1. Một số nguyớn tắc sinh học
Khi đặt ra mục đớch vă thực hiện thớ nghiệm chuyển gen cần chỳ ý một số vấn đề sinh học ảnh hưởng đến quõ trỡnh chuyển gen như sau:
- Khụng phải toăn bộ tế băo đều thể hiện tớnh toăn năng (totipotency).
- Cõc cđy khõc nhau cú phản ứng khụng giống nhau với sự xđm nhập của một gen ngoại lai.
sinh vă khả năng thu nhận gen biến nạp văo genome.
- Mụ thực vật lă hỗn hợp cõc quần thể tế băo cú khả năng khõc nhau. Cần xem xĩt một số vấn đề như: chỉ cú một số ớt tế băo cú khả năng biến nạp vă tõi sinh cđy. Ở cõc tế băo khõc cú hai trường hợp cú thể xảy ra: một số tế băo nếu được tạo điều kiện phự hợp thỡ trở nớn cú khả năng, một số khõc hoăn toăn khụng cú khả năng biến nạp vă tõi sinh cđy.
- Thănh phần của cõc quần thể tế băo được xõc định bởi loăi, kiểu gen, từng cơ quan, từng giai đoạn phõt triển của mụ vă cơ quan.
- Thănh tế băo ngăn cản sự xđm nhập của DNA ngoại lai. Vỡ thế, cho đến nay chỉ cú thể chuyển gen văo tế băo cú thănh cellulose thụng qua Agrobacterium, virus vă bắn gen hoặc phải phõ bỏ thănh tế băo để chuyển gen bằng phương phõp xung điện, siớu đm vă vi tiớm.
- Khả năng xđm nhập ổn định của gen văo genome khụng tỷ lệ với sự biểu hiện tạm thời của gen.
- Cõc DNA (trừ virus) khi xđm nhập văo genome của tế băo vật chủ chưa đảm bảo lă đờ liớn kết ổn định với genome.
- Cõc DNA (trừ virus) khụng chuyển từ tế băo năy sang tế băo kia, nú chỉ ở nơi mă nú được đưa văo.
- Trong khi đú, DNA của virus khi xđm nhập văo genom cđy chủ lại khụng liớn kết với genome mă chuyển từ tế băo năy sang tế băo khõc ngoại trừ mụ phđn sinh (meristem).
2. Phản ứng của tế băo với quõ trỡnh chuyển gen
Mục đớch chớnh của chuyển gen lă đưa một đoạn DNA ngoại lai văo genome của tế băo vật chủ cú khả năng tõi sinh cđy vă biểu hiện ổn định tớnh trạng mới. Nếu quõ trỡnh biến nạp xảy ra mă tế băo khụng tõi sinh được thănh cđy, hoặc sự tõi sinh diễn ra mă khụng kỉm theo sự biến nạp thỡ thớ nghiệm biến nạp chưa thănh cụng.
Ở rất nhiều loăi thực vật, điều khú khăn lă phải xõc định cho được kiểu tế băo năo trong cđy cú khả năng tiếp nhận sự biến nạp. Hạt phấn hay tế băo noờn sau khi được biến nạp cú thể được dựng để tạo ra cđy biến nạp hoăn toăn, thụng qua quõ trỡnh thụ tinh bỡnh
biến nạp. Trong khi đú, việc biến nạp gen văo hợp tử in vivo hay in vitro lại gặp nhiều khú khăn. Trong trường hợp năy, người ta thường phải kết hợp với kỹ thuật cứu phụi. Việc biến nạp gen đối với cõc tế băo đơn của cõc mụ phức tạp như phụi hay mụ phđn sinh thường cho ra những cđy khảm.
Từ nhiều thập kỷ qua người ta đờ biết rằng, tớnh toăn thể của tế băo thực vật đờ tạo điều kiện cho sự tõi sinh cđy hoăn chỉnh in vitro
qua quõ trỡnh phõt sinh cơ quan (hỡnh thănh chồi) hay phõt sinh phụi. Cõc chồi bất định hay phụi được hỡnh thănh từ cõc tế băo đơn được hoạt húa lă những bộ phận dễ dăng tiếp nhận sự biến nạp vă cú khả năng cho những cđy biến nạp hoăn chỉnh (khụng cú tớnh khảm).
3. Cõc bước cơ bản của chuyển gen
Từ khi người ta khõm phõ ra rằng cõc thớ nghiệm chuyển gen cú thể thực hiện nhờ một loại vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens, thỡ cõc nhă khoa học tin rằng Agrobacterium cú thể chuyển gen văo tất cả cõc cđy trồng. Nhưng sau đú kết quả thực tế cho thấy chuyển gen bằng Agrobacterium khụng thể thực hiện được trớn cđy ngũ cốc (một lõ mầm) vỡ thế hăng loạt kỹ thuật chuyển gen khõc đờ được phõt triển đú lă cõc kỹ thuật chuyển gen trực tiếp như bắn gen bằng vi đạn (bombardement/gene gun), vi tiớm (microinjection), xung điện (electroporation), silicon carbide, điện di (electrophoresis), siớu đm (ultrasonic), chuyển gen qua ống phấn (pollen tube)... Đến nay, nhờ cải tiến cõc vector chuyển gen nớn kỹ thuật chuyển bằng A. tumefaciens đờ thănh cụng cả ở cđy ngũ cốc đặc biệt lă lỳa. Kỹ thuật năy trở nớn một kỹ thuật đầy triển vọng đối với cđy chuyển gen ở thực vật.
Quõ trỡnh chuyển gen được thực hiện qua cõc bước sau : - Xõc định gen liớn quan đến tớnh trạng cần quan tđm.
- Phđn lập gen (PCR hoặc săng lọc từ thư viện cDNA hoặc từ thư viện genomic DNA).
- Gắn gen văo vector biểu hiện (expression vector) để biến nạp. - Biến nạp văo E. coli.
phương phõp khõc nhau đờ kể trớn.
- Chọn lọc cõc thể biến nạp trớn mụi trường chọn lọc. - Tõi sinh cđy biến nạp.
- Phđn tớch để xõc nhận cõ thể chuyển gen (PCR hoặc Southern blot) vă đõnh giõ mức độ biểu hiện của chỳng (Northern blot, Western blot, ELISA hoặc cõc thử nghiệm in vivo khõc...).
Nguyớn liệu để thực hiện sự biến nạp lă cõc tế băo thực vật riớng lẽ, cõc mụ hoặc cđy hoăn chỉnh.
Cản trở lớn nhất của sự tiếp nhận DNA ở phần lớn sinh vật lă thănh tế băo. Muốn lăm mất thănh tế băo thực vật người ta thường sử dụng enzyme vă dưới những điều kiện thớch hợp người ta cú thể tạo ra tế băo trần, tế băo trần tiếp nhận DNA núi chung dễ dăng. Chẳng hạn sử dụng phương phõp xung điện, ở đđy tế băo được đặt ở trong một xung điện ngắn, xung điện năy cú thể lăm xuất hiện những lỗ tạm thời ở trớn măng tế băo, những phđn tử DNA cú thể đi văo bớn trong tế băo. Sau khi biến nạp người ta tõch những enzyme phđn giải vă để cho tế băo phõt triển, thănh tế băo mới được tạo nớn. Cõc tế băo biến nạp năy được nuụi cấy trớn cõc mụi trường nhđn tạo thớch hợp cựng với cõc chất kớch thớch sinh trưởng để tạo nớn cđy hoăn chỉnh. Sau đú bằng cõc phương phõp phđn tớch genome như PCR, Southern blot, Northern blot được thực hiện để tỡm ra chớnh xõc những cđy biến đổi gen.
Bớn cạnh cõc phương phõp biến nạp Agrobacterium hoặc xung điện, hiện nay cú hai phương phõp khõc cũng thường được sử dụng để đưa DNA văo trong tế băo. Phương phõp thứ nhất lă vi tiớm: với một cõi pipet rất nhỏ người ta cú thể đưa cõc phđn tử DNA trực tiếp văo nhđn tế băo mă người ta muốn biến nạp. Phương phõp năy đầu tiớn chỉ được sử dụng ở tế băo động vật, nhưng sau năy người ta đờ sử dụng cho tế băo thực vật. Phương phõp thứ hai lă bắn văo tế băo cõc vi đạn (microprojectile), thường bằng văng hoặc wolfram, được bao bọc bởi DNA. Phương phõp năy được gọi lă phi sinh học vă được sử dụng thănh cụng ở nhiều loại tế băo khõc nhau.
Ở động-thực vật chuyển gen, sản phẩm cuối cựng thường khụng phải lă tế băo biến nạp, mă lă một cơ thể biến nạp hoăn toăn.
Tuy nhiớn, tõi sinh cđy một lõ mầm như ngũ cốc vă cõc loại cỏ khõc cũng gặp một văi khú khăn. Từ một tế băo biến nạp duy nhất người ta cú thể tạo ra một cđy chuyển gen, trong đú mỗi tế băo mang DNA ngoại lai vă tiếp tục chuyển cho thế hệ sau sau khi nở hoa vă tạo hạt.