3.2. Đối tượng nghiên cứu
- Bò các lứa tuổi nuôi tại nông hộ ở một số xã (Lạng Phong, Đồng Phong, Kỳ Phú, Văn Phong) của huyện Nho Quan, tỉnh Ninh Bình.
- Sán lá gan nhỏ và sán lá tuyến tụy ở bò.
3.3. Vật liệu nghiên cứu
- Mẫu phân của bò, bê.
- Mẫu gan, tụy lấy từ bò, bê tại địa điểm nghiên cứu. - Mẫu ốc, kiến thu thập được tại địa điểm nghiên cứu.
- Hóa chất, trang thiết bị tại phòng thí nghiệm phục vụ cho công tác xử lý, xét nghiệm mẫu.
- Thuốc là Han – Dertil B (1 viên có Triclabendazol 300mg và Albendazole 300mg; liều 12mg/kg TT) và Nitroxinil – 25% (liều 0,04 ml/kg TT).
3.4. Nội dung nghiên cứu
- Xác định thành phần loài sán lá gan nhỏ gây bệnh ở bò. - Xác định thành phần loài sán lá tuyến tụy gây bệnh ở bò. - Xác định tỷ lệ và cường độ nhiễm sán lá gan nhỏ ở bò. - Xác định tỷ lệ và cường độ nhiễm sán lá tuyến tụy ở bò.
- Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của sán lá gan nhỏ và sán lá tuyển tụy ở bò.
- Nghiên cứu sức sống của trứng sán lá gan nhỏ và sán lá tuyến tụy giữ trong bế biogas.
- Thử nghiệm thuốc điều trị.
3.5. Phương pháp nghiên cứu
Thực hiện đề tài chúng tôi đã sử dụng các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm và nghiên cứu thực địa.
Sử dụng phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên đơn giản và phương pháp lấy mẫu phân tầng.
Sử dụng các phương pháp xét nghiệm đang được áp dụng tại các phòng thí nghiệm ký sinh trùng ở Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
3.5.1.Tỷ lệ, cường độ nhiễm
Thí nghiệm theo phương pháp nghiên cứu cắt ngang, lấy mẫu theo phương pháp lấy mẫu phân tầng.
- Thu thập sán trưởng thành từ ống mật và ống dẫn tụy của bò bằng phương pháp mổ khám toàn diện của K.I.Skrjabar 1944. ( Phạm văn Khuê, Phan Lục, 1996)
Do đặc tính ký sinh của sán lá gan nhỏ và sán lá tuyến tụy của gia súc, chúng tôi mổ khám bò tìm sán ở gan, mật và tuyến tụy.
- Gan: mổ gan dọc theo đường ống dẫn mật tìm sán có hình lá đặt lên đĩa petri với nước muối 0,9%. Gan được cắt thành miếng nhỏ đem ngâm trong dung dịch nước muối 0,9% trong khoảng 10 phút, sau đó bóp nát lọc đến khi nước trong tìm sán lá.
- Mật: mổ mật, lấy dịch mật rửa sa lắng vài lần lọc lấy cặn soi trên kính hiển vi tìm trứng sán.
- Tụy: mổ dọc ống tụy tìm sán.
Thu lượm sán trưởng thành bảo quản trong cồn 70º. Lọ bảo quản phải ghi chép rõ ràng chi tiết: loài gia súc, tính biệt, độ tuổi, địa điểm thu lượm, ghi chép biến đổi giải phẫu bệnh lý nếu có.
Đánh giá cường độ nhiễm Dicrocoelium dendriaticum và Eurytrema pancreaticum theo trị số Min (nhỏ nhất) và Max (lớn nhất). Trong đó:
+ Min: là số sán ít nhất trên một gia súc mổ khám + Max: là số sán nhiều nhất trên một gia súc mổ khám
- Tìm trứng của Dicrocoelium dendriaticum và Eurytrema pancreaticum bằng phương pháp gạn rửa sa lắng.
- Đánh giá cường độ nhiễm trứng Dicrocoelium dendriaticum và Eurytrema pancreaticum trong phân bằng phương pháp định tính theo quy định như sau:
+ Nhiễm nhẹ: có 1 trứng trên một vi trường kính hiển vi, ký hiệu bằng dấu (+) + Nhiễm trung bình: có 2-3 trứng trên một vi trường kính hiển vi, ký hiệu bằng dấu (++)
+ Nhiễm nặng: có ≥ 4 trứng trên một vi trường kính hiển vi, ký hiệu bằng dấu (+++).
3.5.2. Định loại Dicrocoelium dendriaticum và Eurytrema pancreaticum
Phương pháp làm tiêu bản định loại sán.
- Chuẩn bị dung dịch thuốc nhuộm carmine- axit Clohidric (HCl): lấy 5 gam carmine nghiền nhỏ cho vào bình tam giác chứa 5ml HCl và 5ml nước cất, để yên sau 1 giờ, cho thêm 200ml cồn 90º, lắc đều, đậy nút bông, đun cách thủy cho tới khi carmine tan hết,để một ngày sau lọc. Dung dịch để sau 1 tuần mới dùng.
- Nhuộm mẫu trong carmine axit: tùy thuộc vào độ lớn của mẫu mà thời gian mẫu để trong dung dịch nhuộm có thể từ 5 phút đến 1 giờ. Người ta dùng cồn axit (100ml cồn 80º, thêm vào 2-3 giọt HCl) để tẩy màu carmine và làm rõ cấu tạo chi tiết trong 1- 10 phút tùy thuộc vào kích thước mẫu. Sau đó rút nước trong cồn ở các nồng độ khác nhau: 80º, 90º, 100º, thời gian trong mỗi loại cồn 5-7 phút, mẫu có kích thước lớn thường để trong dung dịch lâu hơn. Sau đó làm trong mãu bằng dung dịch xylen và cồn 100º theo tỷ lệ 1:1 trong thời gian từ 1-2 phút. Cuối cùng lên tiêu bản bằng cách nhỏ lên tiêu bản bằng ách nhỏ lên lam kính 1 giọt bom Canada, đặt mẫu ngay ngắn , nhỏ tiếp một giọt bom lên trên rồi đậy lamen lại, Để tiêu bản ở vị trí nằm cho tới khi bom khô thì tiêu bản đã đảm bảo hoàn toàn.
Phương pháp định loại sán
Dựa vào hình thái cấu tạo qua tiêu bản nhuộm Carmine: đo kích thước, so sánh với khóa phân loại của các tác giả Phan Thế Việt, Nguyễn Thị Kỳ, Nguyễn Thị Lê 1977. Từ đó kết luận loài sán phát hiện được tại địa điểm nghiên cứu.
3.5.3. Thu thập trứng sán Dicrocoelium dendriaticum và Eurytrema pancreaticum pancreaticum
- Mổ tử cung sán trưởng thành:
Sán trưởng thành thu thập từ gan, ống dẫn mật (Dicrocoelium
có kích thước lớn, vùng tử cung rộng, rõ, chứa nhiều trứng. Rửa sạch sán trong nước cất, dùng kéo tiểu phẫu, kim giải phẫu mổ tử cung sán. Chỉ thu thập phần cuối tử cung sán bằng cách dùng kéo tiểu phẫu cắt ngang phần thân sán ở phía trước và phía sau giác bụng 4mm. Dùng kim giải phẫu phá vỡ tử cung sán trong đĩa petri có chứa nước cất. Trứng sán được cho qua lưới lọc, làm sạch bằng phương pháp gạn rửa sa lắng , đếm và nuôi trứng trong các môi trường.
- Thu thập trứng sán từ chất chứa trong dịch mật trâu, bò nhiễm sán. Gạn rửa sa lắng chất chứa trong dịch mật trâu bò.
- Phương pháp đếm trứng Eurytrema pancreaticum bằng buồng đếm tự tạo:
Trứng sau khi được thu thập đem pha loãng ở mật độ thích hợp. Dùng một phiến kính sạch, hai công tơ hút sạch (một dùng để hút dung dịch có chứa trứng, một dùng để hút nước cất). Lấy một vài giọt dung dịch chứa trứng bằng công tơ hút đưa lên phiến kính, đếm toàn bộ số trứng có trong các giọt dung dịch đó. Sau đó dùng công tơ hút thứ hai hút nước cất rửa các giọt dung dịch chứa trứng đã được đếm vào hộp lồng. Tiếp tục hút dung dịch chứa trứng và đếm. Cứ tiến hành như vậy đến khi đếm được số lượng trứng cần thiết.
3.5.4. Kiểm tra phân tìm trứng sán Dicrocoelium dendriaticum và
Eurytrema pancreaticum
- Lấy mẫu phân theo phương pháp ngẫu nhiên đơn giản.Phân bò lấy để dùng làm xét nghiệm phải đảm bảo chính xác đúng con vật để chẩn đoán, phân xét nghiệm phải còn mới, còn tươi và có lý do rõ ràng. Để lấy phân xét nghiệm chúng tôi đến tận các gia đình nuôi trâu và các lò mổ vào sáng sớm, lấy trực tiếp ngay tại chuồng nuôi nhốt. Lấy mẫu phân còn tươi, mới theo cách ngẫu nhiên của các con bò nghi nhiễm sán lá gan lớn thuộc mọi lứa tuổi đã nêu trên.
Cách tiến hành: Mỗi mẫu phân lấy khoảng 10 – 15g được cho vào túi nilon sạch, bên ngoài mỗi túi được ghi chép đầy đủ thông tin về chủ gia súc, địa chỉ, lứa tuổi, khối lượng, tính biệt. Tất cả những thông tin trên đều được ghi chép đầy đủ vào sổ theo dõi, do chưa được xét nghiệm ngay nên mẫu phân được bảo quản bằng cách cho vài giọt Formalin 1% để trong tủ lạnh dưới 100C.
- Xét nghiệm phân tìm trứng sán lá gan nhỏ bằng phương pháp dội rửa nhiều lần.
- Xét nghiệm phân tìm trứng sán lá tuyến tụy bằng phương pháp dội rửa nhiều lần.
Phương pháp gạn rửa sa lắng.
Lợi dụng sự chênh lệch tỷ trọng của trứng sán với nước sạch để phân ly trứng ra khỏi dung dịch phân. Trứng sán lá có trọng lượng riêng lớn hơn nước nên chìm xuống dưới.
Lấy 5-10 gram phân của gia súc cần chẩn đoán cho vào cốc sạch. Đổ vào cốc một ít nước sạch dùng đũa thủy tinh khuấy nát phân sau đó thêm lượng nước gấp khoảng 10 lần lượng phân. Lọc dung dịch qua lưới sắt vào cốc sạch to hơn, cặn bỏ đi. Đổ thêm nước sạch cho đầy cốc, khuấy đều, để yên tĩnh khoảng 4-5 phút, cẩn thận lọc lấy cặn gạn bỏ phần nước trong ở trên đi, cứ làm như thế cho đến khi nước phía trên trong và cặn ở đáy cốc còn ít, thì gạn bỏ phần nước trong phía trên đi lấy cặn đáy cho vào đĩa petri hoặc đĩa kính đồng hồ, quan sát dưới kính hiển vi để tìm trứng sán.
- Chẩn đoán phân biệt trứng sán lá gan nhỏ và sán lá tuyến tụy dựa vào đặc điểm hình thái và màu sắc của trứng.
- Cường độ nhiễm trứng được xác định bằng phương pháp Mc.Master.
Phương pháp đếm trứng Mc. Master
Cho 3 gam phân vào bình thủy tinh, hoặc lọ nhựa. Cho nước sạch đến vạch 45ml, dùng đũa thủy tinh hay viên bi trộn đều lọc qua lưới lọc có kích cỡ
16-36 lỗ/cm2. Cho thêm nước sạch đến vạch 45 ml, trộn đều và hút dung dịch cho lên 2 buồng đếm của Slide. để yên từ 2-5 phút sau đó đưa soi dưới kính hiển vi đếm số trứng trên hai buồng đếm.
Phương pháp này cho phép định lượng chính xác số lượng trứng có trong 1 gam phân, nó cho phép đánh giá mức độ cảm nhiễm của sán. Dùng Phương pháp này để đánh giá hiệu quả của thuốc tẩy sán.
Cách tính số trứng trong 1 gam phân:
- Thể tích của buồng đếm là 0,15 ml. Ta có 0,15 ml của 3 gam phân trong dung dịch 45 ml.
- Gọi số trứng đếm được là X
Số trứng trong 45ml là: X x 45 / 0,15
Số trứng có trong 1 gam phân là: X x 45 / 0,15 x 3
- Định loại trứng sán theo phương pháp định loại của Mognig (Trịnh Văn Thịnh, 1963)
3.5.5. Kích thước của Dicrocoelium dendriaticum và Eurytrema pancreaticum gây bệnh cho bò ở Việt Nam pancreaticum gây bệnh cho bò ở Việt Nam
Định loài Dicrocoelium dendriaticum và Eurytrema pancreaticum (theo Phan Thế Việt, Nguyễn Thị Kỳ, Nguyễn Thị Lê, 1977) . Đo kích thước của sán trưởng thành bằng phương pháp số học trên thước đo có chia vạch đến đơn vị mm.
Đo kích thước của trứng Dicrocoelium dendriaticum và Eurytrema pancreaticum bằng trắc vi thị kính và trắc vi vật kính .
3.5.6. Sức sống của trứng Dicrocoelium dendriaticum và Eurytrema pancreaticum trong các môi trường
- Xác định sức sống của trứng sán trong môi trường hóa chất qua phương pháp thực nghiệm.
- Xác định sức sống của trứng sán trong bể biogas qua phương pháp thực nghiệm.
3.6. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1: xác định thành phần loài của sán lá gan nhỏ
- Thu thập sán trưởng thành từ ống dẫn mật của bò làm tiêu bản và nhuộm bằng thuốc nhuộm carmin
- Định loại sán tới loài.
- Chỉ tiêu theo dõi: loài sán lá gan nhỏ ở bò vùng nghiên cứu.
Thí nghiệm 2: xác định thành phần loài sán lá tuyến tụy
- Thu thập sán trưởng thành từ ống dẫn tụy của bò làm tiêu bản và nhuộm bằng thuốc nhuộm carmin
- Định loại sán tới loài.
- Chỉ tiêu theo dõi: loài sán lá tuyến tụy ở bò vùng nghiên cứu.
Thí nghiệm 3: tình hình nhiễm sán lá gan nhỏ và sán lá tuyến tụy ở
vùng nghiên cứu
- Chọn 4 xã chăn nuôi nhiều bò trong huyện, mỗi xã kiểm tra 300 bò thuộc các lứa tuổi.
- Xét nghiệm phân bò - Chỉ tiêu theo dõi:
+ Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ và sán lá tuyến tụy ở bò
+ Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ và sán lá tuyến tụy theo tuổi bò
Thí nghiệm 4: tỷ lệ và cường độ nhiễm sán lá gan nhỏ và sán lá tuyến tụy qua mổ khám
- Mổ khám 70 bò thuộc các lứa tuổi - Thu thập sán trưởng thành
- Chỉ tiêu theo dõi:
+ Tỷ lệ nhiễm sán theo loài + Cường độ nhiễm sán theo loài
Thí nghiệm 5: nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của sán lá gan nhỏ và sán lá tuyến tụy ở bò vùng nghiên cứu.
- Xác định kích thước của sán trưởng thành - Xác định hình thái, kích thước trứng sán - Chỉ tiêu theo dõi:
+ Kích thước của sán lá gan nhỏ + Kích thước của sán lá tuyến tụy + Kích thước của trứng sán lá gan nhỏ + Kích thước của trứng sán lá tuyến tụy
Thí nghiệm 6: tìm hiểu về sức kháng của trứng sán lá gan nhỏ và sán lá tuyến tụy trong môi trường có độ pH khác nhau.
Ngâm trứng trong các môi trường axit và kiềm có độ pH 4,5; 6,5; 7; 8 trong phòng thí nghiệm.
- Chỉ tiêu theo dõi:
+ Biến đổi về hình thái, màu sắc + Sự tan rã của ấu trùng trong trứng
Thí nghiệm 7: sức đề kháng của trứng trong bể Biogas
Biogas là một loại khí được sinh ra khi phân động vật và các chất hữu cơ lên men trong điều kiện không có không khí (quá trình hiếm khí). Vi sinh vật phân huỷ các chất tổng hợp và khí được sinh ra gồm metan (CH4), nitơ (N2), cacbon dioxit (CO2) và hydro sulphate (H2S). Trong đó, các khí CH4 và CO2 có thể cháy được.
Hầm biogas là một hệ thống tự động, khi khí được sinh ra trong hầm phân hủy, lượng khí này sẽ đẩy cặn bã vào bể áp lực và ống nạp nhiên liệu. Khi mở van thì chất cặn bã trong bể áp lực và ống nạp nhiên liệu sẽ đẩy khí ra để sử dụng.