Nghiên cứu thực nghiệm trên thực địa, dùng 4 túi trứng có 2 túi đựng trứng Dicrocoelium dendriaticum và 2 túi đựng trứng Eurytrema pancreaticum, mỗi túi chứa 100 trứng. Túi đựng trứng được làm bằng vải pha
có tỷ lệ nilon cao và dệt dày. Túi trứng mỗi loại được buộc vào đầu một thanh tre cứng, bền. Các thanh tre chứa túi trứng được đưa sâu vào ngăn sinh khí của bể qua van điều áp.
- Giữ các túi trứng theo các mức thời gian 25ngày và 50 ngày. Ở mỗi mức thời gian lấy ra một túi cho mỗi loại sán.
- Làm sạch trong nước cất, quan sát hình thái, màu sắc và sự biến đổi của tế bào phôi trứng.
- Nuôi lại trứng trong môi trường nước cất. * Chỉ tiêu theo dõi:
- Sự biến đổi của trứng ở các mức thời gian lưu giữ. Vị trí đựng túi trứng
- Sức sống của trứng sau khi lưu giữa qua các mức thời gian.
Thí nghiệm 8: Thử nghiệm hiệu lực thuốc tẩy là Han – Dertil B (1 viên có Triclabendazol 300mg và Albendazole 300mg; liều 12mg/kg TT) và Nitroxinil – 25% (liều 0,04 ml/kg TT).
- Chọn những con bò bị nhiễm sán
- Ước lượng khối lượng của bò thử nghiệm.
- Xác định liều và lượng thuốc cho bò thử nghiệm.
- Trước khi dùng thuốc kiểm tra các chỉ tiêu lâm sàng: nhịp tim, nhịp thở, nhiệt độ, trạng thái phân, chỉ tiến hành thử nghiệm với những con có chỉ tiêu ở mức bình thường.
- Sau khi dùng thuốc 6 giờ sau kiểm tra lại các chỉ tiêu lâm sàng trên. - Sau 24 giờ kiểm tra phân tìm xác sán.
- Sau 15 ngày kiểm tra phân tìm trứng sán bằng phương pháp gạn rửa sa lắng.
Chỉ tiêu theo dõi: độ an toàn của thuốc. - Tỷ lệ hiệu lực.
- Tỷ lệ sạch sán.
Tỷ lệ hiệu lực = Số con ra sán/số con tẩy x 100. Tỷ lệ sạch sán = Số con sạch sán/số con ra sán x 100.
3.7. Phương pháp tính toán số liệu
Các số liệu trong thực nghiệm được sử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên máy tính với các tham số:
Số trung bình: X
Độ lệch chuẩn: Sx
Sai số của số trung bình: X ± mx
So sánh hai số trung bình mẫu, ước lượng thống kê, kiểm định các giả thuyết thống kê.
Sử dụng chương trình phần mềm Exel.
Tỷ lệ nhiễm được tình bằng tỷ lệ phần trăm (%). Cường độ nhiễm qua mổ khám đánh giá định tính đo theo các trị số Min (nhỏ nhất) và Max (lớn nhất).
Cường độ nhiễm qua mổ khám đánh giá định tính qua các mức nhiễm nhẹ (+), nhiễm trung bình (++) và nhiễm nặng (+++).
PHẦN IV: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.1. Thành phần loài sán lá gan nhỏ
Theo nhiều tài liệu đã công bố thì sán lá gan và sán lá tuyến tụy gây bệnh cho bò do nhiều loài gây ra. Để xác định xem bò nuôi tại huyện Nho Quan do loài sán lá gan nhỏ và sán lá tuyến tụy nào gây nên chúng tôi tiến hành định loại để xác định loài sán lá gây bệnh cụ thể.
Để định loại, sau khi mổ khám toàn diện đối với hệ tiêu hóa để tìm sán lá trưởng thành, làm tiêu bản nhuộm bằng thuốc nhuộm carmine và quan sát cấu tạo bên trong của các loài sán lá dưới kính hiển vi có độ phóng đại 120 lần.
Đối với D. dendriaticum: trên tiêu bản tươi thấy sán có màu đỏ sáng, hình lá, tinh hoàn phân thùy yếu nằm ở phần trước cơ thể, giác bụng lớn hơn giác miệng.
Trên tiêu bản nhuộm thấy túi sinh dục dài, thường nằm chéo cái nọ sau cái kia, buồng trứng hình tròn nằm giữa cơ thể, tuyến noãn hoàng nằm hai bên từ sau tinh hoàn đến giữa cơ thể.
Với đặc điểm hình thái, cấu tạo như trên phù hợp với khóa phân loại của Nguyễn Thị Lê (1977). Sán lá gan nhỏ có giác miệng nhỏ hơn giác bụng, kích thước 0,30 x 0,40mm. Giác bụng kích thước 0,40 x 0,45mm, buồng trứng hình tròn nằm giữa cơ thể, đường kính 0,25 x 0,35mm. Thực quản nhỏ nối liền với manh tràng. Hai tinh hoàn phát triển đầy đủ nằm ở phía trước buồng trứng và phía bên phải của cơ thể. Tử cung chiếm phần lớn cơ thể và cuối cùng là lỗ sinh dục nằm phía trước giác bụng Như vậy đã biết được loài sán lá gây bệnh là D. dendriaticum.
4.2. Thành phần loài sán lá tuyến tụy
Để định loại, sau khi mổ khám toàn diện đối với hệ tiêu hóa để tìm sán lá trưởng thành, làm tiêu bản nhuộm bằng thuốc nhuộm carmine và quan sát cấu tạo bên trong của các loài sán lá dưới kính hiển vi có độ phóng đại 120 lần.
Đối với Eurytrema pancreaticum: trên tiêu bản tươi thấy sán có màu đỏ sáng, hình lá, cuối thân nhô ra như hình lưỡi. Có hai giác bám hình tròn, giác miệng lớn hơn giác bụng.
Trên tiêu bản nhuộm thấy sán có thực quản ngắn, hầu nhỏ, hai manh tràng hình ống xếp dọc hai bên thân. Tinh hoàn hình bầu dục nằm hai bên mép sau của giác bụng. Buồng trứng nhỏ hơn tinh hoàn nhiều lần ở sau giác bụng. Tuyến noãn hoàng hình chùm ở hai bên thân và xếp phía sau tinh hoàn.
Với đặc điểm hình thái, cấu tạo như trên phù hợp với khóa phân loại của Nguyễn Thị Lê và cs (1997) (Nguyễn Thị Lê, 1977) Sán lá tuyến tụy có giác miệng lớn, kích thước 2,47 x 2,50mm. Giác bụng nhỏ hơn giác miệng, kích thước 1,82 x 1,82 mm, nằm gần giữa cơ thể. Thực quản ngắn. Hai nhánh ruột kéo dài, cách mút sau cơ thể 1,5 x 2,0mm. Tinh hoàn hình bầu dục, nằm sau giác bụng. Buồng trứng nhỏ hơn tinh hoàn.Tuyến noãn hoàng gồm 10 - 12 chùm nằm mỗi bên cơ thể, sau tinh hoàn. Như vậy đã biết được loài sán lá gây bệnh là Eurytrema pancreaticum.
Khi nghiên cứu về các loài sán lá ký sinh ở Việt Nam, đặc biệt là sán lá tuyến tụy thấy sán lá tuyến tụy có 4 loài bao gồm: Eurytrema pancreaticum,
Eurytrema coelomaticum, Eurytrema tonkinensis và Eurytrema rebelled.
Nhưng dựa theo những nghiên cứu của Bahlerao năm 1936 ở Ấn Độ và củaPrjadko (1962) ở Liên Xô (cũ), Drozkz và Malcrewski khi nghiên cứu ở miền Bắc Việt Nam chỉ công nhận nước ta có một loài duy nhất là Eurytrema
pancreaticum.
Khi nghiên cứu về thành phần loài Eurytrema pancreaticum, các tác giả Trần Văn Vũ (1997), Nguyễn Văn Diên (1997), Nguyễn Tất Thế, Lê Quang Hùng, Cao Văn Viên, Võ Hưng, Lê Thanh Hòa (2001) cũng có kết quả tương tự như kết quả nghiên cứu của chúng tôi.
Bảng 4.1. Thành phần loài Dicrocoelium dendriaticum và Eurytrema pancreaticum gây bệnh cho bò
STT Phương pháp thu thập Định loại loài ký sinh trùng Nơi ký sinh 1 Mổ khám toàn diện Dicrocoelium dendriaticum Gan, ống dẫn mật
2 Eurytrema pancreaticum Ống dẫn tụy
4.3. Tỷ lệ và cường độ nhiễm Dicrocoelium dendriaticum và Eurytrema pancreaticumở bò qua xét nghiệmphân pancreaticumở bò qua xét nghiệmphân
Trứng sán lá theo phân của súc vật ra ngoài tự nhiên. Hàng năm, mỗi sán lá gan ký sinh đẻ khoảng 6000 trứng. Vì vậy, mỗi súc vật mang sán hàng năm thải khối lượng trứng khá lớn ra đồng cỏ và các bãi chăn thả. Những đồng cỏ ẩm thấp, lầy lộilà những nơi cần thiết để mầm bệnh phát triển và xâm nhập vào súc vật, đồng thời thuận lợi cho trứng nở thành Miracidium và thuận lợi cho vật chủ trung gian tồn tại và phát triển.
Tác hại của D. dendriaticum và E. pancreaticum gây ra cho bò nặng hay nhẹ phụ thuộc vào số lượng và độc lực của sán ký sinh. Để đánh giá mức độ thiệt hại của sán gây ra chúng tôi xác định tỷ lệ và cường độ nhiễm sán trên bò trong vùng nghiên cứu.
Ngoài phương pháp mổ khám, phương pháp xét nghiệm phân là phương pháp kinh điển khi nghiên cứu về ký sinh trùng. Do đó để xác định tỷ lệ và cường độ nhiễm Dicrocoelium dendriaticum và Eurytrema pancreaticum trên bò chúng tôi tiến hành lấy mẫu phân của bò đại diện cho các vùng địa lý khác nhau, đồng đều ở các lứa tuổi. Mẫu phân được xét nghiệm theo phương pháp dội rửa nhiều lần. Kết quả được trình bày ở bảng 4.2.
Bảng 4.2 : Tỷ lệ và cường độ nhiễm Dicrocoelium dendriaticum và
Eurytrema pancreaticumở bò qua xét nghiệm phân
Loài ký sinh trùng Số mẫu kiểm tra (con) Số mẫu nhiễ m (con) Tỷ lệ nhiễm (%) Cường độ (+) (++) (+++) Số nhiễ m (con) Tỷ lệ (%) Số nhiễ m (con) Tỷ lệ (%) Số nhiễ m (con) Tỷ lệ (%) Dicrocoelium dendriaticum 300 9 3,00 9 100 0 0,00 0 0,00 Eurytrema pancreaticum 300 96 32,0 0 85 28,33 10 3,33 1 0,33
Qua bảng 4.2, chúng tôi nhận xét tỉ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ, sán lá tuyến tụy trên bò tại địa điểm nghiên cứu thấp. Cụ thể là trông tổng số 300 con theo dõi chỉ phát hiện 9 con nhiễm trứng Dicrocoelium dendriaticum và 96 con Eurytrema pancreaticum, với tỉ lệ lần lượt là 3,00%; 32%. Như vậy, tỉ lệ
nhiễm Dicrocoelium dendriaticum thấp hơn Eurytrema pancreaticum. Theo
chúng tôi tỉ lệ nhiễm Dicrocoelium dendriaticum thấp là do vòng đời của nó phải qua hai ký chủ trung gian là ốc trên cạn và kiến. Bò chỉ bị nhiễm khi vô tình ăn phải kiến bị nhiễm bệnh, trong khi bò ở vùng chúng tôi nghiên cứu thì người dân chỉ đi chăn thả lúc mặt trời lên, lúc này những con kiến không bò lên ngọn cỏ nữa mà sẽ đi kiếm ăn trên mặt đất, vì thế ít có khả năng bị bò ăn phải.Có sự chênh lệch này theo chúng tôi là do đặc điểm sinh học của
Eurytrema pancreaticum. Tức là Eurytrema pancreaticum trưởng thành sau
khi đẻ trứng, trứng theo phân ra ngoài môi trường. Lúc này trong trứng đã hình thành ấu trùng Miracidium. Ấu trùng này nhanh chóng xâm nhập vào vật chủ trung gian là ốc nước ngọt để sinh sản vô tính. Nho Quan là huyện miền núi của tỉnh Ninh Bình chăn nuôi gia súc gia cầm phát triển, diện tích đất
nông nghiệp lớn thích hợp cho vật chủ trung gian của các loài sán lá và có nhiều thực vật thủy sinh tạo điều kiện thuận lợi cho kén Aldolescaria tồn tại,
phát triển vì vòng tuần hoàn của các loại sán lá bắt buộc phải qua vật chủ trung gian là ốc. Đây là nơi mà vật chủ trung gian của Eurytrema pancreaticum là ốc cạn và cào cào, châu chấu hoạt động mạnh. Bò dễ có khả
năng tiếp xúc với mầm bệnh hơn nên nhiễm với tỷ lệ cao hơn.
Khi xét nghiệm phân chúng tôi đồng thời tiến hành đánh giá cường độ nhiễm trứng Dicrocoelium dendriaticum và Eurytrema pancreaticum. Qua
bảng chúng tôi thấy: ở huyện Nho Quan, trong tổng số 96 con nhiễm
Eurytrema pancreaticum có 85 con nhiễm ở mức độ (+), chiếm tỷ lệ 28,33%,
10 con nhiễm ở mức độ (++), chiếm 3,33% và 1 con nhiễm ở mức độ (+++), chiếm 0,33%. Trong tổng số 9 con nhiễm Dicrocoelium dendriaticum có 9
con nhiễm ở mức độ (+), chiếm tỷ lệ 100%, 0 con nhiễm ở mức độ (++), chiếm 0,00% và 0 có con nào nhiễm ở mức độ (+++).
4.4. Tình hình nhiễm Dicrocoelium dendriaticum và Eurytrema pancreaticum
qua mổ khám
Tác hại của Dicrocoelium dendriaticum và Eurytrema pancreaticum gây ra cho bò nặng hay nhẹ phụ thuộc vào số lượng và độc lực của sán ký sinh. Để đánh giá mức độ thiệt hại của sán gây ra chúng tôi xác định tỷ lệ và cường độ nhiễm sán trên bò trong vùng nghiên cứu. Kết quả được trình bày ở bảng
Để đánh giá tình hình nhiễm Dicrocoelium dendriaticum và Eurytrema pancreaticum ở bò trên địa bàn tỉnh Ninh Bình, chúng tôi tiến hành mổ khám 70 bò
ở huyện Nho Quan bằng phương pháp mổ khám toàn diện. Kết quả được trình bày ở bảng 4.3.
Qua bảng 4.3 chúng tôi thấy:
Ở huyện Nho Quan: mổ khám 70 bò có 3 bò nhiễm Dicrocoelium dendriaticum, chiếm 4,29%, bò nhiễm Eurytrema pancreaticum với tỷ lệ cao
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với một số nghiên cứu trước đây. Phan Lục, Vương Đức Chất, Trần Văn Quyên (1995) khi nghiên cứu “Tình hình nhiễm ký sinh trùng đường tiêu hóa của trâu, bò ở các tỉnh phía Bắc Việt Nam” cho biết: trâu nhiễm 70,00%, bò nhiễm 61,20% và dê nhiễm 20%. Tác giả Lương Tố Thu và Bùi Khánh Linh, 1996 khi nghiên cứu “Tình hình nhiễm sán lá gan và kết quả thí nghiệm Fasinex tẩy sán lá gan trâu bò” cho biết trâu nhiễm sán lá gan 63,41%.
Bảng 4.3. Tỷ lệ và cường độ nhiễm sán theo loài ở bò qua mổ khám Loài ký sinh Loài ký sinh
trùng Số ki(con) ểm tra Số(con) nhiễm T(%) ỷ lệ (min – max) Cường độ
D. dendriaticum 70 3 4,29 1 – 5
Eurytrema
pancreaticum 70 27 38,57 8 – 26
So với phương pháp mổ khám thì phương pháp xét nghiệm phân tìm trứng Eurytrema pancreaticum cho kết quả thấp hơn. Cường độ nhiễm sán lá gan nhỏ, sán lá tuyến tụy trên đàn bò thịt trên địa bàn Nho Quan ở mức thấp. Chúng tôi nhận xét có sự sai khác về tỷ lệ nhiễm sán qua phương pháp mổ khám và xét nghiệm phân trước đó tại các khu vực nghiên cứu trên địa bàn huyện. Cụ thể là ở phương pháp mổ khám ở bò nhiễm Dicrocoelium dendriaticum và Eurytrema pancreaticum với tỷ lệ 4,29%; 38,57%. Bằng
phương pháp xét nghiệm phân tỷ lệ nhiễm Dicrocoelium dendriaticum và Eurytrema pancreaticum ở bò lần lượt là 3,00%; 32%. Điều này cho thấy việc kiểm tra phân có thể có những sai sót do lấy phân không đúng thời điểm, hoặc mẫu phân không đúng vị trí có trứng, số b ò t hịt kiểm tra còn ít và chưa mang tính đại diện, mặt khác số mẫu mổ khám không mang tính ngẫu nhiên, vì vậy có sự sai khác về tỷ lệ nhiễm sán giữa hai phương pháp kiểm tra phân và phương pháp mổ khám tìm sán trưởng thành. Có sự chênh
lệch này theo chúng tôi là do đặc điểm sinh học của Eurytrema pancreaticum. Tức là Eurytrema pancreaticum trưởng thành sau khi đẻ trứng, trứng theo phân ra ngoài môi trường. Lúc này trong trứng đã hình thành ấu trùng Miracidium. Ấu trùng này nhanh chóng xâm nhập vào vật chủ trung gian là ốc nước ngọt để sinh sản vô tính. Do đó khi xét nghiệm phân xác suất gặp được trứng Eurytrema pancreaticum là rất ít. Chính vì vậy, tỷ lệ nhiễm Eurytrema pancreaticum khi
thực hiện bằng phương pháp mổ khám bao giờ cũng cho kết quả cao hơn và chính xác hơn so với phương pháp xét nghiệm phân.
Như vậy, phương pháp chẩn đoán xét nghiệm phân của gia súc nhiễm bệnh để tìm trứng sán tỏ ra không mấy hiệu quả nếu mực độ trứng quá ít ỏi hoặc thu thập mẫu không đúng thời gian sán đẻ trứng. Xét nghiệm phân tìm trứng sán là biện pháp đơn giản nhưng có tính chất khẳng định việc mắc bệnh, trường hợp nhiễm ít cần phải xét nghiệm dịch tá tràng (Hà Viết Viên).
4.5. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của sán Dicrocoelium dendriaticum và Eurytrema pancreaticum dendriaticum và Eurytrema pancreaticum
4.5.1. Kích thước của trứng Dicrocoelium dendriaticum
Ở Việt Nam hiện nay có rất ít tác giả nghiên cứu về kích thước của D. dendriaticum. Do vậy các thông số về kích thước của D. dendriaticum chưa có những số liệu cụ thể và chính xác. Trong phạm vi đề tài, chúng tôi đi xác định các số đo của D. dendriaticum nhằm có những dữ liệu về kích thước của
D. dendriaticum ở Việt Nam.
Chúng tôi tiến hành mổ khám toàn diện bò ở vùng nghiên cứu, xác định những bò bị nhiễm D. dendriaticum. Thu lượm D. dendriaticum trưởng thành bằng phương pháp gạn rửa sa lắng (hay dội rửa nhiều lần). Sau đó D. dendriaticum được làm chết trong nước lã, ép mỏng và bảo quản trong cồn 700. Trứng già được lấy từ tử cung của sán trưởng thành, tiến hành xác định kích thước của D. dendriaticum trưởng thành và trứng của sán. Kết quả được trình bày ở bảng 4.4.
Bảng 4.4. Kích thước của Dicrocoelium dendriaticum trưởng thành và trứng Số mẫu nghiên cứu Số mẫu nghiên cứu (n = 30) Kích thước Chiều dài (mm) X ± mx Chiều rộng (mm) X ± mx D. dendriaticum trưởng thành 5,19 ± 0,12 1,22 ± 0,13 Trứng D. dendriaticum 0,043 ± 0,02 0,031 ± 0,03 Qua bảng trên chúng tôi thấy D. dendriaticum trưởng thành có chiều dài là 5,19 ± 0,12, chiều rộng 1,22 ± 0,13. Trứng có chiều dài là 0,043 ± 0,02; chiều rộng 0,031 ± 0,03. Kết quả trên của chúng tôi phù hợp với những nghiên cứu về đặc điểm sinh học của D.dendriaticum của các tác giả Rudolphi 1819, Looss 1899 khi nghiên cứu về loài sán này ở châu Phi, châu Âu, Châu Á có kích thước 1 - 2,3 x 5 - 12mm. Trứng có kích thước tương đối nhỏ 38 - 45 x 28 - 30