6. Dự kiến cấu trúc luận văn
3.2.Phân lập các chất từ cặn chiết etyl axetat phần thân của loài Adenosma
Trong 2 loài này thì loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. là loài phổ biến hơn do huyện Đại Từ nơi có nhiều đồi, núi, khí hậu thuận lợi cho loài Adenosma
indiana (Lour.) Merr. sinh trưởng và phát triển.
3.2. Phân lập các chất từ cặn chiết etyl axetat phần thân của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. indiana (Lour.) Merr.
Mẫu phần thân của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. đã sấy khô, nghiền nhỏ (1050g) được ngâm chiết (xem mục 2.4.1.1) thu được 6,12 g cặn n-hexan; 8,35 g cặn etyl axetat (sơ đồ 2.1).
Quá trình phân lập các chất từ cặn chiết etyl axetat phần thân của loài
Adenosma indiana (Lour.) Merr. được trình bày chi tiết ở phần thực nghiệm
(xem mục 2.4.1.2).
Từ 8,35 g cặn chiết etyl axetat phần thân của loài Adenosma indiana
(Lour.) Merr. được phân tách bằng sắc ký cột silicagel với các hệ dung môi khác nhau thu được 3 chất sạch: ký hiệu là AC1, AC4, AC9.
+ Chất AC1: 114 mg, hiệu suất 1,1.10-2 % so với trong lượng mẫu khô. + Chất AC4: 8 mg, hiệu suất 7,6.10-4 % so với trọng lượng mẫu khô. + Chất AC9: 8,3 mg, hiệu suất 7,9.10-4 % so với trọng lượng mẫu khô.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 38 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
3.3. Xác định cấu trúc chất tách đƣợc
Cấu trúc hóa học của 3 chất sạch: AC1, AC4 và AC9 được xác định dựa vào dữ liệu phổ HR-ESI-MS, 1
H-NMR, 13C-NMR, DEPT và so sánh với tài liệu tham khảo.
3.3.1. Chất AC4 : 2-(4’-hydroxyphenyl)etyl triacontanoat
Kết hợp số liệu phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS, phổ 1
H-NMR,DEPT,
13
C-NMR (Bảng 3.1; 3.2)chúng tôi đã xác định được công thức cấu tạo của chất
AC4 như sau:
3.3.1.1. Phân tích phổ khối HR-ESI-MS
Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS của chất AC4 cho pic ion phân tử ở
m/z 595.5095 [M+Na]+ (theo tính toán cho C38H68NaO3 là595,5066), tương ứng với công thức phân tử là C38H68O3 (Hình 3.1).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 39 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
3.3.1.2. Phân tích phổ 1H-NMR (CDCl3, δH ppm)
Bảng 3.1. Số liệu phổ 1
H- NMRcủa chất AC4 và 2-(4’-hydroxyphenyl)etyl triacontanoat [32]. Vị trí Chất AC4 (CDCl3) 2-(4’-hydroxyphenyl)etyl triacontanoat (CDCl3) [32] δH δH 1 4,24 (2H, t, J = 7,0 Hz) 4,23 (2H, t, J = 7,1 Hz) 2 2,86 (2H, t, J = 7,0 Hz) 2,85 (2H, t, J = 7,1 Hz) 2’ & 6’ 7,07 (2H, d, J = 8,0 Hz) 7,00 (2H, d, J= 8.4 Hz) 3’& 5’ 6,77 (2H, J = 8,0 Hz) 6,77 (2H, d, J= 8.4 Hz) 2’’ 2,28 (2H, J = 7,5 Hz) 2,28 (2H, t, J = 7.1 Hz) 3’’ 1,57 – 1,62 (2H, m) 1,56 (2H, m) 4’’- 29’’ 1,25-1,31 (52H, m) 1,25 (52H, m) CH3 0,88 (3H, J = 6,5 Hz) 0,89 (3H, t, J = 6.2 Hz) OH 4,97 (1H, s) 4,69 (1H , br s) Hình 3.2. Phổ 1H–NMR của chất AC4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 40 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Phổ 1
H-NMR của chất AC4 cho các tín hiệu của 2 doublet tại δH = 7.08 (2H, d, J= 8.0 Hz), 6.77 (2H, d, J= 8.0 Hz), một singlet của nhóm hydroxyl ở δH
4.97, 2 nhóm metylen ở δH = 4.24 (2H, t, J = 7.0 Hz) và 2.86 (2H, t, J= 7.0 Hz). Ngoài ra, trên phổ 1
H-NMR của nó còn có một nhóm metylen bên cạnh nhóm cacbonyl ở δH 2.28 (2H, t, J = 7.5 Hz), tín hiệu của rất nhiều nhóm CH2 cộng hưởng chồng chập ở δH 1.25 (52H, s) và 1 nhóm metyl của mạch hydrocacbon no ở δH = 0.88 (3H, t, J = 7.0 Hz). Các dữ liệu này cho phép dự đoán chất AC4 là
một este của hợp chất 4-hydroxyphenyl etanol.
3.1.3.3. Phân tích phổ 13C-NMR và DEPT (CDCl3, δC ppm)
Bảng 3.2. Số liệu phổ 13
C-NMR của chất AC4 và 2-(4’-hydroxyphenyl)etyl
triacontanoat [32]. Vị trí Chất AC4 (CDCl3) 2-(4’-hydroxyphenyl)etyl triacontanoate (CDCl3) [32] δC δC 1 64,96 64,9 2 34,38 34,3 1’ 129,99 129,8 2’ & 6’ 130,04 129,9 3’& 5’ 115,34 115,3 4’ 154,30 154,3 1’’ 173,95 173,9 2’’ 31,94 31,9 3’’4’’ - 29’’ 29,71-22,70 29.6-22.6 CH3 14,11 14,0
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 41 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.3. Phổ 13C-NMR của chất AC4
Hình 3.4. Phổ 13C-NMR và DEPT của chất AC4
Phù hợp với phổ 1
H-NMR, phổ 13C-NMR và DEPT cho thấy sự có mặt trong phân tử của chất AC4 một nhóm este ở δC = 173,95; một cacbon bậc 4 có gắn với oxi δC = 154,30; các tín hiệu của cacbon vòng thơm ở δC = 115,34;
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 42 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
129,99, 130,04; 1 nhóm oximetylen ở δC = 64,96; 1 nhóm metyl ở δC = 14,11 và rất nhiều tín hiệu của nhóm CH2 ở trong khoảng δC = 22,70 – 34,38.
Dựa vào các tín hiệu phổ đã được phân tích ở trên kết hợp so sánh với số liệu trong tài liệu tham khảo [32], cấu trúc chất AC4 được xác định là 2-(4’-
hydroxyphenyl)etyl triacontanoat. Công thức cấu tạo của 2-(4’-hydroxyphenyl)etyl triacontanoat được mô tả như (hình 3.5)
Hình 3.5. Công thức cấu tạo của chất AC4
3.3.2. Chất AC1: Axit betulinic ( axit (3β)-3-Hydroxy-lup-20(29)-en-28-oic)
Kết hợp số liệu phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS, phổ 1
H-NMR, DEPT,
13
C-NMR
(bảng 3.3, 3.4) chúng tôi đã xác định được công thức cấu tạo của chất AC1 như sau:
3.3.2.1. Phân tích phổ 1H-NMR (CDCl3, δH ppm)
Bảng 3.3. Số liệu phổ 1H của chất AC1 và axit betulinic [36]
Vị trí Chất AC1 (CDCl3) Axit betulinic (CDCl3) [36]
δH δH 3 3.21(1H, dd, J = 11.5, 5.0) 3.19, dd 19 3.02 (1H, dt, J = 11.0, 5.0) 2.99, ddd 23 0.96 (3H, s) 0.93, s 24 0.78 (3H, s) 0.75, s 25 0.85 (3H, s) 0.82, s 26 0.99 (3H, s) 0.96, s 27 1.00 (3H, s) 0.97, s 29 4.63 (1H, dd, J = 2.0, 1.5) 4.76 (1H, d, J= 1.5) 4.60, d 4.73, d
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 43 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
30 1.72 (3H, s) 1.68, s
Hình 3.6.Phổ 1
H–NMR của chất AC1 Trên phổ 1
H-NMR của chất AC1 cho các tín hiệu của 2 proton olefin ở δH
=4.63 (1H, dd, J = 2,0; 1,5) và 4.76 (1H, d, J = 1.5); 1 nhóm metin liên kết với nguyên tử oxi (hydroxymetin) ở δH = 3.21(1H, dd, J = 11.5, 5.0 Hz) và 6 nhóm metyl bậc bốn tại δH = 0,78 (3H, s); 0,85 (3H, s); 0,96 (3H, s); 0,99 (3H, s); 1,00 (3H, s); 1,72 (3H, s) (Hình 3.6).
3.3.2.2. Phổ 13C-NMR và DEPT (CDCl3, δC ppm)
Bảng 3.4. Số liệu phổ 13
C-NMR của chất AC1 và axit betulinic [36]
Vị trí Chất AC1 (CDCl3) Axit betulinic (CDCl3) [36]
δC δC
1 38.8 38.7
2 27.4 27.4
3 79.1 78.9
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 44 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Vị trí Chất AC1 (CDCl3) Axit betulinic (CDCl3) [36]
δC δC 5 55.4 55.3 6 18.3 18.3 7 34.4 34.3 8 40.8 40.7 9 50.6 50.5 10 37.3 37.2 11 20.9 20.8 12 25.6 25.5 13 38.5 38.4 14 42.5 42.4 15 30.6 30.5 16 32.2 32.1 17 56.4 56.3 18 47.0 46.8 19 49.4 49.2 20 150.4 150.3 21 29.7 29.7 22 37.1 37.0 23 28.0 27.9 24 15.4 15.3 25 16.1 16.0 26 16.14 16.1 27 14.7 14.7 28 180.6 180.5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 45 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Vị trí Chất AC1 (CDCl3) Axit betulinic (CDCl3) [36]
δC δC
29 109.7 109.6
30 19.4 19.4
Hình 3.7. Phổ 13
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 46 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.8. Phổ 13
C-NMR và DEPT của chất AC1 Phổ 13
C-NMR và DEPT cho thấy sự có mặt của 30 cacbon trong phân tử gồm một cacbon của nhóm axit ở δC = 180,61); một cacbon hydroxymetin ở δC
= 79,05; hai cacbon olefin dạng >C=CH2 ở δC = 150,42 và 109,67; 6 cacbon metyl; 10 cacbon metylen; 5 cacbon metin và 5 cacbon bậc bốn.
Từ các số liệu phân tích ở trên cho thấy chất AC1 là một triterpene axit
khung lupan. So sánh các dữ liệu phổ 1
H-NMR, 13C-NMR của chất AC1 với axit betulinic trong tài liệu tham khảo [36]thấy hoàn toàn phù hợp. Vậy kết luận chất
AC1 chính là axit (3β)-3-hydroxy-lup-20(29)-en-28-oic hay axit betulinic. Công thức cấu tạo của axit betulinic được mô tả như (hình 3.7)
Hình 3.9.Công thức cấu tạo của chất AC1: (3β)-3-hydroxy-lup-20(29)-en-28-oic Axit betulinic là một triterpenoid pentacyclic nguồn gốc thực vật, là một trong những hợp chất thiên nhiên đầu tiên được xác định và phân lập từ cây vào năm 1788 [9]. Axit betulinic đã được chứng minh là có đặc tính chống khối u và tiêu diệt các tế bào ung thư. Axit betulinic kích thích tổng hợp collagen và ức chế quá trình viêm [41].
Axit betulinic có thể vượt qua một số hình thức kháng thuốc và là ưu tiên trong quá trình điều trị các dòng u ác tính di căn [37], [39], [40].
Do hiệu lực chống ưng thư cao, axit betulinic ngày nay đã được phát triển thành thuốc chống ung thư [40].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 47 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
collagen và ức chế quá trình viêm bằng cách bảo vệ chống lại các protein kinase [41]; làm tăng độ đàn hồi của da; ức chế sự hình thành hắc tố melanin, giúp làm trắng da [34].
Chủ yếu axit betulinic được chiết xuất từ vỏ cây Bạch dương Betula Alba
3.3.3. Chất AC9: β-sitosterol-3-O-β–D-glucopyranosid (β-sitosterol glucosid)
Kết hợp số liệu phổ 1
H-NMR, DEPT, 13C-NMR và DEPT (bảng 3.3, 3.4) chúng tôi đã xác định được công thức cấu tạo của chất AC9 như sau:
3.3.3.1. Phân tích phổ 1H-NMR (DMSO-d6, δH ppm) của chất AC9
Bảng 3.5. Số liệu phổ 1H của chất AC9
Vị trí Số liệu phổ 1H của chất AC9 (CDCl3) δH 6 5.33 (1H, br s) 1’ 4.24 (1H, d, J = 8.0 Hz) 6’ 3.67 (1H, d, J = 10.5 Hz) 6’ 3,47 (1H, m,) 3 δH = 3,07 (1H, m, H-3) 19 0.98 (3H, s) 21 0.92 (3H, d, J = 6.5 Hz) 27 0,83 (3H, d, J = 7,0 Hz) 29 δH = 0,83 (3H, t, J = 7,5 Hz). 26 δH = 0,82 (3H, d, J = 7,0 Hz); 18 0.67 (3H, s)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 48 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.10. Phổ 1H–NMR của chấtAC9
Phổ 1
H- NMR của chất AC9 cho thấy có hai nhóm metyl bậc bốn với các tín hiệu singlet tại δH = 0,67 (3H, s, H-18) và 0,98 (3H, s, H-19); ba nhóm metyl gắn với –CH với các tín hiệu doublet tại δH = 0,82 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-26); 0,83 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-27) và 0,92 (3H, d, J = 6,5 Hz, H- 21) và một nhóm metyl gắn với –CH2 với tín hiệu triplet tại δH = 0,83 (3H, t, J = 7,5 Hz, H-29). Ở vùng trường thấp cho tín hiệu cộng hưởng của một proton vinylic tại δH = 5.33 (1H, br s, H-6), một nhóm oxymetin tại δH = 3,07 (1H, m, H-3) (trùng với tín hiệu của metanol trong dung môi). Các tín hiệu khác trong khoảng δH = 3,47- 5,70 ppm là các tín hiệu đặc trưng của đường glucose. Trong đó gồm: tín hiệu cộng hưởng của nhóm metilen mang oxi tại δH = 3,67 (1H, br d, J = 10,5 Hz, H-6’A – Glc) và 3,47 (1H, m, H-6’B-Glc), tín hiệu của proton anomeric tại δH = 4,24 (d, J = 8,0 Hz, H-1’), tín hiệu của bốn nhóm oxymetin và các nhóm OH của đường.
3.3.3.2. Phân tích phổ 13C-NMR và DEPT (DMSO-d6, δC ppm)
Bảng 3.6. Số liệu phổ 13
C-NMR của chất AC9
Vị trí Số liệu phổ của chất AC9 Vị trí Số liệu phổ của chất AC9
δC δC
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 49 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2 29,02 14 55,95 2’ 73,31 15 23,52 3 76,89 16 27,35 3’ 76,66 17 55,32 4 38.17 18 11,35 4’ 70,14 19 18,32 5 140,34 20 35,12 5’ 76,66 21 18,71 6 120,71 22 33,23 6’ 61,06 23 25,63 7 31,09 24 45,06 8 31,23 25 28,70 9 49,46 26 19,30 10 35,97 27 22,47 11 20,32 28 73,31 12 39,33 29 11,46 Hình 3.11. Phổ 13 C-NMR của chất AC9
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 50 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.12.Phổ 13
C-NMR và DEPT của chất AC9
Trên phổ 13C-NMR của hợp chất AC9 cho thấy sự xuất hiện của 35 cacbon trong đó có 29 cacbon của aglycon và 6 cacbon của một nhánh đường. Các tín hiệu của aglycon gồm tín hiệu của liên kết olefin >C=CH- tại δC = 140.34 (C-5) và 120.71 (C-6), tín hiệu của một nhóm metin mang oxi tại δC = 70.14 (C-3) cùng các tín hiệu của 6 nhóm metyl, 11 cacbon metylen, 7 cacbon metin và 2 cacbon bậc bốn. Ngoài ra phổ 13
C-NMR còn có tín hiệu của 1 cacbon anome tại δC= 100.68 (C-1’) cùng với 4 metin mang oxi tại δC= 76.89, 76.66, 76.41 và 73.31; 1 nhóm metylen mang oxi tại δC = 61.06.
Kết hợp các dữ liệu phổ 1
H-NMR, 13C- NMR, phổ DEPT và so sánh với tài liệu tham khảo [23]. Chất AC9 được xác định là β-sitosterol-3-O-β–D- glucopyranosid (hay daucosterol). Công thức cấu tạo của daucosterol được mô tả như (hình 3.13)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 51 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.13. Công thức cấu tạo của chất AC9
Daucosterol là một sterol quý, có liên quan tới sex-steroid nên có khá năng chữa chứng rối loạn tình dục. Daucosterol cũng có trong thành phần của một số dược liệu quý như đông trùng hạ thảo [1], cỏ mực Eclipta albaL; cây Gạo Bombax malabaricum DC [5] rau má Hydrocotyle bonariensis Comm. ex. Lam và lá sen Hydrocotyle vulgaris L. [4]…
3.4. Kết quả thử hoạt tính sinh học từ dịch chiết nƣớc thân loài Adenosma indiana (Lour.) Merr.
Do loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. được coi là một vị thuốc dùng trong y dược, trong đời sống người dân vẫn sử dụng thân cây khô để đun nước uống hàng ngày. Chúng tôi tiến hàng nghiên cứu khả năng ức chế peroxy hoá lipit của dịch chiết nước phần thân của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. dạng tươi và dạng khô, nhằm so sánh khả năng oxi hóa của hai dạng tươi và dạng khô và nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme α- glucosidase của mẫu phần thân của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. khô từ đó khuyến cáo cách sử dụng loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. trong thực tế.
3.4.1. Kết quả xác định khả năng ức chế peroxy hoá lipid (thử nghiệm MDA)
3.4.1.1. Chuẩn bị mẫu thử và cách xác định giá trị IC50
Chúng tôi tiến hành xác định khả năng ức chế peroxy hoá lipid của dịch chiết nước phần thân của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. dạng tươi và khô qua việc xác định hàm lượng malonyl dialdehit (MDA), là sản phẩm của quá trình peroxy hoá lipit màng tế bào. MDA có khả năng phản ứng với axit
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 52 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
thiobarbituric để tạo thành phức hợp trimethin (có màu hồng) có đỉnh hấp thu cực đại ở λ = 532 nm.
Chuẩn bị mẫu thử nghiệm
Thí nghiệm được thử nghiệm trên não dòng chuột thuần chủng BALB, mỗi mẫu thử được pha ở 6 nồng độ khác nhau lần lượt: 4000 µg/ml, 2000 µg/ml, 1000 µg/ml, 500 µg/ml, 100 µg/ml, 50 µg/ml. Lấy 50 µl mẫu thử ở các nồng độ thử nghiệm được cho phản ứng với 250 µl dịch đồng thể não chuột trong đệm KCl 1,15% .
Chuẩn bị mẫu đối chứng
Trolox (Sigma Aldrich), đồng phân của vitamin E được sử dụng làm chất đối chứng tham khảo được pha ở 6 nồng độ tương ứng với nồng độ mẫu thử nghiệm: 4000 µg/ml, 2000 µg/ml, 1000 µg/ml, 500 µg/ml, 100 µg/ml, 50 µg/ml.
Công thức tính phần trăm hoạt tính chống oxi hoá (HTCO)
HTCO (%) = [(ODC – ODT)/ODC] × 100 ODC : Mật độ quang học của dung môi ODT : Mật độ quang học của mẫu thử
Các số liệu kết quả thử nghiệm được biểu thị bằng trị số trung bình của 3 lần đo khác nhau.
Cách tính giá trị IC50
Vẽ đồ thị biểu diễn tỷ lệ phần trăm khả năng dập tắt gốc tự do hay khả năng ức chế peroxy hoá lipid theo nồng độ khảo sát của chất cần thử nghiệm bằng phần mềm Excell. Từ đồ thị, nội suy ra giá trị nồng độ dập tắt 50% gốc tự do bằng cách tính phương trình hồi quy tuyến tính có dạng y = ax + b và thế y = 50 và để suy ra IC50.
3.4.1.2. Khả nă ng ứ c chế peroxy hoá lipid (thử nghiệ m MDA)
củ a dị ch chiế t nư ớ c phầ n thân củ a loài Adenosma indiana
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 53 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Tách não chuột và sử dụng cho thí nghiệm chống oxi hóa dập tắt gốc tự do hay khả năng ức chế peroxy hoá lipid với quy trình như đã trình bày ở phần phương pháp. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác của thí nghiệm và của dữ liệu thu được. Dưới đây là kết quả xác định IC50 của dịch chiết nghiên cứu.
Bảng 3.7. Kết quả xác định khả năng ức chế peroxy hoá lipid của dịch chiết nước
phần thân của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. dạng tươi và dạng khô
STT Nồng độ mẫu (µg/ml) HTCO (%) (mẫu A)* HTCO (%) (mẫu B)* Nồng độ Trolox (µg/ml) HTCO (%) của Trolox 1 200 73.16 74.07 2 100 62.87 63.39 100 76.29 3 50 56.35 59.87 50 63.69 4 25 50.62 51.53 25 54.48 5 12.5 41.63 42.41 12.5 41.41 6 5.0 21.04 31.47 5.0 27.42 7 2.5 11.27 14.14 2.5 15.13 IC50 g/ml) 33.48 27.65 21.06
(*) mẫu A : mẫu dịch chiết nước phần thân của loài Adenosma indiana
(Lour.) Merr. (Bồ bồ) dạng khô.
(*) mẫu B : mẫu dịch chiết nước phần thân của loài Adenosma indiana
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 54 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.14. MDA của dịch chiết nước phần thân của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. (Bồ bồ) dạng tươi và dạng khô
Vì mẫu thử được pha ở các nồng độ: 4000 µg/ml, 2000 µg/ml, 1000 µg/ml, 500 µg/ml, 100 µg/ml, 50 µg/ml nên sau khi cho 50µl mẫu thử ở các nồng độ vào trong 250µl dịch đồng thể não và 700µl KCl thì nồng độ mẫu chỉ còn là 200