- Thắ nghiệm 2: đánh giá ựặc tắnh kháng mốc sương thông qua lây
2.3.6. Phương pháp ựánh giá sự có mặt của các gen kháng bệnh mốc sương của các vật liệu bằng maker phân tử
sương của các vật liệu bằng maker phân tử
Các nghiên cứu gần ựây ựã phát hiện rằng loài khoai tây dại S. bulbocastanum là nguồn vật liệu chọn tạo giống rất tiềm năng, mang nhiều gen kháng nấm mốc sương Phytopthora insfestans, là các gen kháng không ựặc hiệu chủng cho hiệu quả kháng khá cao và bền vững.
bulbocastanum thuộc vùng lặp giàu leucine (NBS-LRR) ựược phát hiện và nhân dòng, bao gồm: Gen Rpi-blb1 (van der Vossen et al. 2003) hay còn ựược biết ựến với tên RB (Song et al. 2003), ựịnh vị trên nhiễm sắc thể số VIII, gần marker CT64 và thuộc một cụm 4 gen kháng tương ựồng (resistance gene analogues Ờ RGAs) (van der Vossen et al. 2003); gen Rpi-blb2(van der Vossen et al. 2005) nằm trên nhiễm sắc thể số VI gần marker CT119; gen
Rpi-blb3 (Lokosou et al. 2009) ựịnh vị trên nhiễm sắc thể số IV gần marker TG339 và nằm trong cụm gen kháng mốc sương ựặc hiệu chủng (R2, Rpi-abpt, R2-like); gen Rpi-bt1 (Oosumi et al. 2009) có ựược từ phép lai giữa S. bulbocastanum và S. tuberosum.
*Phương pháp chiết tách ADN
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp tách chiết và tinh sạch ADN tổng số của GS. Hans Ờ Joerg Jacobsen trường đại học Hannover (Phụ lục 3).
Sau khi tách chiết ADN xong tiến hành kiểm tra ựộ nguyên vẹn của ADN tổng số bằng ựiện di trên gel agarose 1%. Nếu ựạt yêu cầu thì thực hiện thắ nghiệm chạy phản ứng PCR với cặp mồi ựặc hiệu.
để phát hiện sự có mặt của gen kháng mốc sương, chúng tôi ựã sử dụng các cặp mồi sau:
Bảng 2.3: Các cặp mồi ựược sử dụng trong thắ nghiệm xác ựịnh sự có mặt của các gen kháng (Van der Vossen et al., 2003, 2005, 2009)
Mồi Trình tự Gene Tmo độ lớn ựoạn Nu ựược nhân Blb 1 F: AACCTGTATGGCAGTGGCATG R: GTCAGAAAAGGGCACTCGTG R pi-blb1 660C 820 bp 1/1Ỗ F: CACGAGTGCCCTTTTCTGAC R: ACAATTGAATTTTTAGACTT R pi-blb1 570C 213 bp Blb2 F: GGACTGGGTAACGACAATCC R: AGCACGAGTTCCCCTAATGC R pi-blb2 640C 773 bp Blb3 F: TGTCGCTGAAAGAGTAGGCC R: TATGGAGTGGCTTCTTGAAC R pi-blb3 620C 618 bp Thành phần cho 1 phản ứng PCR (phụ lục 4)
Chu trình nhiệt trong phản ứng PCR (phụ lục 4). điện di sản phẩm PCR:
Sau khi chạy PCR, chúng tôi tiến hành ựiện di sản phẩm PCR trên gel Agarose 1,2% ựược chuẩn bị với dung dịch TAE.
Sản phẩm ựược chạy với thiết bị ựiện di Mini-Sub Cell (Biorad), sử dụng dung dịch ựệm TAE ựiện di trong thời gian 30 phút ở hiệu ựiện thế 80V, cường ựộ dòng ựiện là 200mA.
Bản gel Agarose sau khi ựiện di sẽ ựược nhuộm Ethildium bromide trong 30 phút sau ựó ựưa ựi chụp gel (có thể bỏ qua bước nhuộm gel bằng việc bổ sung trực tiếp Ethidium bromide vào gel lỏng với nồng ựộ Ethidium bromide khoảng 1%).