Xác định hàm lượng polyphenol tổng số

Hàm lượng polyphenol tổng được xác định theo phương pháp của Singlton và cộng sự (1999) [63] với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Tóm tắt: Lấy 0,1 ml dịch chiết trộn với 0,9 ml nước cất trước khi thêm 1 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu (10%) và 2,5 ml Na2CO3 7,5%. Hỗn hợp được lắc đều rồi ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút trước khi đo bước sóng ở 760 nm trên máy quang phổ kế (Spectrophotometry, Carry 50, Varian, Australia). Kết quả được báo cáo bởi mg gallic acid tương đương (GAE)/g chất khô. Mỗi phân tích được tiến hành lặp lại hai lần, kết quả báo cáo là giá trị trung bình  độ lệch chuẩn.

2.4.3 Xác định khả năng khử gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)

Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH là phương pháp được sử dụng rộng rãi để đánh giá khả năng khử gốc tự do của các mẫu khác nhau (Lee và cộng sự, 2003) [47]. Khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định dựa theo phương pháp của Fu và cộng sự (2002) [38] với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Lấy dịch chiết với các thể tích mẫu khác nhau trộn với nước cất để đạt thể tích tổng cộng 3 ml. Sau đó thêm 1 ml dung dịch DPPH 0.2 mM (pha trong ethanol 99,5%), lắc đều và để yên trong bóng tối 30 phút. Độ hấp thu quang học được đo ở bước sóng 517 nm (Spectrophotometer, Carry 50, Varian, Australia).

Khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định theo công thức sau: DPPH (%) = 100 × (ACT – ASP)/ACT.

Trong đó:

ACT: Độ hấp thu quang học của mẫu trắng không chứa dịch chiết; ASP: Độ hấp thu quang học của mẫu có chứa dịch chiết.

Kết quả báo cáo bởi giá trị EC50 là nồng độ của dịch chiết khử được 50% gốc tự do DPPH ở điều kiện xác định. Giá trị EC50 càng thấp thì hoạt tính khử gốc tự do DPPH càng cao. Vì vậy, hoạt tính chống oxy hóa càng mạnh. Mỗi phân tích được tiến hành lặp lại hai lần, kết quả báo báo là giá trị trung bình  độ lệch chuẩn.

2.4.4 Xác định tổng năng lực khử

Năng lực khử được xác định theo phương pháp của Oyaizu (1986) [54] với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Lấy dịch chiết với các thể tích khác nhau lần lượt là 50, 100, 150, 200µl trộn với nước cất để đạt thể tích cuối cùng 1,5 ml trước khi thêm 0,5 ml K3(Fe[CN] 6) 1%. Hỗn hợp được ủ ở 50C trong 20 phút, sau đó thêm 0,5 ml TCA 10 % và 2 ml nước cất, cuối cùng 0,4 ml FeCl3 0,1% được thêm vào rồi lắc đều. Độ hấp thu quang học được xác định ở bước sóng 700 nm. Độ hấp thu quang học càng cao thì năng lực khử càng mạnh. Kết quả được báo cáo bởi giá trị EC50, là nồng độ của dịch chiết làm tăng độ hấp thu quang học lên 0,5. Mỗi phân tích được tiến hành lặp lại hai lần, kết quả báo cáo là giá trị trung bình  độ lệch chuẩn.

2.4.5 Xác định chỉ số Peroxide (PV)

Chỉ số peroxide được xác định theo phương pháp của Richard và Hultin (2002) với một vài sự thay đổi nhỏ [58]. Tóm tắt: Hút 100µl dầu, dầu được chiết theo phương pháp của Bligh and Dyer (1959) [26], sau đó thêm 1900 µl hỗn hợp chloroform và methanol (1:1, v/v) thêm 10µl hỗn hợp NH4SCN 30% và FeCl2, tiếp tục giữ hỗn hợp thêm 10 phút trước khi đo độ hấp thu quang học ở bước sóng 300 nm (Spectrophotometer, Carry 50, Varian, Australia). Hàm lượng HPO được xác định từ đường chuẩn Cumene hydroperoxide. Mỗi phân tích được tiến hành lặp lại hai lần, kết quả báo cáo là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.

2.4.6 Xác định chỉ số TBARS

Khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá ca cao được thử nghiệm trên thịt cá bớp bảo quản lạnh bằng cách xác định chỉ số TBARS (các chất phản ứng với acid Thiobarbituric). Phân tích TBARS đã được đề nghị cách đây hơn 40 năm và hiện nay phương pháp này được sử dụng phổ biến để xác định sự oxy hóa lipid. Phương pháp đo Malonaldehyde (MDA) này được hình thành như sản phẩm tách ra của một

endoperoxide của các acid béo không bão hòa từ sự oxy hóa lipid. Nó là tiền đề hình thành MDA từ các acid béo. MDA được phản ứng với acid thiobarbituric (TBA) hình thành chất có màu hồng (TBARS) được đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 532- 535nm 52.

Các chất phản ứng với TBA được xác định theo phương pháp của Lemon (1957) [48] với một sự hiệu chỉnh nhỏ. Tóm tắt: Khoảng 5g thịt cá thu đã được xay nhuyễn trộn với 10 ml dung dịch chiết TCA 7,5% và tiến hành chiết trong thời gian 10 phút, sau đó lọc quagiấy lọc Qualitative No.103. Phần dịch lọc thu được trộn với dung dịch TBA 0.02 M theo tỷ lệ thể tích bằng nhau để đạt thể tích tổng cộng là 10 ml trong một ống nghiệm và giữ ở nhiệt độ 90C trong 30 phút. Sau đó làm nguội dưới vòi nước chảy đến nhiệt độ phòng trước khi đi xác định độ hấp thu quang học ở bước sóng 532 nm (Spectrophotometer, Carry 50, Varian, Australia). Hàm lượng Malonaldehyde (MAD) được tính toán từ đường cong chuẩn được xây dựng với nồng độ MAD từ 0.01 đến 0.05 M. Kết quả được báo cáo là M MAD/g thịt cá. Mỗi phân tích được thực hiện lặp lại hai lần. Kết quả báo cáo là giá trị trung bình  độ lệch chuẩn.

2.4.7 Phương pháp xử lý số liệu

Các kết quả thí nghiệm được xác định từ trung bình cộng của hai lần thí nghiệm độc lập. Đồ thị được vẽ bằng phần mềm Microsoft Excel 2007. Số liệu được xử lý bằng phần mềm Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) phiên bản 16.0. Giá trị trung bình được phân tích ANOVA theo phép thử Ducan. Giá trị p<0.05 chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê.

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Độ ẩm của lá ca cao khô

Độ ẩm của lá ca cao khô được thể hiện ở Bảng 3.1. Kết quả cho thấy lá ca cao sau khi phơi khô để sử dụng cho quá trình nghiên cứu có độ ẩm tương đối thấp, tương ứng là 12,69%.