2.2.3.1 Sơ lược về IgY
IgY là một globulin miễn dịch được mô tả lần đầu tiên vào năm 1893 khi Klemperer chủng ngừa gà để sản xuất kháng thể và phát hiện nồng độ kháng thể trong lòng đỏ trứng gà cũng tương đương trong máu. Khi Klemperer phát hiện globulin miễn dịch gà vào cuối năm 1900, ông đã đặt tên chúng là IgG. Hơn 70 năm sau đó, Leslie và Clem đã đổi tên globulin miễn dịch này thành
IgY không phải vì chúng được tìm thấy trong lòng đỏ, mà chúng khác các globulin miễn dịch của động vật có vú (IgG). Hiện nay, IgY là lớp globulin miễn dịch chủ yếu ở các loài chim, bò sát, loài lưỡng thê và loài cá phổi.
Ở loài chim đã tìm thấy 3 loại kháng thể: IgA, IgM và IgY. IgA và IgM thì tương tự như IgA và IgM của loài hữu nhũ, riêng IgY là globulin miễn dịch chính có trong huyết thanh và lòng đỏ trứng. IgY hình thành khoảng 75% tổng số globulin miễn dịch. Hàm lượng IgY, IgA, IgM trong huyết thanh lần lượt là 5,0; 1,25 và 0,61mg/ml (Leslie et al., 1973).
Kháng thể từ gà mẹ được truyền cho gà con vào giai đoạn cuối hình thành trứng, có vai trò rất quan trọng về chức năng miễn dịch, ảnh hưởng tới sức đề kháng của gà con đối với các bệnh truyền nhiễm khác nhau. Kháng thể IgA và IgM mẹ được hợp thành trong lòng trắng trứng dọc màng ối (Rose et al., 1974). IgY trong lòng đỏ tuần hoàn trong máu gà con qua nội phôi bì của túi noãn hoàng (Patterson et al., 1962). Hàm lượng kháng thể trong lòng trắng trứng thấp (IgA ~ 0,7mg/ml, IgM ~ 0,15mg/ml) trong khi ở lòng đở IgY có hàm lượng rất cao (8-25mg/ml).
2.2.3.2 Cấu trúc và chức năng
Cấu trúc của IgY nói chung cũng giống như cấu trúc của IgG ở động vật có vú, bao gồm hai chuỗi nặng H (heavy chain) và hai chuỗi nhẹ L (light chain) liên kết với nhau bằng cầu nối disulfus (-S-S-). Trọng lượng phân tử của IgY là 180 kilo-dalton (kDa), lớn hơn so với IgG của động vật có vú (159kDa). Chuỗi nhẹ L của IgY gồm một vùng thay đổi VL (variable region) và một vùng hằng định CL (constant region). Chuỗi nặng H gồm một vùng thay đổi VH và bốn vùng hằng định ký hiệu từ Cv1 đến Cv4, với trọng lượng phân tử là 68kDa (hình 2.3).
Khác với chuỗi nặng của IgG, chuỗi nặng của IgY không có vùng bản lề. Một số nghiên cứu chỉ ra rằng vùng Cv3, Cv4 của IgY tương tự như các vùng Cγ2 và Cγ3 của IgG còn vùng bản lề của IgG được thay bằng vùng Cv2 ở IgY, điều này làm cho chuỗi nặng của IgY kém linh hoạt hơn (hình 2.3). Đây có thể là lý do làm cho IgY có nhiều đặc tính sinh học khác với IgG ở động vật có vú. Tương tự như các kháng thể khác, IgY có khả năng trung hoà các vi sinh vật và độc tố của vi sinh vật. Trong máu và trong dịch gian bào của gà, IgY đóng vai trò tương tự như IgG của động vật có vú. IgY tham gia hoạt động opsonin hoá kháng nguyên, IgY gây ngưng tập kháng nguyên hữu hình, kết tủa kháng nguyên hoà tan.
Hình 2.3 Cấu trúc IgG của thỏ và IgY của gia cầm
http://www.mcmaster.ca/inabis98/immunology/szabo0509/fig1.jpg
2.2.3.3 Đặc tính của IgY
Tương tự như IgG của loài hữu nhũ, nhưng phần Fc của IgY là vị trí có chức năng hiệu quả sinh học nhất với chuỗi 2 carbonhydrate trong khi IgG chỉ có một.
a) Đặc tính sinh hóa
Điểm đẳng điện của IgY thấp hơn IgG (Polson et al., 1980) trong dãy 5,7-7,6 còn IgG nằm giữa 6,1-8,5, trong khi đó chuỗi Fc (phần kỵ nước nhất của phân tử kháng thể) của IgY thì lớn hơn của IgG, nên phân tử IgY kỵ nước hơn IgG (Davalos et al., 2000).
b) Tính bền của IgY
IgY bền với pH: hoạt tính IgY giảm ở pH= 3,5 hoặc thấp hơn và hầu như hoàn toàn mất ở pH=3 (Shimizu et al., 1988, 1992,1993). Hoạt tính IgY nhanh chóng giảm ở pH thấp đòi hỏi những thay đổi thích ứng và sự tồn tại trên phần Fab bao gồm vị trí gắn kháng nguyên. Ở điều kiện kiềm tính, hoạt tính của IgY không thay đổi ngay cả khi pH tăng đến 11. Dù vậy nó vẫn bị giảm ở pH=12 hay cao hơn (Shimizu et al., 1988, 1992,1993).
IgY bền với sự phân giải protein: IgY có tính đề kháng với trypsine hay chymotrysine tiêu hóa nhưng hơi nhạy cảm với pepsine tiêu hóa. Hatta (1993) chỉ định rằng hầu hết hoạt tính IgY bị mất theo đường tiêu hóa với pepsine, nhưng hoạt tính được duy trì mức 39% và 41% khi ủ với trysine và chymotrypsine sau 8h.
IgY bền với nhiệt và áp suất: IgY được dùng ấm ở các mức nhiệt khác nhau cho các giai đoạn khác nhau về thời gian. Hoạt tính gắn kết của IgY với kháng nguyên giảm với sự tăng nhiệt và thời gian làm nóng. Theo Shimizu (1992) và Hatta (1993) IgY bền với nhiệt độ 60-700C. Hoạt tính IgY giảm do sự làm nóng trong 15 phút ở 700C hay cao hơn; IgY biến tính nhiều khi làm nóng ở nhiệt độ trên 750C (Chang et al., 1999). IgY có tính bền với áp suất được ghi nhận qua sự không phát hiện ra sự bất hoạt của IgY bởi áp suất 4000kg/cm2 (Shimizu et al., 1994).
IgY bền với lạnh và khí khô: lạnh và đông khô là quá trình nhiệt thấp thường được xem như ít bị hủy hoại. Tuy nhiên, protein có lẽ phải chịu sự mất hoạt tính là kết quả của sự thay đổi cấu tạo, sự kết tập hay sự bám hút (Skrabania et al., 1994). Một số báo cáo về tính bền của IgY liên quan đến các phương pháp này: lạnh khô không làm ảnh hưởng tới hoạt tính của IgY trừ khi lặp lại nhiều lần (Shimizu et al., 1988).
Yokoyama (1992) phân tích tính chất của bột IgY nhận được bằng cách phun khô hay đông khô nước hòa tan lòng đỏ trứng gà miễn dịch với E.coli không thấy một dấu hiệu biến đổi nào trong chuẩn độ kháng thể và hàm lượng kháng thể, ngay cả khi nhiều mức nhiệt phun khô được thử nghiệm từ 140- 1700C.
2.2.3.4 Tính ưu việt của công nghệ sản xuất IgY trên gà
Một số ưu điểm vượt trội của công nghệ sản xuất kháng thể IgY bằng cách gây miễn dịch cho gà mái và thu hoạch kháng thể từ trứng gà so với công nghệ sản xuất kháng thể IgG:
Do đặc tính sinh miễn dịch cao, gà có thể sản xuất kháng thể có hoạt tính cao chỉ cần sau 1 lần gây miễn dịch, nhưng để có kết quả tương tự như trên gà thì ở cừu người ta phải gây miễn dịch khoảng 4 lần. Sau khi gây miễn dịch, nồng độ IgY trong huyết thanh cao nhất ở ngày 7-9 sau khi tiêm kháng nguyên. IgY được tìm thấy trong lòng đỏ trứng từ ngày thứ 4-7 sau khi xuất hiện trong huyết thanh.
Vào thời kỳ gà đẻ ổn định, gà đẻ điều đặn khoảng 20 trứng/tháng, trong khi việc lấy máu với số lượng lớn trên động vật có vú không được thực hiện thường xuyên vì việc lấy máu và đặc biệt là lấy với số lượng lớn luôn tiềm ẩn các nguy cơ đối với sức khoẻ động vật. Ngoài ra các yêu cầu về điều kiện vô trùng trong quá trình lấy và bảo quản máu tương đối phức tạp hơn so với thao tác với trứng gà.
Sản lượng IgY thu được trung bình khoảng 100mg/trứng. Một năm gà đẻ khoảng 300 trứng, tổng sản lượng IgY thu được từ 1 con gà mái khoảng 30gam IgY tinh khiết. Lượng IgG thu được từ máu động vật có vú trung bình khoảng 5mg/ml máu. Tuỳ theo kích thước động vật (thỏ, cừu, ngựa,…), sản lượng kháng thể mỗi năm thu hoạch khác nhau. Tổng sản lượng kháng thể thu được từ một gà mái trong một năm bằng lượng kháng thể từ một con cừu 100kg hoặc một nửa con ngựa 200kg tạo ra. Với sản lượng kháng thể tạo ra lớn như vậy người ta thấy giá thành của kháng thể gà rẻ hơn 10 lần so với kháng thể sản xuất trên thỏ.
2.2.4 Phương pháp sản xuất kháng thể lòng đỏ trứng (IgY) bằng cách gây miễn dịch cho gà mái miễn dịch cho gà mái
2.2.4.1 Những yếu tố ảnh hưởng tới sự sản xuất IgY
Với sự kích thích của kháng nguyên mục tiêu, kháng thể IgY có thể được hình thành và gia tăng nhờ hệ thống miễn dịch của gà đẻ. Dù vậy, kết quả đáp ứng miễn dịch của gà được miễn dịch có thể không như dự đoán. Những yếu tố chính ảnh hưởng đến đáp ứng này là:
- Kháng nguyên. - Chất bổ trợ.
- Đường cấp kháng nguyên. - Tần suất gây nhiễm.
- Khoảng cách giữa các lần gây miễn dịch. - Khả năng đáp ứng miễn dịch của từng cá thể.
2.2.4.2 Hệ thống miễn dịch của gà
Hệ thống miễm dịch của gà bao gồm các tế bào, mô và phân tử tham gia vào chức năng đề kháng của gà. Tương tự như ở các động vật bậc cao, hệ thống miễn dịch của gà bao gồm các thành phần tạo nên đáp ứng miễn dịch tự nhiên và đáp ứng miễn dịch thích ứng:
Hệ thống miễn dịch thích ứng của gà bao gồm có tuyến ức nơi sinh ra các tế bào lympho T và túi Fabricius nơi sinh ra các tế bào lympho B. Các tế bào lympho T và B của gà tham gia cùng với các thành phần khác tạo nên đáp ứng miễn dịch dịch thể và đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào. Sau mỗi lần đáp ứng với sự xâm nhập của kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể, các tế bào lympho T và B của gà cũng tạo ra các tế bào mang trí nhớ miễn dịch có khả năng nhận diện và đáp ứng nhanh, mạnh hơn khi có sự tái xâm nhập của cùng kháng nguyên đó.
Gà có 3 lớp kháng thể là IgM, IgA và IgY. Trọng lượng phân tử, đặc điểm hình thái học và tính linh động của IgA và IgM ở gà là tương tự như các lớp này ở động vật có vú. So với IgM và IgA của gà, IgY của gà có trọng lượng phân tử thấp hơn, có trong máu gà và được chuyển qua chứa trong lòng đỏ trứng, từ đó có tên gọi là kháng thể lòng đỏ trứng (egg yolk immunoglobulin: IgY).
Năm 1893, Klemperer lần đầu tiên đã mô tả khả năng miễn dịch thụ động thu được ở gà. Ông đã chứng minh có sự thừa hưởng các yếu tố miễn dịch chống lại độc tố uốn ván từ gà mái sang gà con. Khả năng miễn dịch này sau đó đã được chứng minh có được là nhờ sự vận chuyển của kháng thể từ gà mẹ sang trứng và gà con. Từ đó hầu hết các tài liệu liên quan đến các kháng thể của gà đều đề cập đến việc vận chuyển của IgY từ máu gà mẹ sang tích luỹ ở lòng đỏ trứng như một cơ chế miễn dịch thụ động được chuyển từ gà mẹ sang bảo vệ phôi và gà con. IgY được vận chuyển từ máu gà mẹ sang gà con qua 2 bước:
- Bước 1: IgY được chuyển từ máu gà mái vào lòng đỏ trứng, tương tự như quá trình vận chuyển IgG qua nhau thai ở động vật có vú.
- Bước 2: IgY được chuyển từ lòng đỏ trứng sang phôi trong quá trình phát triển của phôi gà.
Sự tập trung IgY ở lòng đỏ trứng về cơ bản là thông qua sự chín của noãn bào. Ở trong trứng IgY không tồn tại ở lòng trắng trong khi IgA và IgM lại không có ở lòng đỏ trứng. Lượng IgY được kết lại trong lòng đỏ trứng từ
ngày thứ 7 trở đi cho đến ít nhất là ngày thứ 18. Trên noãn bào có các thụ thể (receptor) ái lực cao và thấp dành cho IgY. IgY sẽ gắn kết với thụ thể đặc hiệu của nó trên bề mặt noãn bào để chuyển từ máu gà mái sang trứng. Khi IgY đặc hiệu xuất hiện trong huyết thanh thì sau 3 đến 4 ngày mới thấy IgY đặc hiệu đó xuất hiện trong lòng đỏ trứng.
Hình 2.4 Sự truyền kháng thể qua trứng
http://www.igybiotech.com/IgYOverview/tabid/75/Default.aspx
2.2.4.3 Tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng gà a) Phương pháp kết tủa a) Phương pháp kết tủa
IgY có bản chất là protein nên có thể được tinh sạch sơ bộ bằng cách kết tủa với các loại muối, dung môi hữu cơ, hay thay đổi pH của dung dịch. Muối ammonium sulphate (AS) là loại muối thường được dùng để tách chiết sơ bộ protein trong hỗn hợp nhiều tạp chất. Tủa protein bằng muối AS với các nồng độ muối bảo hoà khác nhau là phương pháp được áp dụng phổ biến do muối AS có tính trơ nên không gây biến tính protein. Trong dung dịch đệm, các nhóm phân cực trên bề mặt protein sẽ liên kết với các phân tử nước bao quanh liên kết hydro tạo một lớp áo nước bên ngoài phân tử tạo tính tan cho protein. Ở nồng độ cao muối sẽ phá vỡ liên kết hydro và bắt lấy các phân tử nước. Phân tử protein mất lớp áo nước có khuynh hướng ngưng kết với nhau và tạo tủa. Các protein khác nhau sẽ kết tủa ở các nồng độ muối khác nhau (Dương Thị Hương Giang, 2005).
a) Phương phấp thẩm tích
Phương pháp này được thực hiện nhằm mục đích loại muối trong dung dịch protein hoặc thay đổi môi trường dung dịch đệm qua túi thẩm tích. Túi này có cấu tạo giống như màng bán thấm, trên bề mặt túi có những lổ nhỏ với kích thước thích hợp nhằm giữ lại các protein cần nghiên cứu và cho phép các phân tử nhỏ đi qua. Khi đặt túi trong môi trường dung dịch đệm với nồng độ muối thấp hay nước cất, muối từ bên trong túi sẽ khuếch tán ra ngoài để cân bằng nồng độ, thay dung dịch bên ngoài túi nhiều lần sẽ loại được muối hoàn toàn.
Ống dẫn trứng
Buồng
Hình 2.5 Phương pháp thẩm tích để loại muối
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nội dung nghiên cứu
- Phân lập và định danh virus viêm gan từ các đàn vịt bệnh tại thành phố Cần Thơ.
- Sản xuất kháng thể lòng đỏ trứng bằng cách tối miễn dịch với các chủng virus phân lập được.
3.2 Phương tiện nghiên cứu
3.2.1 Thời gian: từ tháng 6/2014 đến tháng 12/2014.
3.2.2 Địa điểm: phòng thí nghiệm virus học, bộ môn Thú Y, khoa Nông nghiệp và sinh học ứng dụng, trại nghiên cứu và thực nghiệm nông nghiệp nghiệp và sinh học ứng dụng, trại nghiên cứu và thực nghiệm nông nghiệp trường Đại học Cần Thơ.
3.2.3 Đối tượng nghiên cứu
- Vịt bệnh được lấy từ các hộ chăn nuôi trên địa bàn thành phố Cần Thơ có triệu chứng bệnh tích viêm gan do virus điển hình.
- Trứng vịt được lấy từ những đàn vịt đẻ thương phẩm của người dân đã kiểm tra âm tính với virus viêm gan vịt và không có kháng thể viêm gan vịt trong máu. Trứng được ấp lấy phôi dùng nuôi cấy tế bào, phân lập virus qua phôi vịt, dùng để tính liều gây chết phôi 50% (ELD50).
- Gà đẻ giống Hisex-Brown 17 tuần tuổi mua từ trại chăn nuôi đã được kiểm tra không có kháng thể kháng virus viêm gan vịt trong máu.
3.2.4 Dụng cụ, trang thiết bị và sinh phẩm
- Phôi vịt 10-14 ngày tuổi được lấy từ những vịt bố mẹ khỏe mạnh không nhiễm virus viêm gan vịt cũng như chưa được tiêm phòng vaccine viêm gan vịt.
- Kéo, kẹp, lồng, ống nghiệm. - Ống tiêm loại 1ml và 5ml. - Dùi tiêm trứng.
- Nước sinh lý 0,9%, cồn 700, cồn Iod 5%, chloroform 5%. - Kháng sinh: penicillin, streptomycin.
- Tủ ấm 370C, buồng ấp trứng, đèn soi trứng, khay đựng trứng.
- Máy ly tâm, buồng cấy vô trùng, tủ sấy, máy sấy từ, máy đo pH, tủ lạnh, tủ đông -200C và máy móc và trang thiết bị có sẵn tại phòng thí nghiệm.
- Giống gà: gà mái đẻ trứng (đang trong giai đoạn sản xuất). - Thức ăn: cho ăn theo tiêu chuẩn gà đẻ thương phẩm.
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phân lập và định danh virus viêm gan vịt trên địa bàn thành phố Cần Thơ
3.3.1.1 Phương pháp chọn và xử lý mẫua) Phương pháp lấy mẫu a) Phương pháp lấy mẫu
Tiến hành lấy mẫu từ 8 đàn vịt mắc bệnh viêm gan do virus tại thành phố Cần Thơ (mỗi đàn lấy 4 mẫu). Mẫu (bao gồm: gan, thận và lách) được lấy từ những đàn vịt con dưới 6 tuần tuổi chưa được tiêm vaccine phòng bệnh viêm