6. Dự kiến cấu trúc luận văn
1.3. Axit betulinic và một số dẫn xuất của axit betulinic
1.3.1. Axit betulinic
Từ năm 1995 Axit betulinic được biết tới như là một chất ức chế u ác tính trên người [19], [33], [37], qua thực nghiệm, đã chứng minh được axit betulinic có khả năng phá hủy tế bào trong các hệ thống ung thư [17], [41].
Các nghiên cứu ban đầu kết luận rằng axit betulinic chống lại các dòng tế bào u ác tính một cách chọn lọc [33], [49], các nghiên cứu sau đó đã chứng minh là axit betulinic có khả năng chữa trị các loại bệnh ung thư khác của con người bao gồm: u nguyên bào thần kinh [18], [38], u não [19], bệnh bạch cầu [15], [34] cũng như một số bệnh ung thư, ở vùng đầu, cổ [42], đại tràng, vú, gan, phổi, tuyến tiền liệt, tế bào thận, buồng trứng hoặc ung thư biểu mô cổ tử cung... Axit betulinic có thể vượt qua một số hình thức kháng thuốc [10], [17], [24] vì vậy axit betulinic là ưu tiên chỉ định trong quá trình điều trị các dòng u ác tính di căn [13], [22], [37]. Axit betulinic kết hợp với các kích thích gây độc tế bào khác nhau để ngăn chặn sự phát triển của khối u, bao gồm cả bức xạ ion hóa [41], các loại thuốc hóa trị liệu [ 13], [46].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 23 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 1.4. Khả năng gây độc tế bào một số loại ung thư ở người của axit betulinic.
Loại ung thƣ ED50 (mg / ml) Tài liệu tham khảo
U ác tính 1,1-4,8 [35]
U nguyên bào thần kinh 2-10 [18],[45]
U nguyên bào tủy 3-15 [ 19], [20]
Ung thư não 5-16 [19]
Ung thư vùng đầu và cổ 8 [42]
Ung thư buồng trứng 1,8-4,5 [49]
Ung thư cổ tử cung 1.8 [49]
Ung thư phổi 1,5-4,2 [37],[49]
Bệnh bạch cầu 2-15 [ 15 ]
1.3.2. Một số dẫn xuất của axit betulinic
Nhiều dẫn xuất mới của axit betulinic có hoạt tính sinh học mạnh với virut và với tế bào ung thư. Sự chuyển hóa các nhóm chức hydroxyl ở C-3 và nhóm cacbonyl ở C-28 của axit betulinic tạo thành dãy các dẫn xuất mới có hoạt tính sinh học cao hơn so với axit betulinic [12], [25], [31]. Ví dụ, hợp chất (11) và (12) (Hình 1.4) thể hiện hoạt tính kháng HIV ức chế dòng tế bào MT-4 với các
giá trị EC50= 0,01µmol/L (IC5 0=12,2 µmol/L) và EC5 0= 0,007µmol/L (IC5 0=11 µmol/L) [13], [27], [30].
Các sản phẩm từ phản ứng este hóa và amit hóa nhóm hydroxyl cùng nhóm cacboxylic của betulinic đều có hoạt tính sinh học cao hơn so với betulinic, như dẫn xuất mới (13) và (14) (Hình 1.4) đều cho thấy khả năng ức chế mạnh sự sinh trưởng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 24 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
của virut HIV với các nồng độ tác dụng EC50= 0,0047µmol/L (IC50>10 µmol/L) và EC50= 0,0026µmol/L (IC50=8 µmol/L) [26], [40]. Đặc biệt, trong các dẫn xuất mới của axit betulinic, hợp chất (15) (Hình 1.4), có tác dụng ức chế sự sinh trưởng của virut HIV và hiện tại đang trong tiến trình thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 2b [13], [40]. Những biến đổi hóa học trong vòng A của axit betulinic tạo hệ liên hợp 2-cloro- hay 2-formyl-3-oxo-1-en- như các dẫn xuất axit 2-cloro-3-oxo-lup-1,20(29)- dien-28- oic (16) và axit metyl 2-formyl-3-oxo-lup-1,20(29)-dien-28-oic (17) (Hình 1.4) có
hoạt tính độc tế bào khá mạnh đối với dòng tế bào ung thư SK-MEL-2, đặc biệt là hợp chất (16) có hoạt tính mạnh tăng gấp 59 lần so với axit betulinic trên tế bào ung thư hắc tố da SK-MEL-2 ,[12], [15], [34].
Hình 1.10. Một số dẫn xuất của axit betulinic có hoạt tính độc tế bào ung thư và ức chế tế bào HIV (11) (12) (13) ( ) ( ) ( ) ( )
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 25 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
1.4. Hoạt tính sinh học của một số loài thuộc chi Adenosma
- Tác dụng trên gan mật: Các loài thuộc chi Adenosma có tác dụng làm tăng
tiết dịch mật, thúc đẩy quá trình bài xuất dịch mật. Đồng thời giúp bảo vệ tế bào gan, tăng cường chức năng giải độc của gan, phòng chống tích cực tình trạng gan nhiễm mỡ [2], [3], [6].
- Tác dụng chống viêm: Các loài thuộc chi Adenosma có tác dụng giải nhiệt,
giảm đau, chống viêm. Tác dụng chống viêm ở giai đoạn cấp tính mạnh hơn mãn tính [2], [3], [6].
- Tác dụng kháng khuẩn: dịch chiết từ các loài thuộc chi Adenosma có khả
năng ức chế một số vi khuẩn như: tụ cầu vàng, trực khuẩn bạch hầu, thận, thương hàn, phó thương hàn, mủ xanh, E. Coli, lỵ, song cầu khuẩn gây viêm não, viêm phổi và một số loại nấm [2], [3], [6].
- Tác dụng trên tuần hoàn: làm hạ huyết áp, điều chỉnh rối loạn lipit máu,
cải thiện lưu lượng tuần hoàn nuôi tim và não [2], [3], [6].
- Ứng dụng trên lâm sàng: Các loài thuộc chi Adenosma được sử dụng để
điều trị các bệnh viêm gan, truyền nhiễm cấp tính thể vàng da, vàng da tán huyết do thương hàn ở trẻ sơ sinh, giun chui ống mật, rối loạn lipit máu, thiểu năng mạch vành, viêm loét miệng, nấm da,...[2], [3], [6].
Các tác dụng trên đã được nghiên cứu và ứng dụng thực tế để chữa bệnh trong y học cổ truyền từ rất lâu. Một số nghiên cứu đã được tiến hành đối với các loài thuộc chi Adenosma ở Việt Nam.
1.5. Tác dụng dƣợc lý của một số loài thuộc chi Adenosma ở Việt Nam
1.5.1. Tácdụng dƣợc lý của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr.
Tên đông y còn gọi là Nhân trần đực, hay Nhân trần Bồ bồ. Năm 1939 Guichard và Clemensat nghiên cứu tác dụng của nước cất loài Adenosma
indiana (Lour.) Merr. (ngâm tinh dầu với nước trong vài giờ) trên giun
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 26 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Nước bão hòa tinh dầu có tác dụng mạnh hơn nước cất của loài Adenosma
indiana (Lour.) Merr. Đối với giun đũa (Ascaris) cũng có hiện tượng như trên
nhưng yếu hơn và con giun chỉ chết sau 2 đến 3 giờ. Đối với giun móc câu con giun chết ngay sau 10 đến 15 phút. Thí nghiệm độ độc trên thỏ, với liều cao hơn tinh dầu giun thường dùng cho người cũng không thấy hiện tượng ngộ độc nào. Hai tác giả đã đi tới kết luận: Có thể dùng tinh dầu của loài
Adenosma indiana (Lour.) Merr. làm thuốc tẩy giun [6].
Về tác dụng thông mật của hai loài Adenosma caeruleum R.Br và
Adenosma indiana (Lour.) Merr. Việt Nam theo như kinh nghiệm dùng trong
dân gian. Năm 1957, Lê Tùng Châu (Viện dược liệu Hà Nội) và Nguyễn Viết Tựu (PV dược liệu TP. Hồ Chí Minh) đã nghiên cứu tác dụng dược lý của loài
Adenosma caeruleum R.Br và loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. và loài
Adenosma bracteosa Bonati đã có kết quả: loài Adenosma indiana (Lour.) Merr
làm tăng tiết mật rõ rệt ở cả 3 lô thí nghiệm (cao etanol 400, cao nước và tinh dầu). Tác dụng mạnh nhất ở cao etanol, tác dụng tăng thải độc của gan chỉ có ở cao etanol và tinh dầu [6].
Loài Adenosma indiana (Lour.) Merr có tác dụng kháng khuẩn trên nhiều
loại vi khuẩn mạnh nhất là trên 2 chủng trực khuẩn lỵ (Sh. Dyénteriae 111 và Sh. Shigae 39) và 2 chủng cầu khuẩn (Staphylococcus aureus 109P và Streptococcus
hemolyticus S84). Tác dụng kháng khuẩn mạnh nhất ở cao etanol và cao nước,
yếu ở tinh dầu.
Loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. có tác dụng rõ rệt làm giảm tiết dịch vị, giảm độ axit tự do và axit toàn phần của dịch vị, làm giảm loét dạ dày của thực nghiệm.
Độc tính của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. không đáng kể, với liều có tác dụng dược lý, dùng liên tục trong thời gian dài không thấy biểu hiện nhiễm độc thuốc. Với liều cao hơn liều tác dụng 20 lần không làm súc vật chết [6].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 27 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
1.5.2.Tác dụng dƣợc lý của loài Adenosma caeruleum R. Br.
Tên đông y là Nhân trần hoặc Nhân trần nam. Loài Adenosma caeruleum R. Br. có tác dụng tăng tiết mật và tăng thải độc của gan. Nhưng so sánh tác dụng lên gan, mật của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. và loài Adenosma
caeruleum R. Br. thì tác dụng của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. mạnh
hơn. Loài Adenosma caeruleum R. Br. cũng có tác dụng chống viêm. Loài
Adenosma caeruleum R. Br. và loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. có tác dụng
chống viêm tương đương ở mô hình phù caolin và teo tuyến ức nhưng đối với mô hình u hạt thì loài Adenosma caeruleum R. Br. chưa bằng 1/2 của loài
Adenosma indiana (Lour.) Merr. Trên phù caolin với liều 15g/kg thể trọng thì ức
chế phù của loài Adenosma caeruleum R. Br. lại giảm [6].
Tác dụng kháng khuẩn của loài Adenosma caeruleum R. Br. kém hơn so với loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. nhất là với trực khuẩn lỵ. Nhưng loài Adenosma
caeruleum R. Br. ức chế mạnh hơn với Staphyllococcus và Steptococcus [6].
Loài Adenosma caeruleum R. Br. tác dụng không rõ rệt lên tiết dịch vị: không giảm loét dạ dầy, không giảm tiết vị, có làm giảm axit tự do và axit toàn phần tuy nhiên hai tác dụng này lại giảm khi dùng liều cao [6].
1.5.3. Tác dụng dƣợc lý của loài Adenosma bracteosum Bonati.
Tên đông y là Nhân trần tía. Dịch chiết etanol 900
có độc tính cao hơn dịch nước sắc loài Adenosma bracteosum Bonati. Với liều lượng 300mg/kg thể trọng dịch chiết nước không thấy chuột lang chết. Làm tăng lượng tiết mật trên chuột lang. Lượng mật tăng gần 25% so với lô đối chứng [6].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 28 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Mẫu phần thân của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr được thu hái tại huyện Đại Từ-tỉnh Thái Nguyên vào tháng 4 và 5 năm 2014 do chuyên gia thực vật học Nguyễn Thế Anh, Viện Hóa học-Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam xác định tên khoa học.
2.2. Hóa chất, thiết bị 2.2.1. Hóa chất 2.2.1. Hóa chất
2.2.1.1. Hóa chất dùng để phân lập các chất từ phần thân của loài Adenosma
indiana (Lour.) Merr .
Sử dụng các dung môi n–hexan, etyl axetat, butanol, metanol để ngâm chiết mẫu.
Sắc ký bản mỏng phân tích: sử dụng bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel 60 F254, Merck, có độ dày 0,2 mm.
Sắc ký cột thường: sử dụng silicagel cỡ hạt 197–400 mesh (0,040–0,063 mm). Sắc ký cột nhanh: sử dụng silicagel cỡ hạt 70–200 mesh.
Bản mỏng: được kiểm tra bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng ngắn và dài (254; 365 nm), sau đó hiện màu bằng thuốc thử vanilin–H2SO4 (vanilin 1,2 g; MeOH 200 mL; CH3COOH 25 mL; H2SO4 11 mL), hơ nóng trên bếp điện cho đến khi các vệt trên bản mỏng hiện màu rõ nhất.
Các dung môi n–hexan, etyl axetat, điclometan và metanol đều được cất lại qua cột Vigreux trước khi sử dụng để chạy sắc ký cột và sắc ký bản mỏng.
2.2.1.2. Hóa chất dùng để thử hoạt tính sinh học từ phần thân của loài
Adenosma indiana (Lour.) Merr.
Động vật: chuột BALB/c khoẻ mạnh
Hoá chất: Trolox (Sigma Aldrich), Dimetylsulfoside (DMSO) (Fisher Scientific), Kali clorid 1,15% (KCl), Axit tricloaxetic (TCA), Axit thiobarbituric (TBA) (Sigma Aldrich), Yeast α-glucosidase và p-nitrophenyl-α-D-
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 29 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
glucopyranoside (pNPG) (Sigma Aldrich) và các dung môi thông thường khác.
2.2.2. Thiết bị
Máy cất quay chân không, các thiết bị phụ trợ cho thí nghiệm phân lập chất hữu cơ.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được ghi trên máy Bruker Avance 500 MHz tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Phổ khối ESI-MS được đo trên máy FT-ICR-MS.
Đĩa 96 giếng, pipet, eppendorf và các thiết bị phụ trợ khác. Cân phân tích, máy đo OD Microplate Reader.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu xác định sự phân bố các loài của chi Adenosma trên địa bàn huyện Đại Từ- tỉnh Thái Nguyên
Chúng tôi tiến hành khảo sát thực địa, thu thập thông tin, thu hái tiêu bản, gồm cả phần rễ, lá, thân, hoa của các loài Adenosma trên địa bàn các xã: Quân Chu, Cát Nê, K ý Phú, Vạn Thọ, Văn Yên, Mỹ Yên, La Bằng, Bản Ngoại, An khánh, Khôi Kỳ, Tiên Hội, Bình Thuận,...thuộchuyện Đại Từ- tỉnh Thái Nguyên vào thời điểm cây phát triển trong năm là từ tháng 4 tới 8 năm 2014.
Mẫu tiêu bản được ghi vùng, thời điểm và được định danh và khẳng định loài bởi chuyên gia thực vật học Nguyễn Thế Anh, Viện Hóa học- Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam.
2.4. Phƣơng pháp xử lý mẫu thực vật, chiết tách và xác định cấu trúc các chất phân lập đƣợc
2.4.1. Xử lý mẫu thực vật
Mẫu thân cây Bồ bồ được thu hái tại các xã: Cát Nê, K ý Phú, Mỹ Yên thuộc huyện Đại từ, tỉnh Thái Nguyên (tháng 4-5 năm 2014). Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, sau khi hong gió 3-4 giờ, xử lý diệt men mẫu bằng cách hấp nguyên liệu bởi hơi etanol 700
trong 3-4 phút. Nguyên liệu sau diệt men tiếp tục xử lý để có mẫu tươi và mẫu khô.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 30 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Khi chiết mẫu tươi, phần thân mẫu sau khi diệt men sẽ chiết nước ngay. Khi chiết mẫu khô thì sấy khô trên máy sấy mẫu thực vật ở 400C, xay nhỏ và tiến hành ngâm chiết trong dung môi.
2.4.2. Chiết tách các chất
- Mẫu phần thân của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. được rửa sạch, hong khô tự nhiên, sấy khô bằng thiết bị sấy thực vật ở nhiệt độ 40oC, xay nhỏ và ngâm chiết với metanol (4x24 giờ) ở nhiệt độ phòng. Quay cất dung môi dưới áp suất giảm thu được cặn chiết metanol. Thêm 50 ml nước, khuấy đều và chiết lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, etyl axetat, butanol. Sau đó lọc và gộp các dịch chiết của từng loại dung môi với nhau, quay cất dung môi dưới áp suất giảm thu được các cặn chiết tương ứng.
- Phân lập cặn chiết etyl axetat thu được bằng phương pháp sắc ký cột trên silicagel với các hệ dung môi thích hợp.
2.4.3. Xác định cấu trúc các chất
Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng sự kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1
H-NMR, 13C-NMR, DEPT).
2.5. Phƣơng pháp xác định hoạt tính sinh học từ dịch chiết nƣớc phần thân của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. dạng tƣơi và dạng khô.
2.5.1. Xác định khả năng ức chế peroxy hoá lipid (thử nghiệm MDA)
Được thực hiện theo phương pháp của Stroev EA, Makarova VG (1998) và của Viện Dược liệu - Bộ Y Tế (2006) có một vài hiệu chỉnh nhỏ. Xác định khả năng ức chế peroxy hoá lipid của mẫu nghiên cứu qua việc xác định hàm lượng malonyl diandehit (MDA), là sản phẩm của quá trình peroxy hoá lipid màng tế bào. MDA có khả năng phản ứng với axit thiobarbituric để tạo thành phức hợp trimethin (có màu hồng) có đỉnh hấp thu cực đại ở λ = 532 nm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 31 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của hoạt chất nghiên cứu được thực hiện theo phương pháp của Moradi-Afrapoli F và cộng sự.
2.6 . Thực nghiệm
2.6.1. Quá trình phân lập các chất từ phần thân của loài Adenosma indiana
(Lour.) Merr.
2.6.1.1. Chiết, tách mẫu phần thân của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr.
Quy trình chiết mẫu phần thân của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. (1,05 kg) được nêu trong sơ đồ 2.1.
Mẫu phần thân của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr. đã sấy khô, nghiền nhỏ (1,05 kg) được ngâm chiết với metanol ở nhiệt độ phòng (4 lần). Quay cất dung môi dưới áp suất giảm, cặn thu được được thêm 50 ml nước. Sau đó, được chiết lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, etyl axetat và butanol (4 lần đối với mỗi loại dung môi). Cất loại dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 40oC thu được các cặn chiết có khối lượng tương ứng là: 6,12 g cặn chiết n–hexan; 8,35 g cặn chiết etyl axetat và 11,47 g cặn chiết butanol.
2.6.1.2. Phân lập các chất từ cặn chiết etyl axetat
Kiểm tra trên sắc ký bản mỏng chúng tôi thấy dịch chiết etyl axetat khả thi nên tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học trên dịch etyl axetat. Quá trình phân lập các chất từ cặn chiết etyl axetat thân của loài Adenosma indiana
(Lour.) Merr. được trình bày theo sơ đồ 2.1.
Từ 8,35 g cặn chiết etyl axetat được hòa tan vừa đủ bằng hỗn hợp dung môi CH2Cl2/MeOH và trộn với 20 g silicagel, quay cất đến khô, sau đó nghiền thành bột mịn để các chất hấp phụ đều trên silicagel. Bột silicagel có tẩm dịch chiết này được sử dụng để đưa lên cột sắc ký.
Silicagel Merck (cỡ hạt 0,043-0,063 mm; 200 g) được nhồi vào cột sắc ký có kích thước 5cm x 27cm theo phương pháp nhồi ướt với dung môi ban đầu là