Sau khi bệnh mốc sương khoai tây trở thành một vấn nạn vào khoảng giữa thế kỉ 20, ựã có nhiều giải pháp khác nhau ựược ựề xuất. đầu tiên là biện pháp hóa học: sử dụng hỗn hợp Boocựo, một hỗn hợp giữa vôi cùng với dung dịch ựồng sunphatẦ Một giải pháp khác ựược ựề xuất vào khoảng những năm 1900s, sau khi R.N. Salaman thu ựược một ắt củ của loài khoai tây dại từ vườn bách thảo Kew nước Anh, có khả năng kháng bệnh mốc sương. Loài dại này sau ựó ựược chứng minh là loài S.demissum, có khả năng kháng bệnh mốc sương nhưng không hoàn toàn (Salaman, 1910). Từ ựây 11 gen kháng R (R1 Ờ R11 từ loài S.demissum ựã ựược phát hiện (Black et al.1953; Eid et al.1959; Malcolmson. 1969; Malcolmson and Black. 1966), sau ựó ựã ựược
ựưa vào khoai tây trồng cung cấp cho thị trường trong những năm 1950s, 1960s (M. Y. Adillah Tan, 2008).
Sau khi ựược phát hiện, ựã có nhiều nghiên cứu thực hiện trên các ựối tượng gen kháng này, trong số 11 gen kháng có ựược từ loài khoai tây S.
demissum, gen R1 nằm trên nhiễm sắc thể số 5 (Leonards Ờ Schippers et al. 1992), gen R2 ựịnh vị trên nhiễm sắc thể số 4 (Li et al. 1998), các gen R3, R6, R7 ựược ựịnh vị trên nhiễm sắc thể số 11, gen kháng R5, R8, R9, R10 và R11 ựều nằm trên nhiễm sắc thể 11 và là các alen khác nhau của locus gen R3 (Jonh E. Bradshaw và cộng sự, 2005)
Jonh E. Bradshaw và cộng sự chỉ ra rằng gen R10 và R11 nằm trên nhiễm sắc thể số 11 và là các dạng alen khác nhau của các gen thuộc locus R3 trên nhiễm sắc thể 11. Các nhà khoa học ựã tiến hành ựịnh vị các gen kháng, theo ựó gen R11 liên kết với marker PAC/MATC Ờ 172.3 với khoảng cách 8,5 cM và gen R10 liên kết với marker PAC/MATC Ờ 264.1.
Nghiên cứu theo hướng tối ưu hóa phương pháp PCR nhằm phát hiện các gen kháng bệnh bằng marker phân tử trên cây khoai tây của Kazuyuki Mori và cộng sự thực hiện năm 2011 ựã kết luận rằng gen R1 có nguồn gốc từ loài S. demissum ựược ựịnh vị trên nhiễm sắc thể số 5 (leonards Ờ Schippers et al. 1992) liên kết chặt với marker R1 và ựược phát hiện nhờ cặp mồi liên kết ựặc hiệu 76-2sf2 Ờ 76-2SR, khi tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi ựặc hiệu sẽ cho sản phẩm có kắch thước khoảng 1400bp. Gen kháng R2 ựịnh vị trên nhiễm sắc thể số 4 (Li et al. 1998) liên kết chặt với marker R2 Ờ 800, ựược phát hiện nhờ cặp mồi ựặc hiệu R2SP-S7 Ờ R2SP-A9 và cho kắch thước ựoạn nhân khoảng 800bp.
11 gen kháng (R1 Ờ R11) ựã ựược phát hiện ựều là gen kháng ựặc hiệu chủng có tắnh kháng cao nhưng chỉ kháng ựược một số kiểu gen (chủng, nòi) của tác nhân gây bệnh, tắnh kháng dựa trên các gen kháng này ựược gọi là tắnh kháng ựặc hiệu chủng hay tắnh kháng dọc.Tuy nhiên, tắnh kháng có ựược
từ những gen này chưa thực sự hiệu quả, ngay sau khi các giống kháng bệnh ựược ựưa vào sản xuất tác nhân gây bệnh ựã cho thấy khả năng biến ựổi mô hình gây bệnh của chúng, kết quả là tạo ra các chủng mới có thể gây bệnh trên cây khoai tây mang các gen kháng R. Vì vậy hướng ựi này nhanh chóng cho thấy sự kém hiệu quả trong biểu hiện tắnh kháng ựối với tác nhân gây bệnh cũng như hạn chế về tắnh bền vững.
Vì vậy yêu cầu ựặt ra cho các nhà chọn tạo giống khoai tây là cần phải tìm ựược những nguồn vật liệu mới cho tắnh kháng trên diện rộng, kháng ựược nhiều chủng nấm Phytopthora infestans (tắnh kháng không ựặc hiệu chủng) và cho hiểu quả kháng bền vững. Cho ựến nay các nhà khoa học ựã phát hiện ựược nguồn vật liệu thay thế các gen kháng ựặc hiệu chủng hay các gen kháng ngang có nguồn gốc từ các loài khoai tây dại như S. microdontum, S. pinnaitisectrum và S. berthaultiiẦ (Tae - Ho Park và cộng sự, 2005).
Bằng các phương pháp phân tắch di truyền ựịnh tắnh và ựịnh lượng thực hiện loài S. microdontum, Adillah Tan và cộng sự ựã phát hiện ựược locus gen kháng bệnh mốc sương trên loài dại này. Locus gen này nằm trên vai ngắn của nhiễm sắc thể số 4, giữa marker AFLP pCTmAGG_310 và CAPS (sự ựa hình các ựoạn cắt ựược khuếch ựại Ờ Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) marker TG339, T0703. Vị trắ của gen Rpi-mcdl ựược phát hiện là trùng khớp với một cụm gen kháng Phytopthora infestans khá bảo thủ, mang các gen kháng gồm R2, R2-like, Rpi-blb3 và Rpi-abpt trên nhiễm sắc thể số 4. điều này cho thấy gen
Rpi-mcdl ựược phát hiện từ loài dại S. microdontum là gen kháng thứ 5 ựược tìm thấy trong cụm gen này (M. Y Aadillah Tan và cộng sự, 2008).
Trên loài khoai tây dại S. berthaultii các nhà khoa học ựã phát hiện gen kháng bệnh mốc sương Rpi-ber nằm trên nhiễm sắc thể số 10. Các marker ựặc hiệu trên nhiễm sắc thể số 10 gồm Q133, CT214 và TG63 liên kết khá chặt với gen Rpi-ver với khoảng cách lần lượt là 6.4, 5.1 và 1.3cM (M. Y Aadillah Tan và cộng sự, 2010).
Một số gen kháng có nguồn gốc từ các loài khoai tây dại khác ựã ựược ựịnh vị, như gen kháng trội Rpil từ loài dại S. pinnatisectum ựược ựịnh vị nằm trên nhiễm sắc thể số VII (Kuhl và cộng sự. 2001), các gen kháng từ các loài dại như: S. mochiquense (gen Rpi-moc1; Smilde và cộng sự. 2005), S. phureja
(gen Rpi-phu1; Sliwka và cộng sự. 2006), S. venturii (gen Rpi-vnt1;; Foster và cộng sự. 2009; Pel và cộng sự. 2009), S. dulcamara (gen Rpi-dlc1; Golas và cộng sự. 2010) vàS. caripense (Trognitz and Trognitz. 2004; Nakitandwe và cộng sự. 2007) ựều ựược ựịnh vị trên nhiễm sắc thể số 10.
Một nguồn gen kháng mốc sương mới ựược phát hiện gần ựây và hiện ựang ựược tập trung nghiên cứu là các gen kháng có nguồn gốc từ loài khoai tây dại Solanum bulbocastanum. đây là loài dại nhị bội, có nguồn gốc từ vùng trung Mỹ, phát triển tại vùng ựồi có ựộ cao từ 1200 ựến 2300m so với mực nước biển, thuộc ựông bắc Mexico (Spooner và cộng sự. 2004). Cho ựến nay các nhà khoa học ựã phát hiện và nhân dòng ựược 4 gen kháng bệnh mốc sương có nguồn gốc từ loài dại Solanum bulbocastanum thuộc vùng lặp giàu Leucine (NBS-LRR), bao gồm: Gen Rpi-blb1 (van der Vossen et al.2003) hay còn ựược biết ựến với tên RB (Song et al.2003); gen Rpi-blb2 (van der Vossen et al.2005); gen Rpi-blb3 (Lokosou et al. 2009); gen Rpi-bt1 (Oosumi et al. 2009) ựược phát hiện từ phép lai giữa S. bulbocastanum và S. Tuberosum.
Trong ựó, gen Rpi-blb1/RB, ựịnh vị trên nhiễm sắc thể số 8, gần marker CT64 và thuộc một cụm gồm 4 gen kháng tương ựồng (resistance gene analogues Ờ RGAs)(van der Vossen et al. 2003); gen Rpi-blb2 nằm trên nhiễm sắc thể số 6 gần marker CT119; gen Rpi-blb3 ựịnh vị trên nhiễm sắc thể số 4 gần marker TG339 và nằm trong cụm gen kháng mốc sương ựặc hiệu chủng (R2, gen Rpi-abpt, R2-like). Nhóm gen kháng này là các gen kháng không ựặc hiệu chủng, cho hiệu quả kháng cao và khá bền vững.
Các nghiên cứu về sự ựa dạng, phạm vi phân bố cũng như quá trình tiến hóa của các gen kháng mốc sương có ở loài dại S. bulbocastanum ựã ựưa ra
các cặp mồi liên kết ựặc hiệu với những gen kháng này. Gen Rpi-blb1/RB ựược phát hiện bởi 2 cặp mồi là Blb1 (Wang và cộng sự. 2008) và 1/1Ỗ, cặp mồi này liên kết ựặc hiệu với gen Rpi-blb1/RB và sẽ khuếch ựại một ựoạn ADN có kắch thước lần lượt là 820 và 213bp (Wang và cộng sự. 2008); gen Rpi-blb2 ựược phát hiện nhờ cặp mồi Blb2F/R, cặp mồi này liên kết ựặc hiệu với gen Rpi-blb2
và cho ựoạn ADN ựược khuếch ựại có kắch thước khoảng 715bp (Lokssou và cộng sự. 2010), trong khi Wang và cộng sự (2008) cho rằng cặp mồi blb2F/R sẽ khuếch ựại ựoạn ADN có kắch thước khoảng 773bp.
Cặp mồi Blb3F/R ựược cho là liên kết ựặc hiệu với gen kháng mốc sương Rpi-blb3 và sẽ khuếch ựại một ựoạn ADN có kắch thước khoảng 618bp (Wang và cộng sự. 2008)
Chương 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu, ựịa ựiểm và thời gian nghiên cứu
2.1.1. đối tượng
- Các giống khoai tây trồng, các dòng khoai tây dại, và các dòng con lai soma do Viện JKI cung cấp và ựược lưu giữ tại Viện sinh học Nông nghiệp Ờ Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội
Bảng 2.1: Các giống/dòng khoai tây trồng, dại ựược chọn là cây bố mẹ STT Tên giống bố mẹ Kắ hiệu độ bội Nguồn gốc Tắnh trạng (1) (2) (3) (4) (5) (6)
Các giống khoai tây trồng
1 Agave Agave 4x Viện NC chọn tạo Giống cây trồng JKI - CHLB đức. Năng suất cao, chất lượng tốt 2 Atlantic Atlantic 4x Mỹ Năng suất cao, chất lượng tốt 3 Delikat Delikat 4x Viện NC chọn tạo Giống cây trồng JKI- CHLB đức. Năng suất cao, chất lượng tốt 4 Rasant Rasant 4x Viện NC chọn tạo Giống cây trồng JKI- CHLB đức. Năng suất cao, chất lượng tốt
Các dòng khoai tây dại
5 Solanum tarnii trn3G 2x Viện NC chọn tạo Giống cây trồng JKI- CHLB đức. Kháng bệnh mốc sương virus PVY 6 S.pinnatisectum pnt2G 2x Viện NC chọn tạo Giống cây trồng JKI- CHLB đức. Kháng bệnh mốc sương virus PVY 7 S.bulbocastanum blb2G 2x Viện NC chọn tạo Giống cây trồng JKI- CHLB đức. Kháng bệnh mốc sương virus PVY
Bảng 2.2: Các dòng con lai soma giữa các dòng khoai tây dại và các giống khoai tây trồng trong chọn tạo giống
STT Tổ hợp lai soma Ký hiệu tên dòng độ bội
1 Agave + trn3G 4/12; 4/22; 7/4; 7/7 6x 2 Atlantic + pnt2G 245/6; 248/1 6x 3 Delikat + blb2G 2281/10; 2283/5; 2292/4; 2295/1 6x 4 Delikat + pnt2G 2195/2; 2196/4; 2235/1 6x 5 Delikat + pnt2G 838/11; 851/2 6x 6 Rasant + pnt2G 2044/1 6x 7 Rasant + trn3G 1/6; 3/7; 3/9 6x