Cấu trúc của các hợp chất phenol quyết định cơ chế hoạt động chống oxy hóa. Cơ chế chống oxy hóa của các hợp chất phenol như sau: (1) Khử và vô hoạt các gốc tự do nhờ thế oxy hóa khử thấp; (2) Tạo phức với các ion Fe2+ và Cu+ và (3) Kìm hãm hoạt động của các enzyme có khả năng tạo ra
các gốc tự do như xanthine oxidase. Các hợp chất flavonoid (Fl-OH) nhờ thế oxy hóa khử thấp có thể khử các gốc tự do như peroxyl, alkoxyl và hydroxyl bằng cách nhường nguyên tử hydro .
Fl-OH + R → Fl-O + RH (Với R là gốc tự do)
Gốc flavonoid tự do (Fl-O) sau đó lại kết hợp với một gốc tự do khác để tạo thành hợp chất bền (Hình 1.9).
Hình 1.9. Vô hoạt các gốc tự do bởi flavonoid
Sắt và đồng là những kim loại đảm nhận những vai trò sinh lý nhất định trong cơ thể như tham gia vận chuyển oxy (hemoglobin), cofactor của nhiều enzyme. Tuy nhiên các kim loại này có thể tham gia phản ứng Fenton và Haber-Weiss để tạo nên các gốc tự do. Các flavonoid có khả năng tạo phức với các kim loại này và hạn chế tác dụng xấu của chúng (Hình 1.10)
Fe3+ O2→ Fe2+ + O2
H2O2 + Fe2+(Cu+) → OH + OH- + Fe3+(Cu2+) O2 + H2O2 → OH + OH- + O2
Hình 1.10. Cơ chế tạo phức giữa các flavonoid và các ion kim loại
Hoạt động của các xanthine oxidase cũng là một nguồn tạo ra các gốc tự do. Khi sự có mặt của oxy, enzyme này xúc tác sự oxy hóa xanthine thành acid uric, phân tử oxy nhận điện tử và trở thành ion superoxyde.
Xanthine + 2O2 + H2O Xanthine oxidase Acid uric + 2O2- + 2H+
Các flavonoid có cấu tạo vòng A giống như vòng purin của xanthine được coi như chất kìm hãm cạnh tranh của xanthine oxidase do đó ngăn ngừa sự tạo ion superoxyde.
Khả năng chống oxy hóa của các hợp chất phenol phụ thuộc chặt chẽ vào đặc điểm cấu tạo của chúng. Các bộ phận đảm nhiệm chức năng chống oxy hóa của phenol được giới thiệu ở Hình 1.11. Đó là: (1) Các nhóm hydroxyl ở dạng ortho của vòng B có khả năng cho điện tử; (2) Liên kết đôi giữa C2 và C3 và nhóm ceton ở C4 đảm bảo việc phân bố lại điện tử cho vòng B; (3) Các nhóm hydroxyl ở C3 và C5 cùng tạo phức với Ceton ở C4 đảm bảo khả năng tạo phức với kim loại.
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu
2.1.1 Nguyên liệu lá ca cao
Lá ca cao được hái tại tỉnh Gia Lai ở dạng tươi, sau đó phơi khô. Lá được nghiền nhỏ bằng máy xay sinh tố, bao gói hút chân không bằng túi nhựa PA và bảo quản ở ngăn mát của tủ lạnh với nhiệt độ 80C.
2.1.2 Nguyên liệu cá bớp
Cá bớp được mua tại Cảng Hòn Rớ, thành phố Nha Trang. Cá được bảo quản lạnh bằng đá trong thùng xốp và vận chuyển về phòng thí nghiệm công nghệ chế biến, trường Đại Học Nha Trang. Tại đây, cá được xử lý và xay nhuyễn bằng máy xay sinh tố để tiến hành nghiên cứu sẽ được mô tả cụ thể ở các thí nghiệm sau.
2.2 Hóa chất
Acid tricloaxetic (TCA) ethanol, methanol được sản xuất tại Trung Quốc; FeCl2, KCl, EGCG, Cloroform, 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), thuốc thử Folin–Ciocalteu, Potassium ferricyanide (K3(Fe[CN]6), Aluminium chloride (AlCl3) và Sodium carbonate (Na2CO3) được mua từ công ty Sigma Ardrich (Hoa Kỳ); Thiobarbituric acid (TBA) và acid gallic mua từ công ty Wako (Nhật Bản). Tất cả hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt hạng phân tích.
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Quy trình bố trí thí nghiệm tổng quát
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Lá ca cao (Theobroma cacao) tươi Xay nhỏ Lọc Dịch chiết Bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống
oxy hóa (tổng năng lực khử, khả năng khử gốc tự do DPPH)
Bảo quản dịch chiết giàu polyphenol từ lá ca cao
Chiết
Bố trí thí nghiệm xác định độ ẩm Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của điều kiện chiết (nồng độ dung môi,
nhiệt độ, thời gian, sóng siêu âm) đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả
năng chống oxy hóa
Bố trí thí nghiệm áp dụng dịch chiết lá ca cao để hạn chế sự oxy hóa lipid trên (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
thịt cá bớp bảo quản lạnh Rửa
Giải thích quy trình:
Lá ca cao tươi được hái tại tỉnh Gia Lai, nguyên liệu lá ca cao dạng tươi được rửa sạch tạp chất, sau đó phơi khô dưới ánh nắng mặt trời đến độ ẩm là 8%. Lá khô được xay nhỏ rồi đem bảo quản trong các túi PA trong điều kiện hút chân không, ở nhiệt độ lạnh (80C) đến khi sử dụng. Sau đó lá được đem về phòng thí nghiệm của khoa Công nghệ Thực Phẩm, trường Đại học Nha Trang để tiến hành nghiên cứu. Chọn lá khô để nghiên cứu nhằm mục đích: lá khô có hàm ẩm nhỏ góp phần hạn chế sự phát triển của vi sinh vật gây hư hỏng lá, ức chế các quá trình tổng hợp và chuyển hóa trong lá. Bên cạnh đó, lá khô gọn, nhẹ nên được bảo quản dễ dàng, ít chiếm diện tích chứa đựng và thuận lợi trong việc vận chuyển trong quá trình tiến hành nghiên cứu. Đồng thời, khi hàm lượng ẩm trong nguyên liệu giảm, tốc độ trích ly tăng lên vì nước tác dụng với protein và các chất háo nước khác ngăn cản sự dịch chuyển của dung môi thấm sâu vào trong nguyên liệu, làm chậm quá trình khuếch tán.
Xay lá: Dùng máy xay sinh tố để xay nhỏ lá vì lá nhỏ sẽ làm tăng diện tích tiếp xúc giữa lá với dung môi, góp phần phá vỡ cấu trúc tế bào lá, tạo điều kiện thuận lợi cho các chất hòa tan trong dung môi.
Lá sau khi được nghiền nhỏ, một phần nhỏ được đem đi xác định độ ẩm. Chiết: Hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa (năng lực khử, khả năng khử gốc tự do DPPH) đều bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố trong quá trình chiết như nồng độ dung môi, nhiệt độ, thời gian và sóng siêu âm. Do đó, tại công đoạn chiết này sẽ tiến hành bố trí các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố trên để tìm ra điều kiện chiết cho hoạt tính mong muốn cao.
Lọc: Mẫu sau khi chiết sẽ được lọc bằng máy lọc hút chân không để thu dịch có chứa hợp chất cần thiết, loại bỏ những tạp chất không tan như cặn và bã lá.
Dịch chiết thu được sẽ được đem đi bố trí các thí nghiệm xác định hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa (tổng năng lực khử, khả năng khử gốc tự do DPPH).
Sau khi xác định được điều kiện chiết thích hợp cho hàm lượng polyphenol và khả năng chống oxy hóa cao thì tiến hành bố trí thí nghiệm áp dụng dịch chiết lá ca cao để hạn chế oxy hóa lipid trên thịt cá bớp bảo quản lạnh
2.3.2 Thí nghiệm xác định độ ẩm của lá ca cao khô
(Phụ lục 1)
2.3.3 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ lá ca cao polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ lá ca cao
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá ca cao
Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá ca cao được mô tả ở hình 2.2. Cân 0,5 g nguyên liệu lá ca cao khô và cho vào bình tam giác dung tích 100 ml. Lá ca cao nguyên liệu được chiết trong 0; 25; 50; 75 và 100% ethanol.
Lá ca cao khô (đã xay nhỏ) Chiết Ethanol 0% Ethanol 100% Ethanol 75% Ethanol 25% Lọc Dịch chiết Xác định hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa
Chọn nồng độ dung môi ethanol thích hợp
Ethanol 50%
Trong thí nghiệm này, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/50 (w/v), nhiệt độ chiết là 60C và thời gian chiết là 30 phút, được giữ cố định. Quá trình chiết được thực hiện trong bể ổn nhiệt (Elma, S300H, Elmasonic, Germany). Sau khi kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp được lọc bằng giấy lọc Qualitative No.103. Toàn bộ dịch chiết thu được sau khi lọc được bổ sung cùng loại dung môi đến thể tích cuối cùng là 50ml. Sau đó được đem đi xác định hàm lượng polyphenol tổng số, tổng năng lực khử và khả năng khử gốc tự do DPPH.
2.3.4 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá ca cao tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá ca cao
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá ca cao
Lá ca cao khô (đã xay nhỏ) Chiết 30C 45C 75C 90C Lọc Dịch chiết Xác định hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa
- Hoạt tính chống oxy hóa Chọn nhiệt độ chiết thích hợp
Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá ca cao được mô tả ở hình 2.3. Cân 0,5g lá ca cao khô cho vào bình tam giác dung tích 100 ml. Trong thí nghiệm này, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/50 (w/v), lá ca cao nguyên liệu được chiết bằng ethanol 50% ở các nhiệt độ khác nhau bao gồm 30; 45; 60; 75 và 90C, trong cùng khoảng thời gian là 30 phút. Quá trình chiết được thực hiện trong bể ổn nhiệt (Elma, S300H, Elmasonic, Germany). Sau khi kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp được lọc bằng giấy lọc Qualitative No.103. Toàn bộ dịch chiết thu được sau khi lọc, được bổ sung thêm ethanol 50% đến thể tích cuối cùng là 50 ml. Sau đó được đem đi xác định hàm lượng polyphenol tổng số, tổng năng lực khử và khả năng khử gốc tự do DPPH.
2.3.5 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá ca cao tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá ca cao
Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá ca cao
Lọc Dịch chiết
Xác định hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa Chọn thời gian chiết thích hợp
Lá ca cao khô (đã xay nhỏ)
Chiết
Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá ca cao được mô tả ở hình 2.4. Cân 0,5 g lá ca cao nguyên liệu cho vào bình tam giác dung tích 100 ml. Trong thí nghiệm này, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/50 (w/v), lá ca cao nguyên liệu được chiết bằng ethanol 50% ở các thời gian chiết khác nhau là 10; 30; 60; 90 và 120 phút, tại cùng nhiệt độ là 75C. Quá trình chiết được thực hiện trong bể ổn nhiệt (Elma, S300H, Elmasonic, Germany). Sau khi kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp được lọc bằng giấy lọc Qualitative No.103. Toàn bộ dịch chiết thu được sau khi lọc, được bổ sung thêm ethanol 50% đến thể tích cuối cùng là 50 ml. Sau đó được đem đi xác định hàm lượng polyphenol tổng số, tổng năng lực khử và khả năng khử gốc tự do DPPH.
2.3.6 Thí nghiệm ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ lá ca cao số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ lá ca cao (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 2.5. Thí nghiệm ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá ca cao
Lá ca cao khô (đã xay nhỏ) Lọc Dịch chiết - Hàm lượng polyphenol - Năng lực khử - Khả năng khử gốc tự do DPPH
Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá ca cao được mô tả ở hình 2.5. Cân chính xác 0,5 g lá ca cao khô nguyên liệu cho vào bình tam giác dung tích 100 ml. Trong thí nghiệm này, lá ca cao nguyên liệu được chiết bằng ethanol 50%, tại nhiệt độ là 75C trong thời gian 75 phút và bằng hai phương pháp chiết khác nhau (chiết tĩnh và chiết có đánh sóng siêu âm). Quá trình chiết được thực hiện trong bể ổn nhiệt (Elma, S300H, Elmasonic, Germany). Sau khi kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp được lọc bằng giấy lọc Qualitative No.103. Dịch chiết thu được sau khi lọc được bổ sung cùng loại dung môi đến thể tích cuối cùng là 50 ml. Sau đó, dịch chiết được xác định hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa. Từ đó so sánh được sự khác nhau giữa hai phương pháp chiết (chiết tĩnh và chiết có đánh sóng siêu âm).
2.3.7 Thí nghiệm sử dụng dịch chiết từ lá ca cao để hạn chế sự oxy hóa lipid trên thịt cá bớp trong quá trình bảo quản lạnh trên thịt cá bớp trong quá trình bảo quản lạnh
Chuẩn bị dịch chiết cô đặc:
Cân chính xác 12g nguyên liệu lá ca cao khô cho vào 6 bình tam giác có dung tích 100 ml, mỗi bình 2 g. Tiếp theo, 100 ml dung dịch 50% ethanol được thêm vào và tiến hành chiết ở điều kiện chiết thích hợp đã được xác định ở các bước trên (nhiệt độ chiết 75C, thời gian chiết 90 phút, chiết bằng phương pháp sử dụng sóng siêu âm) trong bể ổn nhiệt (Elma, S300H, Elmasonic, Germany). Kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp được lọc qua giấy lọc Qualitative No.103. Dịch chiết thu được tiến hành cô đặc bằng máy cô quay chân không (Buchi – Thụy Sỹ) đến thể tích mẫu còn 95ml và sử dụng để bảo quản thịt cá bớp.
Xử lý nguyên liệu cá bớp:
Cá bớp nguyên liệu còn tươi được mua tại cảng Hòn Rớ, thành phố Nha Trang, được bảo quản lạnh bằng nước đá trong thùng xốp và vận chuyển về phòng thí nghiệm trường Đại học Nha Trang. Trước khi thí nghiệm, cá được rửa sạch để loại bỏ tạp chất và một phần vi sinh vật bám trên bề mặt. Tiếp theo cá được fillet, loại bỏ da, rửa sạch, để ráo và xay
nhuyễn bằng máy xay sinh tố. Thịt cá xay nhuyễn được sử dụng để nghiên cứu tác dụng hạn chế sự oxy hóa lipid của dịch chiết từ lá ca cao.
Tiến hành thí nghiệm:
Thịt cá bớp được chia thành bốn nhóm (nhóm 1, nhóm 2, nhóm 3, nhóm 4). Nhóm 1 trộn với nước cất (ĐC), nhóm 2 được xử lý trộn với dịch chiết lá ca cao có nồng độ 8,9 mg/ml (C1), nhóm 3 trộn với dịch chiết có nồng độ 17,8 mg/ml (C2), nhóm 4 trộn với Epigallocatechin gallate nồng độ 8,9 mg/ml (EGCG) Trong tất cả các trường hợp trên, tỉ lệ dịch chiết, nước cất, dung dịch EGCG so với thịt cá là 5% (ml/g). Sau khi trộn với dịch chiết, thịt cá được đồng hóa bằng máy đồng hóa (IKA, T18B, Ultra – Turax, Germany) để giúp phân bố dịch chiết đều trong toàn bộ khối thịt cá. Cuối cùng thịt cá được bao gói trong các khay nhựa và được bảo quản lạnh ở nhiệt độ 4oC. Sau 0, 3, 6 và 9 ngày bảo quản, tiến hành lấy mẫu và đánh giá sự oxy lipid bằng phương pháp TBARS và chỉ số PV (Hình 2.6).
Hình 2.6. Bố trí thí nghiệm ứng dụng dịch chiết lá ca cao để hạn chế sự oxy hóa lipid thịt cá bớp trong quá trình bảo quản lạnh ở 4C
2.4 Phương pháp phân tích 2.4.1 Xác định hàm ẩm 2.4.1 Xác định hàm ẩm
Hàm ẩm của lá ca cao được xác định bằng phương pháp sấy khô đến khối lượng không đổi [11. Phân tích được lặp lại hai lần, kết quả báo cáo là giá trị trung bình độ lệch chuẩn.
2.4.2 Xác định hàm lượng polyphenol tổng số
Hàm lượng polyphenol tổng được xác định theo phương pháp của Singlton và cộng sự (1999) [63] với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Tóm tắt: Lấy 0,1 ml dịch chiết trộn với 0,9 ml nước cất trước khi thêm 1 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu (10%) và 2,5 ml Na2CO3 7,5%. Hỗn hợp được lắc đều rồi ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút trước khi đo bước sóng ở 760 nm trên máy quang phổ kế (Spectrophotometry, Carry 50, Varian, Australia). Kết quả được báo cáo bởi mg gallic acid tương đương (GAE)/g chất khô. Mỗi phân tích được tiến hành lặp lại hai lần, kết quả báo cáo là giá trị trung