a) Phương pháp kết tủa
IgY có bản chất là protein nên có thể được tinh sạch sơ bộ bằng cách kết tủa với các loại muối, dung môi hữu cơ, hay thay đổi pH của dung dịch. Muối ammonium sulphate (AS) là loại muối thường được dùng để tách chiết sơ bộ protein trong hỗn hợp nhiều tạp chất. Tủa protein bằng muối AS với các nồng độ muối bảo hoà khác nhau là phương pháp được áp dụng phổ biến do muối AS có tính trơ nên không gây biến tính protein. Trong dung dịch đệm, các nhóm phân cực trên bề mặt protein sẽ liên kết với các phân tử nước bao quanh liên kết hydro tạo một lớp áo nước bên ngoài phân tử tạo tính tan cho protein. Ở nồng độ cao muối sẽ phá vỡ liên kết hydro và bắt lấy các phân tử nước. Phân tử protein mất lớp áo nước có khuynh hướng ngưng kết với nhau và tạo tủa. Các protein khác nhau sẽ kết tủa ở các nồng độ muối khác nhau (Dương Thị Hương Giang, 2005).
a) Phương phấp thẩm tích
Phương pháp này được thực hiện nhằm mục đích loại muối trong dung dịch protein hoặc thay đổi môi trường dung dịch đệm qua túi thẩm tích. Túi này có cấu tạo giống như màng bán thấm, trên bề mặt túi có những lổ nhỏ với kích thước thích hợp nhằm giữ lại các protein cần nghiên cứu và cho phép các phân tử nhỏ đi qua. Khi đặt túi trong môi trường dung dịch đệm với nồng độ muối thấp hay nước cất, muối từ bên trong túi sẽ khuếch tán ra ngoài để cân bằng nồng độ, thay dung dịch bên ngoài túi nhiều lần sẽ loại được muối hoàn toàn.
Ống dẫn trứng
Buồng
Hình 2.5 Phương pháp thẩm tích để loại muối
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nội dung nghiên cứu
- Phân lập và định danh virus viêm gan từ các đàn vịt bệnh tại thành phố Cần Thơ.
- Sản xuất kháng thể lòng đỏ trứng bằng cách tối miễn dịch với các chủng virus phân lập được.
3.2 Phương tiện nghiên cứu
3.2.1 Thời gian: từ tháng 6/2014 đến tháng 12/2014.
3.2.2 Địa điểm: phòng thí nghiệm virus học, bộ môn Thú Y, khoa Nông nghiệp và sinh học ứng dụng, trại nghiên cứu và thực nghiệm nông nghiệp nghiệp và sinh học ứng dụng, trại nghiên cứu và thực nghiệm nông nghiệp trường Đại học Cần Thơ.
3.2.3 Đối tượng nghiên cứu
- Vịt bệnh được lấy từ các hộ chăn nuôi trên địa bàn thành phố Cần Thơ có triệu chứng bệnh tích viêm gan do virus điển hình.
- Trứng vịt được lấy từ những đàn vịt đẻ thương phẩm của người dân đã kiểm tra âm tính với virus viêm gan vịt và không có kháng thể viêm gan vịt trong máu. Trứng được ấp lấy phôi dùng nuôi cấy tế bào, phân lập virus qua phôi vịt, dùng để tính liều gây chết phôi 50% (ELD50).
- Gà đẻ giống Hisex-Brown 17 tuần tuổi mua từ trại chăn nuôi đã được kiểm tra không có kháng thể kháng virus viêm gan vịt trong máu.
3.2.4 Dụng cụ, trang thiết bị và sinh phẩm
- Phôi vịt 10-14 ngày tuổi được lấy từ những vịt bố mẹ khỏe mạnh không nhiễm virus viêm gan vịt cũng như chưa được tiêm phòng vaccine viêm gan vịt.
- Kéo, kẹp, lồng, ống nghiệm. - Ống tiêm loại 1ml và 5ml. - Dùi tiêm trứng.
- Nước sinh lý 0,9%, cồn 700, cồn Iod 5%, chloroform 5%. - Kháng sinh: penicillin, streptomycin.
- Tủ ấm 370C, buồng ấp trứng, đèn soi trứng, khay đựng trứng.
- Máy ly tâm, buồng cấy vô trùng, tủ sấy, máy sấy từ, máy đo pH, tủ lạnh, tủ đông -200C và máy móc và trang thiết bị có sẵn tại phòng thí nghiệm.
- Giống gà: gà mái đẻ trứng (đang trong giai đoạn sản xuất). - Thức ăn: cho ăn theo tiêu chuẩn gà đẻ thương phẩm.
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phân lập và định danh virus viêm gan vịt trên địa bàn thành phố Cần Thơ
3.3.1.1 Phương pháp chọn và xử lý mẫua) Phương pháp lấy mẫu a) Phương pháp lấy mẫu
Tiến hành lấy mẫu từ 8 đàn vịt mắc bệnh viêm gan do virus tại thành phố Cần Thơ (mỗi đàn lấy 4 mẫu). Mẫu (bao gồm: gan, thận và lách) được lấy từ những đàn vịt con dưới 6 tuần tuổi chưa được tiêm vaccine phòng bệnh viêm gan vịt và có biểu hiện các triệu chứng, bệnh tích điển hình của bệnh (Vịt con chết nhanh, co giật, lúc chết đầu ngẹo ra sau, khi mổ khám thấy gan, lách, thận sưng to, xuất huyết, hoại tử), tại các hộ chăn nuôi vịt trên địa bàn thành phố Cần Thơ, cho mẫu vào bao nylon, sau đó cho vào thùng để trữ lạnh trong quá trình vận chuyển từ nơi lấy mẫu đến phòng thí nghiệm, rồi trữ đông ở -200C chờ xét nghiệm.
b) Phương pháp xử lý mẫu
Bệnh phẩm gan, thận, lách nghiền trong cối chày sứ với dung dịch PBS thành huyễn dịch 10% sau đó xử lý với kháng sinh penicillin (200UI/ml) và streptomycin (200µg/ml), hoặc có thể lọc vô trùng qua màng lọc cỡ lỗ 0,45µm. Ly tâm huyễn dịch bệnh phẩm 2000 vòng/phút trong 15 phút. Hút lấy dịch nước trong ở phía trên khoảng 3ml đến 4ml, xử lý dịch thu được bằng chloroform 5% trong 15 phút ở nhiệt độ phòng. Kiểm tra vô trùng của mẫu trên môi trường BHI (canh thang nước tim não) hoặc môi trường thạch máu.
3.3.1.2 Phương pháp giám định virus bằng RT-PCR (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dịch virus thu được sau khi xử lý mẫu sẽ được sử dụng để tiến hành định danh virus bằng phương pháp RT-PCR.
a) Tách chiết hệ gen virus
Bộ kit tách chiết RNA bằng Phenol/Chloroform: NApRNA Extraction Kit (VA.A92-002B) để tiến hành tách chiết hệ gen của virus viêm gan vịt và
bảo quản ở nhiệt độ - 200C cho đến khi sử dụng.
b) Thực hiện phản ứng RT-PCR
Phản ứng RT-PCR được tiến hành qua 2 giai đoạn, bao gồm giai đoạn RT (Reverse transcription: phản ứng sao chép ngược chuyển mRNA thành cDNA) và giai đoạn PCR (polymerase chain reaction: phản ứng nhân gen). Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng bộ Tetro cDNA Synthesis Kit của hãng BIOLINE (Anh) để chuyển mRNA thành cDNA, sau đó thực hiện phản ứng PCR theo qui trình của Công ty cổ phần công nghệ Việt Á.
Bảng 3.1 Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RT (reverse transcription) chuyển RNA thành cDNA
Chu trình nhiệt cho phản ứng RT.
450C 30 phút 850C 5 phút Thực hiện 1 chu kỳ
Kết thúc phản ứng trữ mẫu ở -200C đến khi thực hiện phản ứng PCR.
Bảng 3.2 Thành phần của phản ứng PCR
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR.
940C 5 phút 940C 1 phút 30 giây 520C 1 phút 720C 1 phút 30 giây 35 chu kỳ 720C 7 phút Thành phần phản ứng Thể tích Random Hexamer 1 l 10mM dNTP mix 1 l 5x RT Buffer 4 l
Ribosafe Rnase Inhibitor 1 l
Tetro Reverse Transcriptase (200u/l) 1 l RNA Tổng cộng 12 l 20l Thành phần phản ứng Thể tích H2O Biopure 27 l
iStandard PCR Master Mix 2X 20 l
Primer DHAV-Fs 0,5 l Primer DHAV-Rs 0,5 l cDNA Tổng cộng 2 l 50 l
Các cặp mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR: nghiên cứu này sử dụng 3 cặp mồi để xác định virus viêm gan A vịt:
Cặp mồi 1: mồi xuôi, ký hiệu: DHAV-1F và mồi ngược, ký hiệu: DHAV-1R dùng để xác định virus viêm gan A vịt type I (theo Chen et al., 2012)
Cặp mồi 2: mồi xuôi, ký hiệu: DHAV-2F và mồi ngược, ký hiệu: DHAV-2R dùng để xác định virus viêm gan A vịt type II (theo Chou et al., 2013)
Cặp mồi 3: mồi xuôi, ký hiệu: DHAV-3F và mồi ngược, ký hiệu: DHAV-3R dung để xác định virus viêm gan A vịt type III (theo Chen et al., 2012)
Bảng 3.3 Các trình tự mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR
c) Phát hiện các sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di
Sau khi kết thúc phản ứng RT-PCR, lấy sản phẩm đem điện di trên gel agarose 1,5% để phát hiện sản phẩm RT-PCR. Sau khi kết thúc điện di, lấy sản phẩm soi trên máy Dolphin-DOC và chụp ảnh lưu giữ mẫu để kiểm tra.
3.3.1.3 Phương pháp phân lập virus trên phôi vịt
Các mẫu bệnh phẩm sau khi xử lý, ta sẽ có 8 mẫu huyễn dịch bệnh phẩm từ 8 đàn vịt bệnh để tiến hành định danh virus viêm gan vịt bằng phương pháp RT-PCR. Sau đó các mẫu bệnh phẩm cho kết quả dương tính sẽ được tiến hành phân lập virus trên phôi vịt.
- Chuẩn bị trứng: Trứng có phôi từ 12 ngày tuổi, phát triển bình thường, và là những trứng được thu từ đàn vịt không tiêm vaccine viêm gan vịt và được xác định trong trứng không có kháng thể chống lại virus viêm gan vịt. Đánh dấu buồng hơi, vị trí phôi và mạch máu. Sát trùng toàn bộ phần vỏ trứng bằng cồn 700, sát trùng vùng buồng hơi bằng cồn Iod 5%.
- Tiêm Trứng: Tiêm trứng trong buồng cấy vô trùng, trứng được sát trùng, dùng dùi đục trứng tạo một lỗ trên đỉnh buồng hơi và một lỗ bên thân
Ký hiệu mồi Trình tự mồi (5’3’) Vị trí khuếch đại Sản phẩm PCR DHAV-1F 5’-CAACTCGACCAATACCTGG-3’ DHAV-1R 5’-CCTGATGGACCATTGTGACTG-3’ 1880-2371 492bp
DHAV-2F 5’-TTG GGT GCA ATC CAGACA CT-3’ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
DHAV-2R 5’-AGT AGG TCA TCA CCG TAG GC-3’
2741-3085 343bp
DHAV-3F 5’ –GAAATCTGCACTCAATGGAGAG-3’
DHAV-3R 5’ –CCCAGGAAATGATTGGTCAG-3’
quả trứng, tránh phôi và mạch máu. Dùng ống tiêm hút 0,2ml huyễn dịch bệnh phẩm để tiêm vào xoang niệu mô. Dùng parafin hàn kín lỗ tiêm, để trứng vào khay và cho vào máy ấp trứng ở 370C.
Sau khi tiêm trứng 18 giờ, soi trứng kiểm tra ngày 3 lần, theo dõi thời gian chết phôi, sau khi gây nhiễm, virus sẽ gây chết phôi trong vòng 24-72 giờ. Những phôi chết sẽ có triệu chứng là xuất huyết, nước trứng hơi vàng. Những phôi chết và sống đều tiến hành mổ khám kiểm tra bệnh tích đại thể của phôi, đồng thời thu nhận nước trứng để phục vụ cho các thí nghiệm khác.
Chỉ tiêu theo dõi:
Tỉ lệ chết phôi theo thời gian = (Số phôi chết cùng thời điểm / Tổng số
phôi vịt thí nghiệm) x 100
Tần suất xuất hiện bệnh tích trên phôi = (Số phôi có cùng bệnh tích / Tổng số phôi vịt thí nghiệm) x 100
3.3.2 Chuẩn độ virus viêm gan vịt trên phôi bằng phương pháp xác định liều gây chết 50% (ELD50)
Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm tính liều ELD50 của dịch virus viêm gan vịt trên phôi
Độ pha loãng virus
Số phôi được
tiêm Liều tiêm (ml/phôi) Vị trí tiêm
104 5 0,2 ml Xoang niệu mô
10-5 5 0,2 ml Xoang niệu mô
10-6 5 0,2 ml Xoang niệu mô
10-7 5 0,2 ml Xoang niệu mô
10-8 5 0,2 ml Xoang niệu mô
10-9 5 0,2 ml Xoang niệu mô
10-10 5 0,2 ml Xoang niệu mô
10-11 5 0,2 ml Xoang niệu mô
10-12 5 0,2 ml Xoang niệu mô
Chuẩn bị phôi vịt 12 ngày tuổi: chọn những trứng vịt sạch được chọn từ những đàn vịt bố mẹ khoẻ mạnh, chưa được tiêm phòng. Sát trùng bằng cồn 700, sau đó đưa vào máy ấp với nhiệt độ 370C khi ấp trứng được 5-7 ngày thì tiến hành soi trứng để loại bỏ những trứng không phôi, trứng hư. Chọn 30 trứng có phôi ấp khi được 10 ngày tuổi thì lấy ra kiểm tra những trứng có phôi mới gây nhiễm virus viêm gan vịt.
Nguyên tắc: pha loãng huyễn dịch virus với dung dịch PBS thành những nồng độ lệch nhau 10 lần. Từ mỗi nồng độ pha loãng tiêm cho 5 trứng. Sau một thời gian nhất định (khoảng 3-5 ngày) chú ý xem ở mỗi nồng độ có bao nhiêu phôi bị chết. Từ kết quả thu được tính xem ở độ pha loãng nào có 50% số phôi bị nhiễm virus, nghĩa là ở độ pha loãng đó với liều tiêm đã biết chứa một liều gây chết 50%.
Cách tiêm: thực hiện tương tự như cách tiêm trứng ở phương pháp phân
lập virus trên phôi vịt.
Cách tính liều ELD50: tính liều ELD50 nhờ vào phương pháp Biometry của Reed & Muench (1938).
50 50% 50% 50% L dp L L Lg ELD50 = Lg LD<50% + dp x lgf Chú thích: - dp: proportion dose. - L<50%: phần trăm tử số chết dưới 50%. - L>50%: phần trăm tử số chết trên 50%. - lgf: Lg10 = 1. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.3.3 Sản xuất kháng thể viêm gan vịt do virus
Sau khi phân lập, định danh được các chủng virus có trên thực địa ta tiến hành sản xuất kháng thể viêm gan vịt do virus từ các chủng trên.
Tạo đàn gà sản xuất trứng
Sử dụng 30 gà mái đẻ giống Hisex-Brown 17 tuần tuổi, chia thành 10 lô nuôi mỗi lô 3 con.
Chăm sóc nuôi dưỡng + Nước uống
Đảm bảo đủ nước uống. Nước uống cho gà đẻ trứng xử lý trước khi cho uống theo tỷ lệ 1ml Vime-iodine/2 lít nước.
+ Quản lý dịch bệnh
Tiêm phòng các bệnh nguy hiểm như: Newcatle, Gumboro, cúm gia cầm,…
Bảng 3.5 Quy trình tiêm thuốc và phòng bệnh cho gà đẻ
3.3.3.1 Gây miễn dịch trên gà thí nghiệm
Tiêm kháng nguyên là virus viêm gan vịt các type phân lập được cho gà mái và gà sẽ sản xuất kháng thể đặc hiệu truyền qua trứng.
Gà thí nghiệm được chia ra làm 10 nghiệm thức thí nghiệm gồm 9 nghiệm thức tiêm kháng nguyên và 1 nghiệm thức đối chứng gà được tiêm
Ngày tuổi
Tên vaccine Tên thuốc Liều lượng
1-5 IB+ND (B1) nhỏ mắt Enrofloxaxine
Amoxicline
20mg/KgP 30mg/KgP
7 IBD GM97 uống Vitamin 1ml/2l nước
8 Vitamin 12 Vitamin 13 IB + ND ( LASOTA) nhỏ mắt IBD 228E uống H5N1 tiêm dưới da cổ Vitamin 1ml/2l nước 18 IBD 228E uống IB + ND (LASOTA) nhỏ mắt 33 Powlpox chủng qua da cánh 34-38 Tylofos 1g/1 lít nước 39-42 Coxcicline 1g/1 lít nước
47 ND KILLED tiêm cơ ức
H5N1 tiêm dưới da cổ Vitamin 1ml/2 lít nước 49-53 Hipra-Enro-S Hipra-Enro-S Amoxicline 20mg/KgP 30mg/KgP 56-60 Tylosine 110mg/KgP 62 ILT nhỏ mũi
CORYZA tiêm cơ ức
70 IB4/9l uống
dung dịch PBS, mỗi nghiệm thức thí nghiệm, mỗi gà được tiêm 1 liều lần lượt 104ELD50, 106ELD50, 108ELD50 (2 vị trí bên ức trái và 2 vị trí bên ức phải của gà thí nghiệm), với số lần lập lại khác nhau từ 1 đến 3 lần cho các nghiệm thức, liều tiêm 1ml/lần/gà (liều tiêm 0,25ml/vị trí).
Bảng 3.6 Bố trí thí nghiệm gây miễn dịch gà
104/1: gây miễn dịch 1 lần, liều 104ELD50. 106/3: gây miễn dịch 3 lần, liều 106ELD50.
104/2: gây miễn dịch 2 lần, liều 104ELD50. 108/1: gây miễn dịch 1 lần, liều 108ELD50.
104/3: gây miễn dịch 3 lần, liều 104ELD50. 108/2: gây miễn dịch 2 lần, liều 108ELD50.
106/1: gây miễn dịch 1 lần, liều 106ELD50. 108/3: gây miễn dịch 3 lần, liều 108ELD50.
106/2: gây miễn dịch 2 lần, liều 106ELD50. Đc: tiêm PBS 3 lần. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nghiệm Số gà thí Liều virus Liều tiêm Đường tiêm Lập lại
104/1 3 104 1 Cơ ức 1 104/2 3 104 1 Cơ ức 2 104/3 3 104 1 Cơ ức 3 106/1 3 106 1 Cơ ức 1 106/2 3 106 1 Cơ ức 2 106/3 3 106 1 Cơ ức 3 108/1 3 108 1 Cơ ức 1 108/2 3 108 1 Cơ ức 2 108/3 3 108 1 Cơ ức 3 Đc 3 PBS 1 Cơ ức 3
Bảng 3.7 Quy trình tiêm kháng nguyên và lấy máu
Lô 1 Lô 2 Lô 3
Tuần Tiêm Lấy máu Tiêm Lấy máu Tiêm Lấy máu
1 X X X 2 X X X 3 X X X 4 X X X 5 X X X 6 X X X 7 X X X 8 X X X 9 X X X 10 X X 11 X X: có thực hiện.
Bố trí thí nghiệm 1, 2, 3 như trên bảng 3.6, với nồng độ virus lần lượt là 104, 106, 108 ELD50 theo lịch trình tiêm kháng nguyên và lấy máu như trên bảng 3.7, mỗi lô 3 gà mái đẻ.
Lần 1: gà tiêm lần đầu ở lô 1, 2, 3 của 3 thí nghiệm, thí nghiệm 1 với liều virus 104 ELD50, thí nghiệm 2 với liều virus 106 ELD50, thí nghiệm 3 với liều virus 108 ELD50.
Lần 2: sau 1 tuần kể từ tuần đầu tiên, tiêm lặp lại ở lô 2, 3 của thí
nghiệm 1 với liều virus 104 ELD50, thí nghiệm 2 với liều virus 106 ELD50, thí