol glucosid
- Cả ba hợp chất phân lập được từ phần thân Adenosma indiana (Lour.) Merr. Là AC4, AC1, AC9, đều có vai trò là các dẫn chất trong tổng hợp hữu cơ và là dược chất được sử dụng rộng rãi trong y học.
3- Kết quả xác định hoạt tính sinh học từ dịch chiết nước phần thân của loài
Adenosma indiana (Lour.) Merr. đã xác định được:
Về hoạt tính chống oxi hóa trong phép thử chống lipid hóa màng tế bào:
Dịch chiết nước phần thân của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. cả hai dạng tươi và khô đều thể hiện hoạt tính chống oxi hóa rất tốt, trong đó dạng khô có giá trị IC50 là 33.48 µg/ml (bằng 63% so với chất chuẩn Trolox) và dịch chiết nước phần thân của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. dạng tươi có giá trị
IC50 là 27.65 µg/ml (bằng 76,2% so với chất chuẩn Trolox).
Dịch chiết nước phần thân của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. dạng tươi thể hiện hoạt tính chống oxi hóa tốt hơn dạng khô là 1,21 lần.
Về khả năng ức chế enzyme α-glucoside:
Dịch chiết nước phần thân của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. dạng khô có thể hiện hoạt tính ức chế enzyme α-glucoside với giá trị IC50 là 481.78 g/ml, có tác dụng bằng 41,4% so với Acarbose là thuốc đặc trị ức chế enzyme
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 59 http://www.lrc-tnu.edu.vn/