phố Cần Thơ
4.1.1 Kết quả định danh virus viêm gan vịt bằng phương pháp RT-PCR
Trong thời gian thu thập mẫu bệnh phẩm từ các đàn vịt bệnh, kết quả đã thu thập được 32 mẫu gan từ 8 đàn vịt tai các huyện Phong Điền, Cờ Đỏ, Vĩnh Thạnh, Thới Lai,… (mỗi đàn vịt thu thập 4 mẫu gan) có biểu hiện bệnh tích điển hình của bệnh viêm gan do virus trên địa bàn thành phố Cần Thơ. Sau đó bảo quản lạnh ở nhiệt độ 4oC đưa về phòng thí nghiệm, rồi tiến hành xử lý mẫu, lấy huyễn dịch virus trữ ở -20oC chờ định danh bằng phương pháp RT- PCR.
So với các phương pháp giám định virus thông thường thì RT-PCR được xem là một công cụ giúp phát hiện nhanh và chính xác các type virus gây bệnh nói chung và virus gây bệnh viêm gan vịt nói riêng. Việc sử dụng phương pháp RT-PCR để định danh virus viêm gan vịt cho ta kết quả đáng tin cậy và đồng thời cũng giúp rút ngắn thời gian phát hiện các chủng virus.
Kết quả phản ứng PCR của 8 mẫu bệnh phẩm sau khi xử lý được thể hiện trên hình bên dưới:
M 1 2 3 4 5 6 7 8
Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR trên gel agarose 1,5%
M: thang đo DNA 5: Giếng chứa mẫu 5
1: Giếng chứa mẫu 1 6: Giếng chứa mẫu 6
2: Giếng chứa mẫu 2 7: Giếng chứa mẫu 7
3: Giếng chứa mẫu 3 8: Giếng chứa mẫu 8
4: Giếng chứa mẫu 4
Kết quả đọc được trên máy soi Dolphin-DOC sau khi kết thúc điện di, phát hiện các sản phẩm của quá trình RT-PCR cho ta thấy trong 8 mẫu được dùng để định danh virus viêm gan vịt có 1 mẫu dương tính xuất hiện vạch ở giếng số 6 có chiều dài 286bp, điều này chứng tỏ rằng các đoạn mồi DHAV-
3F, DHAV-3R đã bắt cặp thành công với mạch khuôn và cho ra sản phẩm PCR có kích thước 286bp, vậy trong 8 mẫu virus phân lập được có một mẫu virus viêm gan vịt type I, thuộc subtype DHAV-3, và đây cũng chính là chủng virus viêm gan vịt phân lập được trên các đàn vịt ở thành phố Cần Thơ.
4.1.2 Kết quả phân lập virus viêm gan vịt
Dùng mẫu virus đã được định danh bằng phương pháp RT-PCR, tiến hành phân lập virus trên phôi vịt 12 ngày tuổi, để thu dịch nước trứng phục vụ cho các thí nghiệm khác. Sau khi gây nhiễm trên phôi, chúng tôi tiến hành soi trứng định kỳ 6 giờ/lần trong vòng 72 giờ và ghi nhận kết quả như sau:
Bảng 4.1 Tỉ lệ phôi vịt chết theo thời gian
Thời gian chết phôi (giờ) Số phôi chết Tỉ lệ (%) 19-24 10 25,00 25-48 26 65,00 49-72 4 10,00 Tổng 40 100,00
Qua thí nghiệm tiêm bệnh phẩm cho 40 phôi vịt, kết quả 100,00% phôi vịt chết với các triệu chứng điển hình của virus viêm gan vịt (sẽ được trình bày ở bảng 4.2). Trong thời gian từ 19-24 giờ sau khi tiêm bệnh phẩm có 10 phôi chết, với tỉ lệ 25,00%, số phôi vịt chết nhiều nhất tập trung vào giai đoạn từ 25-48 giờ với 26 phôi chết chiếm tỉ lệ cao nhất 65,00% và chỉ có 4 phôi còn lại chết trong giai đoạn 49-72 giờ, với tỉ lệ 10,00%. Kết quả trên cho ta thấy đây là chủng virus có độc lực khá cao, gây chết phôi 100,00%, thời gian gây chết phôi ngắn, không quá 72 giờ và phần lớn các phôi chết nhanh trong vòng 48 giờ dưới sự tấn công của virus trong bệnh phẩm phân lập được.
Bảng 4.2 Tần suất xuất hiện bệnh tích trên phôi vịt
Bệnh tích phôi Số phôi Tỉ lệ Tỉ lệ (%)
Gan xuất huyết 36 36/40 90,00
Xuất huyết toàn thân 38 38/40 95,00
Phôi còi cọc 35 35/40 87,50
Phù đầu 31 31/40 77,50
Phù nề bụng 26 26/40 65,00
Điều tra bệnh tích trên các phôi chết sau khi tiêm virus, ta được kết quả như sau, hầu hết các phôi chết điều có biểu hiện bệnh tích đặc trưng, trong số
40 phôi chết có 36 phôi có gan xuất huyết với tỉ lệ 90,00%, 38 phôi xuất huyết toàn thân với tỉ lệ 95,00%, phôi biểu hiện còi cọc có 35 phôi với tỉ lệ 87,50%, phôi phù đầu có 31 phôi với tỉ lệ 77,50%, với bệnh tích phù nề bụng có 26 phôi và chiếm tỉ lệ 65,00%, kết quả này phù hợp với nhận định của Hồ Thị Việt Thu (2012), virus viêm gan vịt gây chết phôi 10-14 ngày tuổi với các biểu hiện bệnh tích đặc trưng như gan xuất huyết, xuất huyết toàn thân, phôi còi cọc, phù đầu, phù nề bụng. Theo OIE (2000), virus viêm gan vịt type I khi nuôi cấy trên phôi vịt 10-14 ngày tuổi, virus sẽ gây chết phôi trong khoảng 24- 72 giờ sau khi tiêm, phôi có bệnh tích còi cọc, xuất huyết trên da, gan phôi sưng xuất huyết.
Như vậy, trong bệnh phẩm nuôi cấy trên phôi vịt đã có mặt virus viêm gan vịt, virus đã nhân lên trên phôi, gây chết phôi và gây các bệnh tích đặc hiệu trên phôi. Có thể kết luận chủng virus phân lập được có đặc tính của virus viêm gan vịt type I với thời gian gây chết phôi không quá 72 giờ và gây chết 100,00% phôi.
Hình 4.2 Gan phôi xuất huyết Hình 4.3 Da phôi xuất huyết, phôi phù đầu
Hình 4.4 Phôi phù nề, tích nước Hình 4.5 A) Phôi bình thường B) Phôi còi cọc
4.2 Kết quả xác định liều gây chết 50% trên phôi vịt thí nghiệm Bảng 4.3 Tỉ lệ phôi vịt chết ở các nồng độ virus
Số thật Tổng hợp Độ pha
loãng
virus Phôi sống Phôi chết Phôi sống Phôi chết Số chết Tỉ lệ (%)
10-4 0 5 0 32 32/32 100,00 10-5 0 5 0 27 27/27 100,00 10-6 0 5 0 22 22/22 100,00 10-7 0 5 0 17 17/17 100,00 10-8 0 5 0 12 12/12 100,00 10-9 1 4 1 7 7/8 87,50 10-10 3 2 4 3 3/7 42,86 10-11 4 1 8 1 1/9 11,11 10-12 5 0 13 0 0/13 0,00
Khoảng cách tỷ lệ dp giữa 2 độ pha loãng 10-9 và 10-10 dp= 50 42,86
87, 5 42,86
= 0,16
Log của độ pha loãng gây chết ở 50% là
Log ELD50 = -10 + 0,16 = -9,84 vậy ở độ pha loãng 1:109,84 khi tiêm 0,2 ml huyễn dịch virus sẽ gây chết 50% phôi thí nghiệm (hay 0,2 ml huyễn dịch virus có chứa 109,84 liều gây chết 50% phôi).
4.3 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể trong máu gà
Bảng 4.4 Kiểm tra hiệu giá kháng thể trong máu gà sau khi gây miễn dịch với liều 104ELD50 qua mỗi tuần sau khi tiêm
Hiệu giá kháng thể trong máu gà qua các tuần (xlog2) Nghiệm thức 0 1 2 3 4 5 6 7 8 A 0,50 8,67 7,33 7,00 7,33 7,67 8,00 6,67 5,33 B 0,67 6,67 6,67 6,33 7,67 8,00 7,67 7,67 6,67 C 0,33 5,67 5,33 5,67 7,00 6,67 6,67 6,00 5,67 Đc 0,33 0,33 0,50 0,33 0,33 0,50 0,67 0,67 0,50
A: Nghiệm thức gây miễn dịch 1 lần.
B: Ngiệm thức gây miễn dịch 2 lần.
C: Nghiệm thức gây miễn dịch 3 lần. Đc: Nghiệm thức đối chứng. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 Tuan H ie u g ia ( x lo g 2 ) A B C ĐC
Hình 4.6 Kháng thể trong máu gà sau khi gây miễn dịch với liều 104ELD50
Qua bảng 4.4 cho thấy trước khi gây miễn dịch, hiệu giá kháng thể ở cả ba nghiệm thức điều thấp hơn giá trị 1,00log2 và bắt đầu có kháng thể cao trong máu sau 1 tuần khi kết thúc gây miễn dịch cho gà và kháng thể trong máu gà ổn định kéo dài liên tục trong 5 tuần ở nghiệm thức A, cao nhất ở tuần 1 (8,67log2) và giảm mạnh từ tuần thứ 6 trở đi, thấp nhất ở tuần thứ 8 (5,33log2). Đối với các nghiệm thức B, C, kháng thể trong máu gà xuất hiện sau khi gây miễn dịch một tuần với giá trị lần lượt 6,67log2 và 5,67log2, ổn định trong 2 tuần tiếp theo và tiếp tục tăng cao (cao nhất là 8,00log2 ở tuần 5 của nghiệm thức B và 7,00log2 ở tuần 4 của nghiệm thức C) rồi giữ ổn định ở các tuần thứ 4, 5, 6 và bắt đầu có dấu hiệu giảm hiệu giá kháng thể trong máu gà kể từ tuần thứ 7 trở về sau. Quá trình sụt giảm hiệu giá kháng thể trong máu gà ở 2 nghiệm thức B, C xảy ra không nhanh chóng như ở nghiệm thức A, tuy nhiên nhìn chung giá trị hiệu giá kháng thể trong máu gà ở cả 2 nghiệm thức này vẫn thấp hơn so với nghiệm thức A, nhưng sự khác biệt về hiệu giá kháng thể trong máu giữa các nghiệm thức thí nghiệm không có ý nghĩa thống kê qua các tuần khảo sát.
Điều này được giải thích là do việc gây miễn dịch nhắc lại nhiều lần sẽ giúp cho việc tạo ra kháng thể trong máu sẽ kéo dài hơn so với viêc gây miễn dịch một lần vì tạo ra được miễn dịch thứ cấp do các tế bào nhớ gồm Lympho bào T “nhớ” và Lympho bào B “nhớ” sẽ làm cho thời gian tiềm tàng của kháng nguyên ngắn hơn và khả năng ghi nhớ kháng nguyên này kéo dài hơn, tuy nhiên do việc lặp lại các lần tiêm kháng nguyên khá gần nhau (7 ngày) nên lượng kháng thể vừa được tạo ra trong lần gây miễn dịch trước đã bị trung hoà bởi lượng kháng nguyên vừa được đưa vào, chính vì thế mà ở nghiệm thức B có hiệu giá kháng thể thấp hơn nghiệm thức C và 2 nghiệm thức này có hiệu
giá kháng thể trong máu thấp hơn nghiệm thức A, nhưng hiệu giá kháng thể kéo dài hơn.
Bảng 4.5 Kiểm tra hiệu giá kháng thể trong máu gà sau khi gây miễn dịch với liều 106ELD50 qua mỗi tuần sau khi tiêm
A: Nghiệm thức gây miễn dịch 1 lần.
B: Ngiệm thức gây miễn dịch 2 lần.
C: Nghiệm thức gây miễn dịch 3 lần. Đc: Nghiệm thức đối chứng. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 Tuan H ie u g ia ( x lo g 2 ) A B C ĐC
Hình 4.7 Kháng thể trong máu gà sau khi gây miễn dịch với liều 106ELD50
Qua bảng 4.5 cho thấy khi gây miễn dịch cho gà ở cả 3 nghiệm thức thí nghiệm thì hiệu giá kháng thể trong máu tăng nhanh ở tuần thứ 1 và dao động không đáng kể liên tục cho đến tuần thứ 5 với giá trị hiệu giá kháng thể cao nhất là 7,33log2 rồi bắt đầu có dấu hiệu giảm liên tục trong các tuần tiếp theo ở nghiệm thức B, thấp nhất ở tuần thứ 8 với giá trị 5,33log2, trong khi đó ở nghiệm thức A và C hiệu giá kháng trong máu lại kéo dài hơn nghiệm thức B thêm 1 tuần rồi mới xuất hiện dấu hiệu sụt giảm hiệu giá. Hiệu giá kháng thể cao nhất ở nghiệm thức A là 7,00log2 xuất hiện ở tuần 2 và thấp nhất là 4,00log2 ở tuần 8 sau khi gây miễn dịch, ở nghiệm thức C có giá trị hiệu giá kháng thể trong máu cao nhất là 7,00log2 xuất hiện ổn định trong 2 tuần liên tục là tuần 5 và 6, thấp nhất ở tuần 8 với giá trị 5,00log2. Tuy nhiên kết quả
Hiệu giá kháng thể trong máu gà qua các tuần (xlog2) Nghiệm thức 0 1 2 3 4 5 6 7 8 A 0,33 6,67 7,00 6,33 6,33 6,00 6,00 5,33 4,00 B 0,67 7,00 7,33 6,67 7,00 7,33 6,33 6,00 5,33 C 0,33 6,33 6,00 6,67 6,33 7,00 7,00 5,67 5,00 Đc 0,33 0,33 0,50 0,33 0,33 0,50 0,67 0,67 0,50
phân tích thống kê cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa trong kết quả hiệu giá kháng thể trong máu của 3 nghiệm thức thí nghiệm.
Việc kháng thể tăng cao sau tuần thứ 1 và dao động không lớn đến tuần 6 chủ yếu do ảnh hưởng bởi tình trạng sức khoẻ không ổn định của nghiệm thức gà thí nghiệm tác động đến sự đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu chống virus viêm gan vịt, bên cạnh đó thao tác trong các bước tiến hành thí nghiệm trung hoà xác định hiệu giá kháng thể chưa thành thạo cũng ảnh hưởng không ít đến kết quả, nhưng nhìn chung sự hình thành kháng thể trong máu gà ở cả 3 nghiệm thức thí nghiệm vẫn tuân theo quy luật đáp ứng miễn dịch khi được tiêm kháng nguyên.
Bảng 4.6 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể trong máu gà sau khi gây miễn dịch với liều 108 ELD50 qua mỗi tuần sau khi tiêm
Hiệu giá kháng thể trong máu gà qua các tuần (xlog2) Nghiệm thức 0 1 2 3 4 5 6 7 8 A 0,33 6,67 6,33 7,33 8,00 8,00 8,00 6,33 5,00 B 0,33 7,00 7,00 7,00 6,67 6,67 6,00 6,33 5,33 C 0,67 7,67 7,00 7,33 6,67 6,33 6,33 5,67 5,00 Đc 0,33 0,33 0,50 0,33 0,33 0,50 0,67 0,67 0,50
A: Nghiệm thức gây miễn dịch 1 lần.
B: Nghiệm thức gây miễn dịch 2 lần.
C: Nghiệm thức gây miễn dịch 3 lần. Đc: Nghiệm thức đối chứng. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 T0 T 1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 Tuan H ie u g ia ( x lo g 2 ) A B C ĐC
Hình 4.8 kháng thể trong máu gà sau khi gây miễn dịch với liều 108ELD50
Qua bảng 4.6 cho thấy khi tiêm kháng nguyên là virus viêm gan vịt ở liều 108ELD50 thì sự đáp ứng miễn dịch ở các nghiệm thức nhìn chung vẫn tuân theo quy luật của miễn dịch học. Trước khi gây miễn dịch, hiệu giá kháng
thể ở các nghiệm thức thí nghiệm điều nhỏ hơn 1,00log2 và sau khi gây miễn dịch 1 tuần thì hiệu giá kháng thể ở 3 nghiệm thức tăng nhanh. Trong đó ở nghiệm thức A hiệu giá kháng thể tăng nhanh trong tuần đầu, kéo dài đến tuần 2 và sau đó tiếp tục tăng liên tục trong 2 tuần 3, 4 và giữ ổn định ở hiệu giá cao nhất 8,00log2 trong 2 tuần 5, 6 rồi giảm nhanh trong các tuần tiếp theo với giá trị hiệu giá thấp nhất là 5,00log2. Trong khi đó ở 2 nghiệm thức B và C hiệu giá kháng thể biến động qua các tuần gần tương tự nhau, hiệu giá kháng thể tăng nhanh trong tuần đầu với giá trị cao nhất ở nghiệm thức B là 7,00log2, ở nghiệm thức C là 7,67log2 và tương đối ổn định trong các tuần 2, 3 rồi giảm nhẹ qua các tuần 4,5,6,7,8 đạt giá trị hiệu giá thấp nhất là 5,33log2 ở nghiệm thức B và 5,00log2 ở nghiệm thức C tại tuần thứ 8. Giá trị hiệu giá kháng thể trong máu gà giữa các nghiệm thức nhìn chung điều cao >4,00log2, nhưng hiệu giá cao nhất thuộc về nghiệm thức A, tuy nhiên sự khác biệt về hiệu giá kháng thể trong máu giữa các nghiệm thức thí nghiệm không có ý nghĩa thống kê.
Từ kết quả thu được của 3 thí nghiệm gây miễn dịch đặc hiệu cho gà bằng virus viêm gan vịt với các liều lần lượt 104, 106, 108ELD50. Chúng tôi có nhận xét như sau:
Cả 3 thí nghiệm, gà điều cho đáp ứng miễn dịch cao, miễn dịch đặc hiệu trong máu gà xuất hiện nhanh chỉ sau khi tiêm kháng nguyên một tuần, và miễn dịch này tăng dần, đạt mức cao, kéo dài trong 4-6 tuần, sau đó giảm dần. Với những nghiệm thức thí nghiệm tiêm kháng nguyên nhắc lại nhiều lần thì hiệu giá kháng thể trong máu gà giảm chậm, kéo dài trong nhiều tuần hơn các nghiệm thức tiêm kháng nguyên một lần. Điều này hoàn toàn phù hợp với nhận định của Nguyễn Quang Tuyên (2003), kháng thể không sản sinh ra ngay sau khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể, mà kháng thể chỉ xuất hiện sau 6- 7 ngày, rồi tăng dần và đạt mức tối đa sau 2-3 tuần và sau đó từ từ giảm và biến mất sau vài tuần, vài tháng hoặc vài năm.
So sánh hiệu giá kháng thể giữa các thí nghiệm với từng liều virus khác nhau, ta thấy ở thí nghiệm gây miễn dịch cho gà với liều virus viêm gan vịt là 104ELD50 cho hiệu giá kháng thể trong các nghiệm thức thí nghiêm điều cao và ổn định trong khoảng từ 7,00log2-8,00log2, kết quả này ngang bằng với hiệu giá kháng thể trong các nghiệm thức thí nghiệm ở thí nghiệm gây miễn dịch cho gà với liều 108ELD50 và cao hơn hiệu giá trong các nghiệm thức thí