Phương pháp giám định virus bằng RT-PCR

Dịch virus thu được sau khi xử lý mẫu sẽ được sử dụng để tiến hành định danh virus bằng phương pháp RT-PCR.

a) Tách chiết hệ gen virus

Bộ kit tách chiết RNA bằng Phenol/Chloroform: NApRNA Extraction Kit (VA.A92-002B) để tiến hành tách chiết hệ gen của virus viêm gan vịt và

bảo quản ở nhiệt độ - 200C cho đến khi sử dụng.

b) Thực hiện phản ứng RT-PCR

Phản ứng RT-PCR được tiến hành qua 2 giai đoạn, bao gồm giai đoạn RT (Reverse transcription: phản ứng sao chép ngược chuyển mRNA thành cDNA) và giai đoạn PCR (polymerase chain reaction: phản ứng nhân gen). Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng bộ Tetro cDNA Synthesis Kit của hãng BIOLINE (Anh) để chuyển mRNA thành cDNA, sau đó thực hiện phản ứng PCR theo qui trình của Công ty cổ phần công nghệ Việt Á.

Bảng 3.1 Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RT (reverse transcription) chuyển RNA thành cDNA

Chu trình nhiệt cho phản ứng RT.

450C 30 phút 850C 5 phút Thực hiện 1 chu kỳ

Kết thúc phản ứng trữ mẫu ở -200C đến khi thực hiện phản ứng PCR.

Bảng 3.2 Thành phần của phản ứng PCR

Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR.

940C 5 phút 940C 1 phút 30 giây 520C 1 phút 720C 1 phút 30 giây 35 chu kỳ 720C 7 phút Thành phần phản ứng Thể tích Random Hexamer 1 l 10mM dNTP mix 1 l 5x RT Buffer 4 l

Ribosafe Rnase Inhibitor 1 l

Tetro Reverse Transcriptase (200u/l) 1 l RNA Tổng cộng 12 l 20l Thành phần phản ứng Thể tích H2O Biopure 27 l

iStandard PCR Master Mix 2X 20 l

Primer DHAV-Fs 0,5 l Primer DHAV-Rs 0,5 l cDNA Tổng cộng 2 l 50 l

Các cặp mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR: nghiên cứu này sử dụng 3 cặp mồi để xác định virus viêm gan A vịt:

Cặp mồi 1: mồi xuôi, ký hiệu: DHAV-1F và mồi ngược, ký hiệu: DHAV-1R dùng để xác định virus viêm gan A vịt type I (theo Chen et al., 2012)

Cặp mồi 2: mồi xuôi, ký hiệu: DHAV-2F và mồi ngược, ký hiệu: DHAV-2R dùng để xác định virus viêm gan A vịt type II (theo Chou et al., 2013)

Cặp mồi 3: mồi xuôi, ký hiệu: DHAV-3F và mồi ngược, ký hiệu: DHAV-3R dung để xác định virus viêm gan A vịt type III (theo Chen et al., 2012)

Bảng 3.3 Các trình tự mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR

c) Phát hiện các sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di

Sau khi kết thúc phản ứng RT-PCR, lấy sản phẩm đem điện di trên gel agarose 1,5% để phát hiện sản phẩm RT-PCR. Sau khi kết thúc điện di, lấy sản phẩm soi trên máy Dolphin-DOC và chụp ảnh lưu giữ mẫu để kiểm tra.