V. Phương phõp PCR
Cụng nghệ chuyển ge nở động vật I Khõi niệm chung
I. Khõi niệm chung
1. éộng vật chuyển gen
éộng vật chuyển gen lă động vật cú gen ngoại lai (gen chuyển) xen văo trong DNA genome của nú. Gen ngoại lai năy phải được truyền lại cho tất cả mọi tế băo, kể cả cõc tế băo mầm. Việc chuyển gen ngoại lai văo động vật chỉ thănh cụng khi cõc gen năy di truyền lại cho thế hệ sau.
2. Sự phõt triển của khoa học chuyển gen ở động vật
Văo thập kỷ 1970, cõc thớ nghiệm nghiớn cứu đờ được thực hiện với cõc tế băo ung thư biểu bỡ phụi vă cõc tế băo ung thư quõi thai để tạo nớn chuột thể khảm (Brinster,1974; Mintz vă Illmensee, 1975; Bradley, 1984). Trong cõc động vật thể khảm năy, cõc tế băo nuụi cấy lấy từ một dũng chuột được đưa văo phụi của một dũng chuột khõc bằng quần tụ phụi trực tiếp (direct embryo aggregation) hoặc bằng cõch tiớm văo phụi ở giai đoạn phụi nang (blastocyst). Chuột thể khảm trưởng thănh cú thể được sinh ra bằng sự đúng gúp tế băo từ cõc bố mẹ khõc nhau vă sẽ biểu hiện tớnh trạng của mỗi dũng. Một kiểu chuyển genome khõc ở động vật lă chuyển nhđn nguyớn từ một phụi văo tế băo trứng chưa thụ tinh của một dũng nhận khõc một cõch trực tiếp (Mc Grath vă Solter,1983). Những động vật biến đổi gen bằng chuyển nhđn năy được tạo ra mă khụng cần một kỹ thuật tõi tổ hợp DNA năo vă chỳng lă sự kiện quan trọng trong việc lăm sõng tỏ cõc cơ chế điều hoă di truyền ở động vật cú vỳ.
Bước phõt triển tiếp theo của kỹ thuật chuyển gen được thực hiện bằng cõch tiớm retrovirus văo cõc phụi chuột đờ được nuụi cấy trước (Jeanish vă Mintz, 1974; Jeanish, 1976). Thụng tin di truyền của virus được chuyển một cõch hiệu quả văo genome của động vật nhận vă sau đú ớt lđu kỹ thuật sử dụng retrovirus lăm vector cho cõc
đoạn DNA ngoại lai đặc biệt đờ được phõt triển (Stuhmann, 1984). Sử dụng retrovirus như lă vật truyền trung gian đối với việc chuyển gen đờ tạo nớn hiện tượng khảm ở mức độ cao. Tuy nhiớn kớch thước của gen chuyển bị giơớ hạn vă cõc trỡnh tự của virus cú thể lăm nhiễu sự biểu hiện của gen chuyển. Sự đớnh cõc bản sao đơn của gen chuyển nằm bớn cạnh DNA của virus cú thể lă cú lợi nếu cú yớu cầu tõch dũng cõc locus đớnh văo.
Trong những năm gần đđy, một số kỹ thuật tạo động vật chuyển gen khõc đờ được cụng bố: phương phõp chuyển gen bằng cõch sử dụng tế băo gốc phụi (Grossler,1986), phương phõp chuyển cõc đoạn nhiễm sắc thể nguyớn (vớ dụ như chuột “transomic“, Richa vă Lo, 1988), chuyển gen trực tiếp văo tinh trựng kết hợp với thụ tinh in vitro (Lavitrano, 1989). Tuy nhiớn, phương phõp vi tiớm DNA văo tiền nhđn của hợp tử lă phương phõp cú hiệu quả nhất, được sử dụng rộng rời nhất để tạo động vật chuyển gen. Sử dụng phương phõp năy, cõc gen chuyển cú chiều dăi trớn 50 kb của virus, sinh vật tiền nhđn, thực vật, động vật khụng xương sống hoặc động vật cú xương sống cú thể được chuyển văo genome của động vật cú vỳ vă chỳng cú thể được biểu hiện ở cả tế băo sinh dưỡng vă tế băo sinh sản.