- Thắ nghiệm 2: đánh giá ựặc tắnh kháng mốc sương thông qua lây
2.3.4. Phương pháp lây nhiễm nhân tạo trên lá tách rời Ờdetached Ờ leaflet assay (Darsow et al., 2004; Hammann et al., 2009)
assay (Darsow et al., 2004; Hammann et al., 2009)
* Chuẩn bị: khay chứa lá lây nhiễm, dịch lây nhiễm, vải màn lót giữ ẩm cho lá, pipet, kéo, giấy thấm...
* Quy trình lây nhiễm ựược thực hiện qua 4 bước
Bước 1: Chuẩn bị dịch lây nhiễm:
- Dịch lây nhiễm là dung dịch ựộng bào tử của nấm Phytopthora infestans có mật ựộ khoảng 5x104 ựộng bào tử/ml. Ta có thể chuẩn bị dịch lây nhiễm bằng cách giữ dung dịch túi bào tử có mật ựộ 15x103 túi bào tử/ml ở nhiệt ựộ 5 Ờ 120C trong 1,5 Ờ 3 tiếng trước khi tiến hành lây nhiễm.
Bước 2: Chuẩn bị mẫu lá lây nhiễm:
- Lá khoai tây ựược lấy từ các cành bánh tẻ (cành thứ 3 - 4 từ ngọn xuống), chiều rộng của lá từ 2 Ờ 5cm. Dùng kéo sắc ựể cát lá, trong quá trình cắt tránh làm tổn thương bề mặt lá.
- Mỗi kiểu gen ựược thực hiện 5 lần lặp lại.
- đặt vải màn ẩm xuống dưới khay lây nhiễm ựể giữ ẩm cho lá - Lá ựược xếp vào khay, mặt dưới lá ựược xếp hướng lên phắa trên.
Bước 3: Lây nhiễm nhân tạo trên lá:
+ Lây nhiễm: Sử dụng pipet hoặc xilanh nhỏ 1 giọt dịch lây nhiễm ựã chuẩn bị với thể tắch 15-20 ộl lên chắnh giữa bề mặt sau lá, ựậy kắnh lại, ựưa khay chứa lá vào ựiều kiện lây nhiễm nhân tạo: nhiệt ựộ phòng lây nhễm ở mức 18 - 20 0C ; ựộ ẩm cần ựảm bảo ở mức 80% ựến bão hòa.
+ Sau khi nhỏ dịch lây nhiễm 1 ngày, tiến hành lật ựảo bề mặt lá (lật úp mặt ựược nhỏ dịch xuống)
+ Thường xuyên theo dõi ựộ ẩm của vải màn lót dưới khay lây nhiễm ựể duy trì ựộ ẩm thắch hợp cho sự phát triển của nấm (nếu khô quá có thể tưới thêm nước lên các ảnh vải màn)
Bước 4: Cho ựiểm và ựánh giá:
+ Tiến hành ựánh giá ựặc tắnh kháng nhiễm trên lá khoai tây sau 5 ngày lây nhiễm.
+ Việc cho ựiểm dựa vào tỉ lệ diện tắch vết chết hoại tử và sự phát triển của hệ sợi nấm trên bề mặt lá.
+ đo vết hoại tử trên bề mặt trên của lá: đo từng lá riêng rẽ; đánh giá theo thang ựiểm từ 1 - 9: giá trị ựiểm từ 1 - 3 cho thấy biểu hiện kháng, số ựiểm từ 4 - 9 cho thấy biểu hiện mẫn cảm. Trong ựó mức 1 tương ựương không xuất hiện triệu chứng bệnh, mức 9 là cực nhạy với bệnh.
+ đo sự hình thành bào tử trên bề mặt dưới của lá. + đo từng lá riêng rẽ.
+ đo mật ựộ hình thành bào tử: đánh giá theo thang ựiểm từ 1 - 9 (1= Không có sự hình thành bào tử, 9 = bào tử nấm phát triển mạnh).