2. Mục tiêu nghiên cứu
1.8. Kỹ thuật Real-Time PCR
Realtime PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuyếch ựại DNA ựắch hiển thị ựược ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng. Như vậy có thể nói Realtime PCR là kỹ thuật nhân bản DNA ựắch trong ống nghiệm thành hàng tỷ bản sao dựa vào các chu kỳ nhiệt và kết quả khuyếch ựại trong ống phản ứng ựược hiển thị cùng lúc với phản ứng khuyếch ựại xảy ra ựể người làm thắ nghiệm có thể thấy ựược. Do ựặc ựiểm này nên người làm thắ nghiệm không cần thiết phải làm tiếp các thao tác sau ựó ựể phát hiện sản phẩm nhân bản (ựiện di sản phẩm PCR trên gel agarose hoặc lai với các ựoạn dò ựặc hiệu trên màng, giếng, Ầ).
Real-time PCR là một cải biên của phương pháp PCR dựa trên chức năng 5Ỗ- 3Ỗ polymerase của Taq DNA polymerase do Holland và cộng sự công bố năm 1991. Trong phản ứng real-time PCR, người ta thường sử dụng hai tác nhân phát huỳnh quang bao gồm tác nhân gắn vào DNA mạch ựôi (Ethidium Bromide, SYBR Green, EvaGreen ...) hoặc tác nhân dùng ựánh dấu mẫu dò ựặc hiệu (FAM, HEX ...).
Tác nhân liên kết với mạch ựôi DNA. Trong phản ứng, khi có sự hiện diện của các sản phẩm DNA mạch ựôi do quá trình nhân bản thì các tác nhân liên kết với DNA mạch ựôi như SYBR Green sẽ liên kết với các sản phẩm vừa ựược tạo ra này và phát tắn hiệu huỳnh quang mạnh mẽ hơn (so với trạng thái tự do trong dung dịch). Loại tác nhân huỳnh quang này có thể sử dụng ựược cho mọi trình tự ựắch nên chi phắ sẽ thấp; nhưng ựộ ựặc hiệu của sản phẩm phải ựược kiểm tra chặt chẽ thông qua một bước phân tắch bổ sung sau khi phản ứng nhân bản kết thúc Ờ phân tắch ựường cong nóng chảy (Melting curve analysis).
Tác tác nhân dùng ựánh dấu mẫu dò ựặc hiệu rất ựa dạng như FAM, TAMRA, Texas Red, Cy3, Cy5, Ầ, ựược sử dụng với nhiều loại mẫu dò khác nhau: (1) Mẫu dò lai (hybridization probe): gồm hai mẫu dò có vị trắ bắt cặp gần nhau trên mạch khuôn và một hoặc hai mồi (primer). Các mồi cho phép nhân bản trình tự ựắch trong phản ứng PCR. Mẫu dò phắa ựầu có mang nhóm hùynh quang ở ựầu 3Ỗ còn mẫu dò phắa ựuôi mang nhóm huỳnh quang ựầu 5Ỗ. Khi 2 mẫu dò bắt cặp trên cùng một trình tự DNA, nhóm hùynh quang ỘchoỢ (donor dye) và nhóm ỘnhậnỢ
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 20
(acceptor dye) trên 2 mẫu dò sẽ gây ra hiệu ứng FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Hiệu ứng này ựược ghi nhận mỗi khi có sự bắt cặp của mẫu dò 5Ỗ và mẫu dò 3Ỗ lên những trình tự mới ựược tạo thành trong quá trình PCR.
(2) Mẫu dò thủy giải (Hydrolysis probe) với vắ dụ thông dụng nhất là TaqMan probe (còn gọi là kỹ thuật 5Ỗ nuclease). Mẫu dò ựược ựánh dấu ựầu 5Ỗ bằng nhóm phát huỳnh quang (reporter dye), và ựầu 3Ỗ bằng nhóm dập tắt huỳnh quang (quencher dye). Nhóm ỘdậpỢ sẽ ngăn sự phát huỳnh quang của nhóm ỘphátỢ khi mẫu dò ở trạng thái nguyên vẹn. Trong quá trình tổng hợp mạch mới, hoạt tắnh 5Ỗ exonuclease của Taq polymerase sẽ cắt rời nhóm ỘphátỢ khỏi mẫu dò, khiến nó không còn chịu tác ựộng của nhóm ỘdậpỢ. Lúc ựó nhóm ỘphátỢ sẽ phát tắn hiệu huỳnh quang và thiết bị tự ựộng ựược ghi nhận.
(3) Mẫu dò dạng Ộkẹp tócỢ (hairpin probe) ựiển hình như ỘMolecular beaconỢ: bao gồm một trình tự bổ sung ựặc hiệu với trình tự ựắch nằm giữa hai trình tự lặp lại ựảo ngược. Các nhóm ỘphátỢ (reporter) và ỘdậpỢ (quencher) ựược gắn vào hai ựầu mút của mẫu dò. Do ựó, sự phát huỳnh quang không xảy ra khi mẫu dò ở dạng tự do (cấu hình Ộkẹp tócỢ) trong dung dịch. Khi mẫu dò bắt cặp với trình tự ựắch, nó sẽ duỗi dài khiến hai nhóm ỘphátỢ và ỘdậpỢ tách xa. Lúc ựó, tắn hiệu huỳnh quang ựược phát ra và ghi nhận.
Trong mọi trường hợp vừa nêu, cường ựộ tắn hiệu huỳnh quang tỉ lệ thuận với hàm lượng sản phẩm ựắch ựang ựược nhân bản trong phản ứng. Các tắn hiệu huỳnh quang phát ra sẽ ựược các ựầu dò của máy luân nhiệt real-time PCR thu nhận và xử lý. Khi cường ựộ tắn hiệu huỳnh quang của mẫu vựơt qua ựường tắn hiệu huỳnh quang nền (base line) của phản ứng thì mẫu ựược xem là dương tắnh và người ta lấy thời ựiểm vượt qua ựó (biểu hiện qua giá trị chu kỳ ngưỡng Ờ Ct, Cycle Threshhold) ựể so sánh với một ựường cong chuẩn (standard curve) ựã biết ựể suy ra nồng ựộ trình tự DNA ựắch trong mẫu thử nghiệm ban ựầu. đường cong chuẩn ựược xây dựng từ chu kỳ ngưỡng của các mẫu chuẩn có chứa sản phẩm ựắch ựã biết trước nồng ựộ.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 21
định lượng nucleic acid là ứng dụng mạnh nhất của phương pháp này. Trong lĩnh vực chẩn ựoán bệnh, kỹ thuật real-time PCR ựược ứng dụng rộng rãi ựể phát hiện và ựịnh lượng các tác nhân gây bệnh ở người như virus, vi khuẩn, nấm phục vụ cho chẩn ựoán và theo dõi ựiều trị. Nhiều bộ kit thương mại hóa sử dụng mẫu dò thủy giải (Roche COBAS Taqman HBV test, Artus RealArt HBV PCR), mẫu dò lai (Roche Diagnostics), mẫu dò dạng Ộkẹp tócỢ (molecular beacon) (RealArt kit Ờ Cobett Research), HCV Quantitation ASR (Abbott).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22
Chương 2. NỘI DUNG - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU