a) Tạo lớp tế bào xơ phôi vịt sơ cấp
Tạo điều kiện vô trùng trước, trong và sau khi nuôi cấy tế bào, bao gồm tủ, dụng cụ nuôi cấy, hoá chất và sinh phẩm, người thực hiện…
Quy trình tạo lớp đơn tế bào DEF được thực hiện theo phương pháp của Doyle và Griffiths (1998), thực hiện theo sơ đồ sau:
Quy trình chuẩn bị lớp tế bào xơ phôi vịt
Tế bào lớp đơn DEF
Ly tâm dịch lọc 1000 vòng/phút ở nhiệt độ 40C trong 15 phút. Thu cặn Tiếp tục cho trypsin – EDTA vào, khuấy ở nhiệt độ phòng trong 30 phút
Lọc qua đầu lọc tế bào 70 µm, thu dịch cho vào ống falcon vô trùng Loại đầu, chi và nội tạng. Cắt nhỏ mô phôi, rửa 2-3 lần với đệm PBS Rửa mảnh mô phôi 1 lần với trypsin – EDTA 0,05% (đã được làm ấm
370C)
Làm rạn và cắt vòng quanh đầu vỏ trứng phần trên buồng khí. Kẹp cổ Soi và chọn trứng vịt có phôi 9-11 ngày. Lau sạch vỏ trứng bằng cồn 700
Phân phối dịch tế bào vào đĩa nuôi cấy hoặc bình roux ở mật độ 5.105 tế
bào/ml
Cho vào MTTT, dùng vortex hay micropipette để huyền phù tế bào
Nhuộm tế bào, đếm và tính số tế bào/ml bằng buồng đếm Neubauer Cho đệm DPBS vào huyền phù. Ly tâm 1000 vòng/phút, 40C, 15 phút.
Thu cặn
Cho MTTT vào huyền phù. Ly tâm 1000 vòng/phút, 40C, 15 phút. Thu cặn
Số lượng tế bào chứa trong 1ml hỗn dịch tế bào được tính theo công thức (Doyle và Griffiths, 1998):
X= (a x 100 x 2)/y
X: số lượng tế bào trong 1ml hỗn dịch. A: số tế bào đếm được trong cả buồng đếm. y: thể tích buồng đếm tính bằng cm3.
100: số mm3 trong 1cm3.
2: hệ số pha loãng hỗn dịch tế bào với thuốc nhuộm 1:1.
b) Thực hiện phản ứng trung hoà
Phản ứng trung hòa được dùng để kiểm tra hiệu giá kháng thể viêm gan vịt có trong máu và trứng.
- Chuẩn bị
Các lớp nguyên bào sợi vịt được chuẩn bị trên đĩa nuôi cấy 96 giếng với mật độ phủ 90% diện tích bề mặt đáy giếng. Pha huyễn dịch virus viêm gan vịt chuẩn với môi trường MEM liều 500 TCID50/50µl.
- Tiến hành trên đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng
Cho môi trường nuôi cấy MEM (không có FCS: Fetal calf serum (Huyết thanh thai bê)) vào tất cả các giếng của đĩa: 50µl/giếng.Sau đó cho mẫu kháng thể kiểm tra: 50µl vào giếng đầu tiên bên trái của đĩa.
Pha loãng mẫu kháng thể kiểm tra theo bậc 2 (1/2, 1/4,...) từ giếng đầu tiên đến giếng 16 của đĩa. Sau đó cho 50µl dịch virus chứa 500 TCID50 vàocác giếng đã có kháng thể pha loãng với các nồng độ khác nhau.
Ủ đĩa nuôi cấy ở tủ ấm CO2 (5%) ở nhiệt độ 370C trong 1 giờ.
Cho hỗn hợp kháng thể-virus sau ủ lên lớp nguyên bào sợi. Tiếp tục ủ đĩa ở 370C trong 1 giờ.
Rút dịch hỗn hợp kháng thể-virus ra khỏi lớp tế bào, bổ sung MTDT vào thêm và theo dõi đến 3 ngày, soi đĩa hàng ngày dưới kính hiển vi để kiểm tra bệnh tích tế bào.
- Đánh giá kết quả
Nếu kháng thể ở độ pha loãng có lượng kháng thể trung hoà được hoàn toàn virus viêm gan vịt sẽ không xuất hiện CPE, ngược lại ở độ pha loãng huyết thanh không có hoặc không đủ lượng kháng thể trung hoà virus thì sau 3 ngày sẽ có CPE.
Điểm kết thúc trung hoà được xác định tại độ pha loãng cao nhất mà kháng thể còn khả năng trung hoà hết virus, không gây xuất hiện CPE.
Độ pha loãng kháng thể ở điểm kết thúc trung hoà được tính ra đơn vị xlog2 (ở độ pha loãng kháng thể trung hoà được hoàn toàn virus viêm gan vịt) để tiến hành so sánh hiệu giá kháng thể giữa các nghiệm thức.
3.3.4 Xử lý số liệu
Số liệu được xử lý sơ bộ bằng phần mềm Excel, minitab. Hiệu giá kháng thể được phân tích bằng Chisquare.
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả phân lập và giám định virus viêm gan vịt trên địa bàn thành phố Cần Thơ phố Cần Thơ
4.1.1 Kết quả định danh virus viêm gan vịt bằng phương pháp RT-PCR
Trong thời gian thu thập mẫu bệnh phẩm từ các đàn vịt bệnh, kết quả đã thu thập được 32 mẫu gan từ 8 đàn vịt tai các huyện Phong Điền, Cờ Đỏ, Vĩnh Thạnh, Thới Lai,… (mỗi đàn vịt thu thập 4 mẫu gan) có biểu hiện bệnh tích điển hình của bệnh viêm gan do virus trên địa bàn thành phố Cần Thơ. Sau đó bảo quản lạnh ở nhiệt độ 4oC đưa về phòng thí nghiệm, rồi tiến hành xử lý mẫu, lấy huyễn dịch virus trữ ở -20oC chờ định danh bằng phương pháp RT- PCR.
So với các phương pháp giám định virus thông thường thì RT-PCR được xem là một công cụ giúp phát hiện nhanh và chính xác các type virus gây bệnh nói chung và virus gây bệnh viêm gan vịt nói riêng. Việc sử dụng phương pháp RT-PCR để định danh virus viêm gan vịt cho ta kết quả đáng tin cậy và đồng thời cũng giúp rút ngắn thời gian phát hiện các chủng virus.
Kết quả phản ứng PCR của 8 mẫu bệnh phẩm sau khi xử lý được thể hiện trên hình bên dưới:
M 1 2 3 4 5 6 7 8
Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR trên gel agarose 1,5%
M: thang đo DNA 5: Giếng chứa mẫu 5
1: Giếng chứa mẫu 1 6: Giếng chứa mẫu 6
2: Giếng chứa mẫu 2 7: Giếng chứa mẫu 7
3: Giếng chứa mẫu 3 8: Giếng chứa mẫu 8
4: Giếng chứa mẫu 4
Kết quả đọc được trên máy soi Dolphin-DOC sau khi kết thúc điện di, phát hiện các sản phẩm của quá trình RT-PCR cho ta thấy trong 8 mẫu được dùng để định danh virus viêm gan vịt có 1 mẫu dương tính xuất hiện vạch ở giếng số 6 có chiều dài 286bp, điều này chứng tỏ rằng các đoạn mồi DHAV-
3F, DHAV-3R đã bắt cặp thành công với mạch khuôn và cho ra sản phẩm PCR có kích thước 286bp, vậy trong 8 mẫu virus phân lập được có một mẫu virus viêm gan vịt type I, thuộc subtype DHAV-3, và đây cũng chính là chủng virus viêm gan vịt phân lập được trên các đàn vịt ở thành phố Cần Thơ.
4.1.2 Kết quả phân lập virus viêm gan vịt
Dùng mẫu virus đã được định danh bằng phương pháp RT-PCR, tiến hành phân lập virus trên phôi vịt 12 ngày tuổi, để thu dịch nước trứng phục vụ cho các thí nghiệm khác. Sau khi gây nhiễm trên phôi, chúng tôi tiến hành soi trứng định kỳ 6 giờ/lần trong vòng 72 giờ và ghi nhận kết quả như sau:
Bảng 4.1 Tỉ lệ phôi vịt chết theo thời gian
Thời gian chết phôi (giờ) Số phôi chết Tỉ lệ (%) 19-24 10 25,00 25-48 26 65,00 49-72 4 10,00 Tổng 40 100,00
Qua thí nghiệm tiêm bệnh phẩm cho 40 phôi vịt, kết quả 100,00% phôi vịt chết với các triệu chứng điển hình của virus viêm gan vịt (sẽ được trình bày ở bảng 4.2). Trong thời gian từ 19-24 giờ sau khi tiêm bệnh phẩm có 10 phôi chết, với tỉ lệ 25,00%, số phôi vịt chết nhiều nhất tập trung vào giai đoạn từ 25-48 giờ với 26 phôi chết chiếm tỉ lệ cao nhất 65,00% và chỉ có 4 phôi còn lại chết trong giai đoạn 49-72 giờ, với tỉ lệ 10,00%. Kết quả trên cho ta thấy đây là chủng virus có độc lực khá cao, gây chết phôi 100,00%, thời gian gây chết phôi ngắn, không quá 72 giờ và phần lớn các phôi chết nhanh trong vòng 48 giờ dưới sự tấn công của virus trong bệnh phẩm phân lập được.
Bảng 4.2 Tần suất xuất hiện bệnh tích trên phôi vịt
Bệnh tích phôi Số phôi Tỉ lệ Tỉ lệ (%)
Gan xuất huyết 36 36/40 90,00
Xuất huyết toàn thân 38 38/40 95,00
Phôi còi cọc 35 35/40 87,50
Phù đầu 31 31/40 77,50
Phù nề bụng 26 26/40 65,00
Điều tra bệnh tích trên các phôi chết sau khi tiêm virus, ta được kết quả như sau, hầu hết các phôi chết điều có biểu hiện bệnh tích đặc trưng, trong số
40 phôi chết có 36 phôi có gan xuất huyết với tỉ lệ 90,00%, 38 phôi xuất huyết toàn thân với tỉ lệ 95,00%, phôi biểu hiện còi cọc có 35 phôi với tỉ lệ 87,50%, phôi phù đầu có 31 phôi với tỉ lệ 77,50%, với bệnh tích phù nề bụng có 26 phôi và chiếm tỉ lệ 65,00%, kết quả này phù hợp với nhận định của Hồ Thị Việt Thu (2012), virus viêm gan vịt gây chết phôi 10-14 ngày tuổi với các biểu hiện bệnh tích đặc trưng như gan xuất huyết, xuất huyết toàn thân, phôi còi cọc, phù đầu, phù nề bụng. Theo OIE (2000), virus viêm gan vịt type I khi nuôi cấy trên phôi vịt 10-14 ngày tuổi, virus sẽ gây chết phôi trong khoảng 24- 72 giờ sau khi tiêm, phôi có bệnh tích còi cọc, xuất huyết trên da, gan phôi sưng xuất huyết.
Như vậy, trong bệnh phẩm nuôi cấy trên phôi vịt đã có mặt virus viêm gan vịt, virus đã nhân lên trên phôi, gây chết phôi và gây các bệnh tích đặc hiệu trên phôi. Có thể kết luận chủng virus phân lập được có đặc tính của virus viêm gan vịt type I với thời gian gây chết phôi không quá 72 giờ và gây chết 100,00% phôi.
Hình 4.2 Gan phôi xuất huyết Hình 4.3 Da phôi xuất huyết, phôi phù đầu
Hình 4.4 Phôi phù nề, tích nước Hình 4.5 A) Phôi bình thường B) Phôi còi cọc
4.2 Kết quả xác định liều gây chết 50% trên phôi vịt thí nghiệm Bảng 4.3 Tỉ lệ phôi vịt chết ở các nồng độ virus
Số thật Tổng hợp Độ pha
loãng
virus Phôi sống Phôi chết Phôi sống Phôi chết Số chết Tỉ lệ (%)
10-4 0 5 0 32 32/32 100,00 10-5 0 5 0 27 27/27 100,00 10-6 0 5 0 22 22/22 100,00 10-7 0 5 0 17 17/17 100,00 10-8 0 5 0 12 12/12 100,00 10-9 1 4 1 7 7/8 87,50 10-10 3 2 4 3 3/7 42,86 10-11 4 1 8 1 1/9 11,11 10-12 5 0 13 0 0/13 0,00
Khoảng cách tỷ lệ dp giữa 2 độ pha loãng 10-9 và 10-10 dp= 50 42,86
87, 5 42,86
= 0,16
Log của độ pha loãng gây chết ở 50% là
Log ELD50 = -10 + 0,16 = -9,84 vậy ở độ pha loãng 1:109,84 khi tiêm 0,2 ml huyễn dịch virus sẽ gây chết 50% phôi thí nghiệm (hay 0,2 ml huyễn dịch virus có chứa 109,84 liều gây chết 50% phôi).
4.3 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể trong máu gà
Bảng 4.4 Kiểm tra hiệu giá kháng thể trong máu gà sau khi gây miễn dịch với liều 104ELD50 qua mỗi tuần sau khi tiêm
Hiệu giá kháng thể trong máu gà qua các tuần (xlog2) Nghiệm thức 0 1 2 3 4 5 6 7 8 A 0,50 8,67 7,33 7,00 7,33 7,67 8,00 6,67 5,33 B 0,67 6,67 6,67 6,33 7,67 8,00 7,67 7,67 6,67 C 0,33 5,67 5,33 5,67 7,00 6,67 6,67 6,00 5,67 Đc 0,33 0,33 0,50 0,33 0,33 0,50 0,67 0,67 0,50
A: Nghiệm thức gây miễn dịch 1 lần.
B: Ngiệm thức gây miễn dịch 2 lần.
C: Nghiệm thức gây miễn dịch 3 lần. Đc: Nghiệm thức đối chứng. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 Tuan H ie u g ia ( x lo g 2 ) A B C ĐC
Hình 4.6 Kháng thể trong máu gà sau khi gây miễn dịch với liều 104ELD50
Qua bảng 4.4 cho thấy trước khi gây miễn dịch, hiệu giá kháng thể ở cả ba nghiệm thức điều thấp hơn giá trị 1,00log2 và bắt đầu có kháng thể cao trong máu sau 1 tuần khi kết thúc gây miễn dịch cho gà và kháng thể trong máu gà ổn định kéo dài liên tục trong 5 tuần ở nghiệm thức A, cao nhất ở tuần 1 (8,67log2) và giảm mạnh từ tuần thứ 6 trở đi, thấp nhất ở tuần thứ 8 (5,33log2). Đối với các nghiệm thức B, C, kháng thể trong máu gà xuất hiện sau khi gây miễn dịch một tuần với giá trị lần lượt 6,67log2 và 5,67log2, ổn định trong 2 tuần tiếp theo và tiếp tục tăng cao (cao nhất là 8,00log2 ở tuần 5 của nghiệm thức B và 7,00log2 ở tuần 4 của nghiệm thức C) rồi giữ ổn định ở các tuần thứ 4, 5, 6 và bắt đầu có dấu hiệu giảm hiệu giá kháng thể trong máu gà kể từ tuần thứ 7 trở về sau. Quá trình sụt giảm hiệu giá kháng thể trong máu gà ở 2 nghiệm thức B, C xảy ra không nhanh chóng như ở nghiệm thức A, tuy nhiên nhìn chung giá trị hiệu giá kháng thể trong máu gà ở cả 2 nghiệm thức này vẫn thấp hơn so với nghiệm thức A, nhưng sự khác biệt về hiệu giá kháng thể trong máu giữa các nghiệm thức thí nghiệm không có ý nghĩa thống kê qua các tuần khảo sát.
Điều này được giải thích là do việc gây miễn dịch nhắc lại nhiều lần sẽ giúp cho việc tạo ra kháng thể trong máu sẽ kéo dài hơn so với viêc gây miễn dịch một lần vì tạo ra được miễn dịch thứ cấp do các tế bào nhớ gồm Lympho bào T “nhớ” và Lympho bào B “nhớ” sẽ làm cho thời gian tiềm tàng của kháng nguyên ngắn hơn và khả năng ghi nhớ kháng nguyên này kéo dài hơn, tuy nhiên do việc lặp lại các lần tiêm kháng nguyên khá gần nhau (7 ngày) nên lượng kháng thể vừa được tạo ra trong lần gây miễn dịch trước đã bị trung hoà bởi lượng kháng nguyên vừa được đưa vào, chính vì thế mà ở nghiệm thức B có hiệu giá kháng thể thấp hơn nghiệm thức C và 2 nghiệm thức này có hiệu
giá kháng thể trong máu thấp hơn nghiệm thức A, nhưng hiệu giá kháng thể kéo dài hơn.
Bảng 4.5 Kiểm tra hiệu giá kháng thể trong máu gà sau khi gây miễn dịch với liều 106ELD50 qua mỗi tuần sau khi tiêm
A: Nghiệm thức gây miễn dịch 1 lần.
B: Ngiệm thức gây miễn dịch 2 lần.
C: Nghiệm thức gây miễn dịch 3 lần. Đc: Nghiệm thức đối chứng. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 Tuan H ie u g ia ( x lo g 2 ) A B C ĐC
Hình 4.7 Kháng thể trong máu gà sau khi gây miễn dịch với liều 106ELD50
Qua bảng 4.5 cho thấy khi gây miễn dịch cho gà ở cả 3 nghiệm thức thí nghiệm thì hiệu giá kháng thể trong máu tăng nhanh ở tuần thứ 1 và dao động không đáng kể liên tục cho đến tuần thứ 5 với giá trị hiệu giá kháng thể cao nhất là 7,33log2 rồi bắt đầu có dấu hiệu giảm liên tục trong các tuần tiếp theo ở nghiệm thức B, thấp nhất ở tuần thứ 8 với giá trị 5,33log2, trong khi đó ở nghiệm thức A và C hiệu giá kháng trong máu lại kéo dài hơn nghiệm thức B thêm 1 tuần rồi mới xuất hiện dấu hiệu sụt giảm hiệu giá. Hiệu giá kháng thể cao nhất ở nghiệm thức A là 7,00log2 xuất hiện ở tuần 2 và thấp nhất là 4,00log2 ở tuần 8 sau khi gây miễn dịch, ở nghiệm thức C có giá trị hiệu giá kháng thể trong máu cao nhất là 7,00log2 xuất hiện ổn định trong 2 tuần liên tục là tuần 5 và 6, thấp nhất ở tuần 8 với giá trị 5,00log2. Tuy nhiên kết quả
Hiệu giá kháng thể trong máu gà qua các tuần (xlog2) Nghiệm thức 0 1 2 3 4 5 6 7 8 A 0,33 6,67 7,00 6,33 6,33 6,00 6,00 5,33 4,00 B 0,67 7,00 7,33 6,67 7,00 7,33 6,33 6,00 5,33 C 0,33 6,33 6,00 6,67 6,33 7,00 7,00 5,67 5,00 Đc 0,33 0,33 0,50 0,33 0,33 0,50 0,67 0,67 0,50
phân tích thống kê cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa trong kết quả hiệu giá kháng thể trong máu của 3 nghiệm thức thí nghiệm.
Việc kháng thể tăng cao sau tuần thứ 1 và dao động không lớn đến tuần 6 chủ yếu do ảnh hưởng bởi tình trạng sức khoẻ không ổn định của nghiệm thức gà thí nghiệm tác động đến sự đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu chống virus viêm gan vịt, bên cạnh đó thao tác trong các bước tiến hành thí nghiệm trung hoà xác định hiệu giá kháng thể chưa thành thạo cũng ảnh hưởng không ít đến kết quả, nhưng nhìn chung sự hình thành kháng thể trong