- Thắ nghiệm 2: đánh giá ựặc tắnh kháng mốc sương thông qua lây
2.3.3. Phương pháp phân lập nấm Phytopthora infestans và chuẩn bị dịch lây nhiễm Ờ (Leontine Colon et al.,2004; Hammann et al., 2009)
lây nhiễm Ờ (Leontine Colon et al.,2004; Hammann et al., 2009)
Phân lập nấm Phytopthora infestans gồm 3 bước:
- Chuẩn bị: phòng nuôi cấy, ựĩa petri, các khay gỗ lây nhiễm, dao, kéo, giấy thấm, nước cất, pipet...
- Quy trình chuẩn bị dịch lây nhiễm gồm các bước sau:
Bước 1: Tạo dịch lây nhiễm ban ựầu
+ Nguồn bệnh ựược thu từ các cây khoai tây bị bệnh mốc sương tại các ruộng khoai tây. Các lá bệnh ựược thu thập vào sáng sớm hoặc chiều tối là tốt nhất, sau khi thu thập về ta kẹp mỗi một lá bệnh vào giữa 2 lát khoai tây dày 0,7-1cm rồi ựặt vào ựĩa petri có lót giấy thấm ựã ựược làm ẩm (ựộ ẩm thắch hợp> 80%, nhiệt ựộ 16-180C) rồi ựậy lại. Sau ựó ựể 1-2 ngày, khi nấm bắt ựầu mọc ta mở ra vứt bỏ lá bệnh ựi thu nấm sau 5- 6 ngày.
Mô lá bị nhiễm bệnh Các dạng bào tử:A Sporangiophores;
B Sporangiophores; C Sporangia; D Zoospore release; E Direct germination; F Oospore; G
Haustoria
Hình 2.1. Mô lá nhiễm bệnh và các dạng bào tử
+ Thu mẫu nấm: lấy lát củ ra và dùng que cấy gạt lấy lớp sợi nấm phát triển trên bề mặt lát củ, gạt nhẹ và cẩn thận ựể ựảm bảo chỉ thu ựược P. infestans, cho mẫu nấm vào khoảng 20ml nước cất (tùy vào nấm nhiều hay ắt), tiến hành lọc dung dịch bào tử nấm ựể tạo dịch lây nhiễm.
- Bước 2: Tiến hành ựếm túi bào tử của dịch nấm thu ựược
+ đếm số lượng túi bào tử với buồng ựếm Neubauer: nhỏ 1 giọt dịch chứa bào tử nấm mốc sương lên buồng ựếm, ựậy lamen lại và ựếm dưới kắnh hiển vi ựiện tử ở mức phóng ựại 10X.
đếm số lượng túi bào tử trên toàn bộ buồng ựếm, ựếm lặp lại 7 lần. Sau khi ựếm ta sẽ tắnh ựược mặt ựộ túi bào tử trong dịch nấm thu ựược.
Bước 3: Chuẩn bị dịch lây nhiễm
+ Dịch lây nhiễm là dung dịch ựộng bào tử của nấm Phytophthora infestans có mật ựộ khoảng 5x104 ựộng bào tử/ml. Ta có thể chuẩn bị dịch lây nhiễm bằng cách pha loãng dịch nấm thu ựược sao cho mật ựộ túi bào tử có mật ựộ 14x103 túi bào tử/ml rồi bảo quản ở nhiệt ựộ 5 - 120 C trong 1,5 - 3 tiếng trước khi tiến hành lây nhiễm.