Các mẫu bệnh phẩm sau khi xử lý, ta sẽ có 8 mẫu huyễn dịch bệnh phẩm từ 8 đàn vịt bệnh để tiến hành định danh virus viêm gan vịt bằng phương pháp RT-PCR. Sau đó các mẫu bệnh phẩm cho kết quả dương tính sẽ được tiến hành phân lập virus trên phôi vịt.
- Chuẩn bị trứng: Trứng có phôi từ 12 ngày tuổi, phát triển bình thường, và là những trứng được thu từ đàn vịt không tiêm vaccine viêm gan vịt và được xác định trong trứng không có kháng thể chống lại virus viêm gan vịt. Đánh dấu buồng hơi, vị trí phôi và mạch máu. Sát trùng toàn bộ phần vỏ trứng bằng cồn 700, sát trùng vùng buồng hơi bằng cồn Iod 5%.
- Tiêm Trứng: Tiêm trứng trong buồng cấy vô trùng, trứng được sát trùng, dùng dùi đục trứng tạo một lỗ trên đỉnh buồng hơi và một lỗ bên thân
Ký hiệu mồi Trình tự mồi (5’3’) Vị trí khuếch đại Sản phẩm PCR DHAV-1F 5’-CAACTCGACCAATACCTGG-3’ DHAV-1R 5’-CCTGATGGACCATTGTGACTG-3’ 1880-2371 492bp
DHAV-2F 5’-TTG GGT GCA ATC CAGACA CT-3’
DHAV-2R 5’-AGT AGG TCA TCA CCG TAG GC-3’
2741-3085 343bp
DHAV-3F 5’ –GAAATCTGCACTCAATGGAGAG-3’
DHAV-3R 5’ –CCCAGGAAATGATTGGTCAG-3’
quả trứng, tránh phôi và mạch máu. Dùng ống tiêm hút 0,2ml huyễn dịch bệnh phẩm để tiêm vào xoang niệu mô. Dùng parafin hàn kín lỗ tiêm, để trứng vào khay và cho vào máy ấp trứng ở 370C.
Sau khi tiêm trứng 18 giờ, soi trứng kiểm tra ngày 3 lần, theo dõi thời gian chết phôi, sau khi gây nhiễm, virus sẽ gây chết phôi trong vòng 24-72 giờ. Những phôi chết sẽ có triệu chứng là xuất huyết, nước trứng hơi vàng. Những phôi chết và sống đều tiến hành mổ khám kiểm tra bệnh tích đại thể của phôi, đồng thời thu nhận nước trứng để phục vụ cho các thí nghiệm khác.
Chỉ tiêu theo dõi:
Tỉ lệ chết phôi theo thời gian = (Số phôi chết cùng thời điểm / Tổng số
phôi vịt thí nghiệm) x 100
Tần suất xuất hiện bệnh tích trên phôi = (Số phôi có cùng bệnh tích / Tổng số phôi vịt thí nghiệm) x 100
3.3.2 Chuẩn độ virus viêm gan vịt trên phôi bằng phương pháp xác định liều gây chết 50% (ELD50)
Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm tính liều ELD50 của dịch virus viêm gan vịt trên phôi
Độ pha loãng virus
Số phôi được
tiêm Liều tiêm (ml/phôi) Vị trí tiêm
104 5 0,2 ml Xoang niệu mô
10-5 5 0,2 ml Xoang niệu mô
10-6 5 0,2 ml Xoang niệu mô
10-7 5 0,2 ml Xoang niệu mô
10-8 5 0,2 ml Xoang niệu mô
10-9 5 0,2 ml Xoang niệu mô
10-10 5 0,2 ml Xoang niệu mô
10-11 5 0,2 ml Xoang niệu mô
10-12 5 0,2 ml Xoang niệu mô
Chuẩn bị phôi vịt 12 ngày tuổi: chọn những trứng vịt sạch được chọn từ những đàn vịt bố mẹ khoẻ mạnh, chưa được tiêm phòng. Sát trùng bằng cồn 700, sau đó đưa vào máy ấp với nhiệt độ 370C khi ấp trứng được 5-7 ngày thì tiến hành soi trứng để loại bỏ những trứng không phôi, trứng hư. Chọn 30 trứng có phôi ấp khi được 10 ngày tuổi thì lấy ra kiểm tra những trứng có phôi mới gây nhiễm virus viêm gan vịt.
Nguyên tắc: pha loãng huyễn dịch virus với dung dịch PBS thành những nồng độ lệch nhau 10 lần. Từ mỗi nồng độ pha loãng tiêm cho 5 trứng. Sau một thời gian nhất định (khoảng 3-5 ngày) chú ý xem ở mỗi nồng độ có bao nhiêu phôi bị chết. Từ kết quả thu được tính xem ở độ pha loãng nào có 50% số phôi bị nhiễm virus, nghĩa là ở độ pha loãng đó với liều tiêm đã biết chứa một liều gây chết 50%. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cách tiêm: thực hiện tương tự như cách tiêm trứng ở phương pháp phân
lập virus trên phôi vịt.
Cách tính liều ELD50: tính liều ELD50 nhờ vào phương pháp Biometry của Reed & Muench (1938).
50 50% 50% 50% L dp L L Lg ELD50 = Lg LD<50% + dp x lgf Chú thích: - dp: proportion dose. - L<50%: phần trăm tử số chết dưới 50%. - L>50%: phần trăm tử số chết trên 50%. - lgf: Lg10 = 1.
3.3.3 Sản xuất kháng thể viêm gan vịt do virus
Sau khi phân lập, định danh được các chủng virus có trên thực địa ta tiến hành sản xuất kháng thể viêm gan vịt do virus từ các chủng trên.
Tạo đàn gà sản xuất trứng
Sử dụng 30 gà mái đẻ giống Hisex-Brown 17 tuần tuổi, chia thành 10 lô nuôi mỗi lô 3 con.
Chăm sóc nuôi dưỡng + Nước uống
Đảm bảo đủ nước uống. Nước uống cho gà đẻ trứng xử lý trước khi cho uống theo tỷ lệ 1ml Vime-iodine/2 lít nước.
+ Quản lý dịch bệnh
Tiêm phòng các bệnh nguy hiểm như: Newcatle, Gumboro, cúm gia cầm,…
Bảng 3.5 Quy trình tiêm thuốc và phòng bệnh cho gà đẻ
3.3.3.1 Gây miễn dịch trên gà thí nghiệm
Tiêm kháng nguyên là virus viêm gan vịt các type phân lập được cho gà mái và gà sẽ sản xuất kháng thể đặc hiệu truyền qua trứng.
Gà thí nghiệm được chia ra làm 10 nghiệm thức thí nghiệm gồm 9 nghiệm thức tiêm kháng nguyên và 1 nghiệm thức đối chứng gà được tiêm
Ngày tuổi
Tên vaccine Tên thuốc Liều lượng
1-5 IB+ND (B1) nhỏ mắt Enrofloxaxine
Amoxicline
20mg/KgP 30mg/KgP
7 IBD GM97 uống Vitamin 1ml/2l nước
8 Vitamin 12 Vitamin 13 IB + ND ( LASOTA) nhỏ mắt IBD 228E uống H5N1 tiêm dưới da cổ Vitamin 1ml/2l nước 18 IBD 228E uống IB + ND (LASOTA) nhỏ mắt 33 Powlpox chủng qua da cánh 34-38 Tylofos 1g/1 lít nước 39-42 Coxcicline 1g/1 lít nước
47 ND KILLED tiêm cơ ức
H5N1 tiêm dưới da cổ Vitamin 1ml/2 lít nước 49-53 Hipra-Enro-S Hipra-Enro-S Amoxicline 20mg/KgP 30mg/KgP 56-60 Tylosine 110mg/KgP 62 ILT nhỏ mũi
CORYZA tiêm cơ ức
70 IB4/9l uống
dung dịch PBS, mỗi nghiệm thức thí nghiệm, mỗi gà được tiêm 1 liều lần lượt 104ELD50, 106ELD50, 108ELD50 (2 vị trí bên ức trái và 2 vị trí bên ức phải của gà thí nghiệm), với số lần lập lại khác nhau từ 1 đến 3 lần cho các nghiệm thức, liều tiêm 1ml/lần/gà (liều tiêm 0,25ml/vị trí).
Bảng 3.6 Bố trí thí nghiệm gây miễn dịch gà
104/1: gây miễn dịch 1 lần, liều 104ELD50. 106/3: gây miễn dịch 3 lần, liều 106ELD50. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
104/2: gây miễn dịch 2 lần, liều 104ELD50. 108/1: gây miễn dịch 1 lần, liều 108ELD50.
104/3: gây miễn dịch 3 lần, liều 104ELD50. 108/2: gây miễn dịch 2 lần, liều 108ELD50.
106/1: gây miễn dịch 1 lần, liều 106ELD50. 108/3: gây miễn dịch 3 lần, liều 108ELD50.
106/2: gây miễn dịch 2 lần, liều 106ELD50. Đc: tiêm PBS 3 lần.
Nghiệm Số gà thí Liều virus Liều tiêm Đường tiêm Lập lại
104/1 3 104 1 Cơ ức 1 104/2 3 104 1 Cơ ức 2 104/3 3 104 1 Cơ ức 3 106/1 3 106 1 Cơ ức 1 106/2 3 106 1 Cơ ức 2 106/3 3 106 1 Cơ ức 3 108/1 3 108 1 Cơ ức 1 108/2 3 108 1 Cơ ức 2 108/3 3 108 1 Cơ ức 3 Đc 3 PBS 1 Cơ ức 3
Bảng 3.7 Quy trình tiêm kháng nguyên và lấy máu
Lô 1 Lô 2 Lô 3
Tuần Tiêm Lấy máu Tiêm Lấy máu Tiêm Lấy máu
1 X X X 2 X X X 3 X X X 4 X X X 5 X X X 6 X X X 7 X X X 8 X X X 9 X X X 10 X X 11 X X: có thực hiện.
Bố trí thí nghiệm 1, 2, 3 như trên bảng 3.6, với nồng độ virus lần lượt là 104, 106, 108 ELD50 theo lịch trình tiêm kháng nguyên và lấy máu như trên bảng 3.7, mỗi lô 3 gà mái đẻ.
Lần 1: gà tiêm lần đầu ở lô 1, 2, 3 của 3 thí nghiệm, thí nghiệm 1 với liều virus 104 ELD50, thí nghiệm 2 với liều virus 106 ELD50, thí nghiệm 3 với liều virus 108 ELD50.
Lần 2: sau 1 tuần kể từ tuần đầu tiên, tiêm lặp lại ở lô 2, 3 của thí
nghiệm 1 với liều virus 104 ELD50, thí nghiệm 2 với liều virus 106 ELD50, thí nghiệm 3 với liều virus 108 ELD50.
Lần 3: sau 2 tuần kể từ lần đầu tiên, tiêm lặp lại ở lô 3 của thí nghiệm 1 với liều virus 104 ELD50, thí nghiệm 2 với liều virus 106 ELD50, thí nghiệm 3 với liều virus 108 ELD50.
3.3.3.2 Thu hoạch trứng và lấy máu gà mái kiểm tra hiệu giá kháng thể
Trứng thu hoạch hằng tuần theo lịch trình lấy trứng của từng lô thí nghiệm, đánh dấu bằng bút chì, trữ ở 40C không quá 7 ngày đến khi xử lý.
Máu gà được lấy ở tĩnh mạch cánh, 2-3ml/con và được kí hiệu theo từng lô riêng biệt. Máu lấy xong để yên trong ống nghiệm để chắt huyết thanh, sau đó cho huyết thanh vào ependop và ký hiệu, dán paraffin và trữ lạnh trong thùng đá mang về phòng thí nghiệm và chờ làm phản ứng trung hoà xác định hiệu giá kháng thể.
Quy trình lấy máu để kiểm tra kháng thể đặc hiệu như sau
Lấy máu trước khi gây miễn dịch. Sau khi gây miễn dịch tiến hành lấy máu hàng tuần của tất cả các lô của 3 nghiệm thức. Riêng tuần đầu chỉ lấy máu ở lô 1 của 3 nghiệm thức, tuần thứ 2 chỉ lấy máu lô 1 và 2 của 3 nghiệm thức, tuần thứ 11 chỉ lấy máu ở lô 3 của 3 nghiệm thức. Các tuần còn lại từ 3- 10 tiến hành láy máu ở tất cả các lô của cả 3 nghiệm thức.
3.3.3.3 Phương pháp tách chiết và tinh sạch kháng thể từ lòng đỏ trứng
IgY từ lòng đỏ trứng gà đã gây miễn dịch được tách chiết và tinh sạch theo quy trình sau (Dương Thị Hương Giang, 2005):
Quy trình tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng
Phần nổi tiếp tục tủa với muối AS 40% bão hoà, ở 40C
Ly tâm 4000 vòng/phút, trong 30 phút, ở 40C, thu phần kết tủa
Hoà tan kết tủa trong nước cất ở 40C Sau đó tiến hành thẩm tích để loại muối Lòng đỏ trứng (40C) + 9 lần nước cất (40C)
Làm đồng nhất (đánh tan) trong 30 phút
Điều chỉnh pH = 5 (sử dụng HCl 1N) Giữ qua đêm (24h)
Ly tâm 7000 vòng/phút trong 20 phút, ở 40C
Thu phần nổi, bỏ cặn lắng Lấy lòng đỏ lăn trên giấy thấm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tủa phân đoạn 1 với muối AS 40% bão hoà, ở 40C, trong 2 giờ
a) Chuẩn bị tách chiết lòng đỏ
- Mục đích: Loại bỏ lipid thu được IgY dạng thô và tinh sạch IgY từ dịch chiết thô nhằm loại bỏ một số protein tạp không phải IgY.
- Tiến hành
+ Bước 1: Tách chiết trứng
Chế nước trứng (WSF: water-solube fraction): Trứng được tách riêng lòng đỏ và lòng trắng. Lòng đỏ cho lên giấy Whatman No.1, sau đó chọc thủng lớp bao cho lòng đỏ chảy vào trong cốc.
+ Bước 2: Tách chiết lòng đỏ
Lòng đỏ trứng gà pha với nước cất để lạnh 40C ở tỷ lệ 1:9, điều chỉnh pH về 5, khuấy dung dịch với tốc độ cao. Để lắng qua đêm ở 40C, ly tâm dung dịch 7000 vòng/phút, trong 20 phút ở 40C, sau khi ly tâm ta thu phần nổi bỏ phần cặn lắng, sau đó, lọc qua giấy Whatman No.1 để loại bỏ lipid thu được dịch lọc. Trữ dịch lọc trong điều kiện lạnh ở 40C chờ kết tủa với muối AS.
+ Tủa muối lần 1
Dịch lọc sẽ được tủa với muối AS 40%, mỗi phân đoạn tủa được ủ ở 40C, trong 2 giờ, ly tâm lần 1 với 4000 vòng trong 30 phút bỏ phần nổi lấy phần cặn.
+ Tủa muối lần 2
Phần nổi tiếp tục được làm kết tủa lần 2 với muối AS 40% điều chỉnh pH=5, trữ ở 40C trong 2 giờ, sau đó đem ly tâm lần 2 với 4000 vòng/phút trong 30 phút ở 40C, thu phần tủa. Phần kết tủa của 2 lần tủa muối AS được hoà tan trong PBS, điều chỉnh pH =7,4. Sau đó tiến hành thẩm tích để loại muối.
b) Phương pháp thẩm tích
- Mục đích: loại muối.
Chuẩn bị túi thẩm tích: đun túi trong 200ml trong dung dịch NaHCO3 10mM, khoảng 10 phút.
Rửa 3 lần bằng nước cất, ngâm túi trong dung dịch EDTA 1ml trong 1 giờ, rửa lại 3 lần bằng nước cất.
Bảo quản túi trong cồn 20% và giữ ở 40C. - Tiến hành
Cắt một đoạn túi thẩm tích chứa vừa đủ lượng dung dịch protein. Rửa túi bằng nước cất và cột chặt một đầu túi bằng chỉ. Cho dung dịch protein vào, buộc chặt đầu túi còn lại. Đặt túi vào cốc lớn có chứa nước cất. Quá trình thẩm tích được tiến hành 40C, khuấy đều trong 6 giờ (thay nước cất 3 lần, cách 2 giờ 1 lần). Dung dịch protein sau khi thẩm tích được trữ ở -200C và được dùng để tiến hành các phản ứng trung hoà kiểm tra kháng thể IgY.
3.3.3.4 Kiểm tra hiệu giá kháng thể IgY trong máu và trứnga) Tạo lớp tế bào xơ phôi vịt sơ cấp a) Tạo lớp tế bào xơ phôi vịt sơ cấp
Tạo điều kiện vô trùng trước, trong và sau khi nuôi cấy tế bào, bao gồm tủ, dụng cụ nuôi cấy, hoá chất và sinh phẩm, người thực hiện…
Quy trình tạo lớp đơn tế bào DEF được thực hiện theo phương pháp của Doyle và Griffiths (1998), thực hiện theo sơ đồ sau:
Quy trình chuẩn bị lớp tế bào xơ phôi vịt
Tế bào lớp đơn DEF
Ly tâm dịch lọc 1000 vòng/phút ở nhiệt độ 40C trong 15 phút. Thu cặn Tiếp tục cho trypsin – EDTA vào, khuấy ở nhiệt độ phòng trong 30 phút
Lọc qua đầu lọc tế bào 70 µm, thu dịch cho vào ống falcon vô trùng Loại đầu, chi và nội tạng. Cắt nhỏ mô phôi, rửa 2-3 lần với đệm PBS Rửa mảnh mô phôi 1 lần với trypsin – EDTA 0,05% (đã được làm ấm
370C)
Làm rạn và cắt vòng quanh đầu vỏ trứng phần trên buồng khí. Kẹp cổ Soi và chọn trứng vịt có phôi 9-11 ngày. Lau sạch vỏ trứng bằng cồn 700
Phân phối dịch tế bào vào đĩa nuôi cấy hoặc bình roux ở mật độ 5.105 tế
bào/ml (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cho vào MTTT, dùng vortex hay micropipette để huyền phù tế bào
Nhuộm tế bào, đếm và tính số tế bào/ml bằng buồng đếm Neubauer Cho đệm DPBS vào huyền phù. Ly tâm 1000 vòng/phút, 40C, 15 phút.
Thu cặn
Cho MTTT vào huyền phù. Ly tâm 1000 vòng/phút, 40C, 15 phút. Thu cặn
Số lượng tế bào chứa trong 1ml hỗn dịch tế bào được tính theo công thức (Doyle và Griffiths, 1998):
X= (a x 100 x 2)/y
X: số lượng tế bào trong 1ml hỗn dịch. A: số tế bào đếm được trong cả buồng đếm. y: thể tích buồng đếm tính bằng cm3.
100: số mm3 trong 1cm3.
2: hệ số pha loãng hỗn dịch tế bào với thuốc nhuộm 1:1.
b) Thực hiện phản ứng trung hoà
Phản ứng trung hòa được dùng để kiểm tra hiệu giá kháng thể viêm gan vịt có trong máu và trứng.
- Chuẩn bị
Các lớp nguyên bào sợi vịt được chuẩn bị trên đĩa nuôi cấy 96 giếng với mật độ phủ 90% diện tích bề mặt đáy giếng. Pha huyễn dịch virus viêm gan vịt chuẩn với môi trường MEM liều 500 TCID50/50µl.
- Tiến hành trên đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng
Cho môi trường nuôi cấy MEM (không có FCS: Fetal calf serum (Huyết thanh thai bê)) vào tất cả các giếng của đĩa: 50µl/giếng.Sau đó cho mẫu kháng thể kiểm tra: 50µl vào giếng đầu tiên bên trái của đĩa.
Pha loãng mẫu kháng thể kiểm tra theo bậc 2 (1/2, 1/4,...) từ giếng đầu tiên đến giếng 16 của đĩa. Sau đó cho 50µl dịch virus chứa 500 TCID50 vàocác giếng đã có kháng thể pha loãng với các nồng độ khác nhau.
Ủ đĩa nuôi cấy ở tủ ấm CO2 (5%) ở nhiệt độ 370C trong 1 giờ.
Cho hỗn hợp kháng thể-virus sau ủ lên lớp nguyên bào sợi. Tiếp tục ủ đĩa ở 370C trong 1 giờ.
Rút dịch hỗn hợp kháng thể-virus ra khỏi lớp tế bào, bổ sung MTDT vào thêm và theo dõi đến 3 ngày, soi đĩa hàng ngày dưới kính hiển vi để kiểm tra bệnh tích tế bào.
- Đánh giá kết quả
Nếu kháng thể ở độ pha loãng có lượng kháng thể trung hoà được hoàn toàn virus viêm gan vịt sẽ không xuất hiện CPE, ngược lại ở độ pha loãng