2. Mục tiêu nghiên cứu
2.4.2.Phương pháp kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh vật
2.4.2.1. Xác ựịnh tổng số vi sinh vật hiếu khắ trong thịt ựông lạnh nhập khẩu theo TCVN 4884 : 2005.
Nguyên lý:
Trên môi trường thạch PCA trong ựiều kiện hiếu khắ ở 30oC sau 24 - 72 h, các vi sinh vật hiếu khắ có khả năng phát triển và hình thành những khuẩn lạc riêng rẽ. Do ựó, có thể ựếm số khuẩn lạc trên môi trường thạch PCA ựể xác ựịnh số lượng vi sinh vật có chứa trong 1gam mẫu phân tắch và ựược biểu diễn dưới dạng số ựơn vị hình thành khuẩn lạc CFU trong một ựơn vị khối lượng thực phẩm.
Cách tiến hành: Dùng phương pháp ựổ ựĩa.
Với mỗi mẫu xét nghiệm phải nuôi cấy ắt nhất ở 3 ựộ pha loãng liên tiếp, mỗi ựộ pha loãng ựược cấy trên 2 ựĩa petri vô trùng.
Dùng pipet vô trùng chuyển 1 ml dung dịch mẫu ở các ựộ pha loãng tương ứng vào giữa các ựĩa petri trống vô trùng.
Rót vào mỗi ựĩa khoảng 15 ml môi trường Plate Count Agar (PCA) ựã ựun tan chảy và ựược làm nguội ựến nhiệt ựộ 44 - 47oC. Xoay nhẹ ựĩa theo chiều kim ựồng hồ hoặc lắc sang trái và phải một cách nhẹ nhàng ựể cho mẫu tan ựều vào môi trường.
đặt ựĩa trên mặt phẳng ngang ựể thạch ựông tự nhiên ở nhiệt ựộ phòng, lật úp các ựĩa và ựặt vào tủ ấm 30oC nuôi ấm ựến 72 h.
Tắnh kết quả:
Chọn tất cả các ựĩa có khuẩn lạc mọc riêng rẽ và có số khuẩn lạc nằm trong khoảng từ 15 ựến 300 khuẩn lạc/ựĩa ựể ựếm. độ pha loãng càng cao thì số khuẩn lạc càng ắt do ựó sự phân bố khuẩn lạc trên các ựĩa nuôi cấy phải hợp lý. Nếu kết quả
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26
không hợp lý thì phải tiến hành các bước nuôi cấy lại.
Tổng số vi sinh vật hiếu khắ trong 1g mẫu ựược tắnh theo công thức:
Trong ựó:
X: TSVSVHK trong 1 gam thịt (CFU/g)
C: Tổng số khuẩn lạc ựếm ựược trên các ựĩa ở 2 ựộ pha loãng liên tiếp. n1: Là số ựĩa ở ựộ pha loãng thứ nhất ựược ựếm.
n2: Là số ựĩa ở ựộ pha loãng thứ 2 ựược ựếm.
d : Hệ số pha loãng với ựộ pha loãng thứ nhất ựược ựếm.
- Nếu các ựĩa của 2 ựộ pha loãng liên tiếp có số khuẩn lạc từ 15-30, tắnh số khuẩn lạc của mỗi ựộ pha loãng và kết quả là trung bình số học của 2 giá trị thu ựược.
- Nếu 2 ựĩa nuôi cấy ứng với ựộ pha loãng 10-1 có số khuẩn lạc < 15 thì:
- Nếu 2 ựĩa nuôi cấy ở ựộ pha loãng 10-1 không có khuẩn lạc nào thì:
Với: m là trung bình của số khuẩn lạc ở 2 ựĩa.
d là ựộ pha loãng của huyễn dịch ban ựầu, d = 10-1.
Cách biểu thị kết quả: Số thập phân từ 1.00 ựến 9.99 nhân với số mũ tương ứng, vắ dụ 1,56ừ104 CFU/g.
2.4.2.2. Xác ựịnh Escherichia coli trong thịt ựông lạnh nhập khẩu theo TCVN 7924- 2 : 2008.
Nguyên lý:
E. coli dương tắnh - glucuronidaza. Vi khuẩn ở nhiệt ựộ 44ồC hình thành các khuẩn lạc màu xanh ựiển hình trên môi trường trypton - mật - glucuronid (TBX). Dựa vào ựặc tắnh này ta có thể phát hiện và ựịnh lượng ựược vi khuẩn E. coli.
Cách tiến hành:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 27
môi trường. Dùng pipet vô trùng chuyển 1 ml dung dịch mẫu ở các ựộ pha loãng tương ứng vào giữa các ựĩa petri vô trùng. Rót vào mỗi ựĩa khoảng 15ml môi trường TBX ựã ựun tan chảy và ựược làm nguội ựến nhiệt ựộ 44 - 47ồC. Xoay nhẹ ựĩa theo chiều kim ựồng hồ hoặc lắc sang hai bên ựể cho mẫu tan ựều vào môi trường, ựể ựông tự nhiên ở nhiệt ựộ phòng trên mặt phẳng nằm ngang. Lật ngược các ựĩa, nếu cần ủ ấm các ựĩa này ở 37ồC/4h sau ựó chuyển sang ủ ấm ở 44ồC/18 - 24h.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tắnh kết quả:
Chọn các ựĩa có chứa ắt hơn 150 khuẩn lạc ựiển hình của E. coli dương tắnh glucuronidaza và ắt hơn 300 khuẩn lạc tổng số trên mỗi ựĩa thạch
Số lượng khuẩn lạc E. coli trong 1 gam mẫu thử ựược tắnh theo công thức:
Trong ựó:
N: Số khuẩn lạc E. coli trong 1 gam thịt (CFU/g)
a: Là tổng số các khuẩn lạc ựếm ựược trên tất cả các ựĩa ựược giữ lại sau 2 ựộ pha loãng liên tiếp, có ắt nhất 1 ựĩa chứa tối thiểu 15 CFU màu xanh.
n1: Số ựĩa ựược giữ lại ở ựộ pha loãng thứ nhất n2: Số ựĩa ựược giữ lại ở ựộ pha loãng thứ hai
V: Thể tắch mẫu cấy ựã dùng trên mỗi ựĩa, tắnh bằng ml
d: Hệ số pha loãng tương ứng với ựộ pha loãng thứ nhất ựược giữ lại (d = 1 trong trường hợp các mẫu ở dạng lỏng khi mẫu thử ựược cấy trực tiếp).
-Nếu ựĩa chứa ắt hơn 10 khuẩn lạc, nhưng có ắt nhất 4 khuẩn lạc, thì tắnh kết quả theo trường hợp chung ở trên và báo cáo kết quả là số ước tắnh nhân với VSV trong 1ml hoặc 1g sản phẩm.
-Nếu tổng số khuẩn lạc từ 3 ựến 1, thì ựộ chụm của kết quả là quá thấp và kết quả phải ựược ghi như sau: ỘCó mặt vi sinh vật nhưng nhỏ hơn (4 ừ d) trên 1g hoặc 1mlỢ.
-Trong trường hợp ở nồng ựộ ựầu tiên không có khuẩn lạc ựặc trưng nào mọc lên thì tổng số E. coli ựược biểu thị kết quả như sau: Ộắt hơn 1/d vi sinh vật trong 1mlỢ (sản phẩm dạng lỏng) hoặc Ộ ắt hơn 1/d vi sinh vật trong gamỢ (sản phẩm dạng khác). Với d là hệ số pha loãng mẫu của huyền phù ban ựầu hoặc ựộ pha loãng thứ nhất ựã cấy hoặc giữ lại.
2.4.2.3. định tắnh vi khuẩn Salmonella trong thịt ựông lạnh nhập khẩu theo TCVN 4829 : 2005.
Nguyên lý:
Quá trình phát hiện Salmonella trong thực phẩm cần qua 4 giai ựoạn kế tiếp nhau: (1) Tăng sinh sơ bộ mẫu ựã ựược ựồng nhất ựể ựảm bảo phát hiện một lượng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 29
nhỏ hoặc Salmonella ựã bị suy giảm hoạt tắnh → (2) Tăng sinh chọn lọc ở môi trường lỏng → (3) Phân lập nhằm tách và nhận dạng Salmonella khỏi các quần thể vi sinh vật khác trong mẫu → (4) Khẳng ựịnh ựặc tắnh sinh hóa, huyết thanh học. Một số môi trường ựặc ựổ ựĩa sử dụng ựể phân lập Salmonella như: thạch XLD, HE, ... Mỗi môi trường giúp nhận dạng các loài thuộc giống này dựa trên các ựặc tắnh sinh hoá ựặc trưng tương ứng.
Cách tiến hành:
-Tăng sinh sơ bộ: Cân 25g mẫu trung bình ựã cắt nhỏ vào túi PE vô trùng chuyên dụng, bổ sung thêm 225ml dung dịch ựệm peptone, ựồng nhất bằng máy dập mẫu Stomacher ở tốc ựộ 260 vòng/phút trong 1 phút thu huyễn dịch có nồng ựộ 10-
1
.Ủ huyễn dịch mẫu ựã ựồng nhất ở ựộ pha loãng 10-1 trong tủ ấm 37ồC/18ổ2h.
-Tăng sinh chọn lọc: Tiến hành trên 2 môi trường RVS và MKTTn
Chuyển 0,1ml dung dịch tiền tăng sinh vào ống nghiệm chứa 10ml môi trường RVS, ủ ở 41,5ồC/24h.
Chuyển 1ml dung dịch tiền tăng sinh vào ống chứa 10ml môi trường MKTTn, ủ 37ồC/24h.
-Phân lập trên môi trường ựặc chọn lọc và nhận dạng:
Sau khi ủ, sử dụng dịch tăng sinh chọn lọc trên ria cấy lên bề mặt thạch ựĩa XLD và HE.
Lật úp các ựĩa ựặt trong tủ ấm 37ồC/24h.
-Khẳng ựịnh:
Nếu trên môi trường XLD hình thành khuẩn lạc màu hồng, trung tâm khuẩn lạc màu ựen thì nghi là Salmonella.
Nếu trên môi trường HE hình thành khuẩn lạc màu ựen thì nghi là (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Salmonella.
đánh dấu các khuẩn lạc Salmonella nghi trên mỗi ựĩa. Ria cấy khuẩn lạc ựiển hình trên lên bề mặt ựĩa thạch máu. Ủ ấm ở 37ồC/24h ựể thu ựược khuẩn lạc thuần nhất. Các khuẩn lạc thuần này ựược dùng ựể ựể khẳng ựịnh các tắnh chất sinh vật hoá học trên hệ thống VITEK 2 compact và làm phản ứng huyết thanh học (HTH) với kháng huyết thanh O, H ựa giá. Trước khi làm phản ứng HTH cần kiểm tra khả
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30
năng tự ngưng kết của vi khuẩn. Nếu phản ứng tự ngưng kết âm tắnh ta tiếp tục tiến hành phản ứng ngưng kết với KHT O, H.
2.4.2.4. Xác ựịnh Staphylococcus aureus trong thịt ựông lạnh nhập khẩu theo TCVN 4830-1 : 2005
Nguyên lý:
Vi khuẩn Staphylococci phát triển tốt trên môi trường BP tạo khuẩn lạc màu ựen, tròn, lồi, bờ ựều, bóng và có vòng trong suốt ở xung quanh do sự chuyển hóa của muối telorite de potassium và sự dung giải protein lòng ựỏ trứng. Qua ựó có thể ựếm số lượng vi khuẩn dựa trên số khuẩn lạc mọc trên môi trường nuôi cấy.
Việc khẳng ựịnh vi khuẩn Staphylococci (S. aureus và các loài khác) dựa trên phản ứng ựông huyết tương thỏ (coagulase).
Cách tiến hành:
Phân lập (cấy láng trên bề mặt thạch)
Sử dụng 6 ựĩa môi trường BP ựể nuôi cấy ở 3 ựậm ựộ pha loãng 10-1; 10-2; 10-3, mỗi ựộ pha loãng nuôi cấy trên 2 ựĩa môi trường. Hút 0,1ml dung dịch mẫu ở mỗi ựộ pha loãng khác nhau lên bề mặt của các ựĩa thạch. Sử dụng dụng cụ dàn mẫu dàn chất cấy trên bề mặt các ựĩa thạch, ựể khô trong 15 phút ở nhiệt ựộ phòng. Lật ngược các ựĩa và ủ ở 37oC/24h, ựếm số lượng khuẩn lạc ựiển hình trên mỗi ựĩa thạch, ựánh dấu vị trắ các khuẩn lạc ựiển hình. Ủ tiếp ở 37oC/24h, sau ủ ựánh dấu vị trắ các khuẩn lạc ựiển hình mới và các khuẩn lạc không ựiển hình.
Phép thử coagulase:
Chọn các ựĩa có từ 15 ựến 150 khuẩn lạc riêng biệt. Từ mỗi ựĩa chọn 5 khuẩn lạc ựiển hình hoặc 5 khuẩn lạc không ựiển hình (nếu chỉ có một loại khuẩn lạc) hoặc 5 khuẩn lạc ựiển hình và 5 khuẩn lạc không ựiển hình (nếu chứa cả 2 loại khuẩn lạc). Từ mỗi khuẩn lạc ựã chọn dùng que cấy vô trùng lấy 1 phần chuyển vào môi trường canh thang não - tim (BHI), ựem ủ ở 37ồC/24h.
Sau ủ lấy 0,1ml mỗi dịch cấy vô trùng cho vào 0,3 ml huyết tương thỏ, ủ ở 37ồC, sau 4 - 6h kiểm tra sự ựông huyết tương. Nếu phản ứng âm tắnh, kiểm tra lại sau ủ 24h. Phản ứng dương tắnh khi thể tắch kết dắnh chiếm hơn một nửa thể tắch ban ựầu của chất lỏng. Lấy khuẩn lạc ựiển hình có phản ứng catalase (+), coagulase
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 31
(+) cấy trên môi trường thạch máu ựể thu ựược khuẩn lạc thuần nhất.
Tắnh kết quả:
Tắnh số lượng vi khuẩn S. aureus/gam sản phẩm như sau:
- đối với các ựĩa có chứa tối ựa 300 khuẩn lạc, có 150 khuẩn lạc ựiển hình và/hoặc không ựiển hình, trên mỗi ựĩa thạch ựã chọn ở 2 ựộ pha loãng liên tiếp thì số lượng vi khuẩn S. aureus ựược tắnh theo công thức:
Trong ựó:
a : Số lượng vi khuẩn S. aureus ở 2 nồng ựộ pha loãng liên tiếp ựược chọn Ac : là số lượng khuẩn lạc ựiển hình ựã qua phép thử coagulase
Anc: là số lượng khuẩn lạc không ựiển hình ựã qua phép thử coagulase
bc : là số lượng khuẩn lạc ựiển hình cho thấy có phản ứng dương tắnh với coagulase
bnc : là số khuẩn lạc không ựiển hình cho thấy có phản ứng dương tắnh với coagulase
cc : là tổng số khuẩn lạc ựiển hình nhìn thấy trên ựĩa cnc : là tổng số khuẩn lạc không ựiển hình nhìn thấy trên ựĩa
Số lượng vi khuẩn S. aureus/1g sản phẩm ựược tắnh theo công thức:
Trong ựó:
∑a : là tổng số khuẩn lạc có phản ứng dương tắnh với coagulase ựã nhận biết trên tất cả các ựĩa ựã chọn.
V : là thể tắch của chất cấy trên mỗi ựĩa, tắnh bằng mililit n1: là số ựĩa ựã ựược chọn ở ựộ pha loãng thứ nhất n2: là số ựĩa ựã ựược chọn ở ựộ pha loãng thứ 2
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 32 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Nếu hai ựĩa tương ứng với 2 mẫu thử hoặc huyền phù ban ựầu, mỗi ựĩa ắt hơn 15 khuẩn lạc thì kết quả tắnh như sau:
Trong ựó:
a: Tổng số khuẩn lạc Staphylococcus có phản ứng dương tắnh với coagulase nhận biết trên hai ựĩa ựã chọn.
d: Hệ số pha loãng của huyền phù ban ựầu. V : Thể tắch cấy trên mỗi ựĩa
Nếu hai ựĩa, tương ứng với mẫu thử hoặc huyền phù ban ựầu không chứa bất kì một khuẩn lạc Staphylococcus nào có phản ứng dương tắnh với coagulase thì báo cáo kết quả như sau: ỘÍt hơn 1/d Staphylococci có phản ứng dương tắnh với coagulase trong 1 gam sản phẩm, trong ựó d là hệ số pha loãng của huyền phù ban ựầuỢ.
2.4.2.5. Xác ựịnh tổng số vi khuẩn Clostridium perfringens trong thịt ựông lạnh nhập khẩu theo TCVN 4991:2005.
Nguyên lý:
Vi khuẩn C. perfringens yếm khắ tuyệt ựối, hình thành dạng khuẩn lạc ựặc trưng màu ựen trong môi trường TSC ở ựiều kiện yếm khắ. Do ựó, có thể ựếm số khuẩn lạc mọc trong môi trường và từ ựó xác ựịnh số lượng vi khuẩn có mặt trong mẫu phân tắch.
Cách tiến hành:
-Phân lập:
Cấy ở 3 ựộ pha loãng 10-1; 10-2; 10-3, mỗi ựộ pha loãng nuôi cấy trên 2 ựĩa môi trường. Dùng pipet vô trùng chuyển 1ml huyễn dịch mẫu ở các ựộ pha loãng tương ứng vào các ựĩa petri vô trùng. Rót 10 - 15ml môi trường thạch TSC ựược duy trì ở 44ồC - 47ồC vào giữa ựĩa petri, xoay nhẹ ựĩa ựể trộn ựều dịch cấy vào môi trường, ựể môi trường ựông tự nhiên ở nhiệt ựộ phòng. Phủ thêm một lớp khoảng 10 ml môi trường thạch TSC lên bề mặt các ựĩa thạch TSC ựã ựông trên, ựể ựĩa thạch ựông tự nhiên trên bề mặt nằm ngang. đặt các ựĩa vào bình nuôi cấy yếm khắ, dùng các pack yếm khắ (anaerobical pack) ựể tạo ựiều kiện yếm khắ. Ủ ở 37ồC/18 - 20h. đếm các ựĩa thạch
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 33
chứa ắt hơn 150 khuẩn lạc màu ựen, chọn 5 khuẩn lạc ựiển hình ựể khẳng ựịnh sinh hóa. -Khẳng ựịnh sinh hóa: Sử dụng môi trường Lactose sulfite (LS)
Cấy từng khuẩn lạc ựiển hình ựã chọn vào môi trường Thioglycolate lỏng, ủ kỵ khắ ở 37ồC/18 - 24h. Sau thời gian ủ, chuyển ngay 5 giọt dịch cấy trong môi trường thioglycolate cấy vào môi trường LS, ủ hiếu khắ ở 46oC/18 - 24h. Các ống dương tắnh có hiện tượng sinh khắ và kết tủa ựen của sắt sulfit. Vi khuẩn hình thành khuẩn lạc ựiển hình màu ựen trên môi trường thạch SC và ựược khẳng ựịnh dương tắnh với môi trường LS ựược coi là C. perfringens.
-Tắnh kết quả:
đếm số khuẩn lạc ựiển hình trên các ựĩa petri của 2 ựộ pha loãng liên tiếp có số khuẩn lạc không quá 150.
Số vi khuẩn C. perfringens trong 1 gam thịt ựược tắnh theo công thức:
Trong ựó:
C: Tổng số khuẩn lạc ựếm ựược trên tất cả các ựĩa ở 2 ựộ pha loãng liên tiếp. X: Số vi khuẩn C. perfringenstrong 1 gam thịt (CFU/g)
n1: là số ựĩa ở ựộ pha loãng thứ nhất ựược ựếm. n2: là số ựĩa ở ựộ pha loãng thứ 2 ựược ựếm.
d : hệ số pha loãng với ựộ pha loãng thứ nhất ựược ựếm.
Nếu các ựĩa của 2 ựộ pha loãng liên tiếp có số khuẩn lạc từ 15 - 30, tắnh số khuẩn lạc của mỗi ựộ pha loãng và kết quả là trung bình số học của 2 giá trị thu ựược.
Nếu 2 ựĩa nuôi cấy ứng với ựộ pha loãng 10-1 có số khuẩn lạc < 15 thì:
Nếu 2 ựĩa nuôi cấy ở ựộ pha loãng 10-1 không có khuẩn lạc nào thì:
Với: m là trung bình của số khuẩn lạc ở 2 ựĩa
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 34