Trớn cơ sở cụng nghệ DNA tõi tổ hợp, ngănh chăn nuụi đang đứng trước những cơ hội thay đổi cú tớnh cõch mạng. Ngăy nay người ta cú thể tạo ra những động vật mang cõc đặc tớnh kỳ diệu mă bằng phương phõp lai tạo bỡnh thường khụng thể thực hiện được. Cụng nghệ tạo động vật chuyển gen lă một quõ trỡnh phức tạp vă ở những loăi khõc nhau cú thể khõc nhau ớt nhiều nhưng nội dung cơ bản gồm cõc bước chớnh sau: tõch chiết, phđn lập gen mong muốn vă tạo tổ hợp gen biểu hiện trong tế băo động vật; tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen; biến nạp gen văo phụi động vật; nuụi cấy phụi vă cấy truyền hợp tử (đối với động vật bậc cao); phđn tớch đõnh giõ tớnh ổn định vă sự biểu hiện của gen lạ vă tạo ra dũng động vật chuyển gen gốc một cõch liớn tục, sản xuất động vật chuyển gen.
Hỡnh 4.1: Sơ đồ tạo động vật chuyển gen
1. Tõch chiết, phđn lập gen mong muốn vă tạo tổ hợp gen biểu hiện trong tế băo động vật
1.1. Tõch chiết, phđn lập gen mong muốn
Một gen ngoại lai trước khi được chuyển văo genome của tế băo vật chủ để tạo ra động vật chuyển gen phải được phđn lập vă tinh chế hay núi cõch khõc lă nú phải được tạo dũng. Cõc cụng cụ sử dụng để tạo dũng bao gồm cõc enzyme đặc biệt cú hoạt tớnh cắt vă nối DNA (enzyme hạn chế vă ligase), cõc mẫu dũ (probe), vector vă tế băo vật chủ. Tế băo vật chủ thường được sử dụng lă tế băo vi khuẩn E.coli vă vector thường được sử dụng lă plasmid.
Việc tõch chiết một gen riớng lẻ lă rất phức tạp bởi vỡ DNA mẫu chứa hăng triệu gen. Do đú để thực hiện điều năy, DNA mẫu chứa gen mong muốn vă vector plasmid phải được cắt bởi cựng một loại enzyme hạn chế. Cõc đoạn DNA mẫu sau khi được cắt cú mang gen mong muốn sẽ được xen văo vector plasmid vă cõc đầu của cõc đoạn DNA mẫu năy vă cõc đầu của vector plasmid sẽ được nối với nhau nhờ ligase tạo thănh plasmid tõi tổ hợp. Sau đú cõc plasmid tõi tổ hợp được biến nạp văo cõc tế băo vi khuẩn E.coli vă cõc tế băo vi
khuẩn tiến hănh sinh trưởng. Văo thời điểm năy, cõc tế băo vi khuẩn chứa plasmid mang gen mong muốn sẽ được phõt hiện bằng mẫu dũ. Chỳng được nuụi cấy trong mụi trường thớch hợp để sinh trưởng phõt triển tạo ra hăng triệu bản sao của vector chứa gen năy. Vector chứa gen năy sẽ được tõch ra khỏi tế băo vi khuẩn vă gen mong muốn sẽ được tõch chiết. Phương phõp năy cú thể tạo ra hăng triệu bản sao của gen mong muốn mă khụng bị nhiễm bởi cõc gen khõc. Gen chuyển cú nguồn gốc từ genome năy chứa cõc đoạn exon mờ hoõ vă cõc đoạn intron khụng mờ hoõ (Hỡnh 4.2).
Người ta cũng cú thể phđn lập được gen mong muốn từ sản phẩm biểu hiện của nú như mRNA hoặc protein. Từ mRNA dưới tõc động của enzyme sao chĩp ngược sẽ tổng hợp ra DNA bổ sung mạch đơn (single strand complement DNA-ss cDNA), tiếp theo lă DNA bổ sung mạch kĩp (double strand complement DNA- ds cDNA). DNA bổ sung (complement DNA- cDNA) năy khõc với DNA gốc lă khụng chứa cõc intron mă chỉ bao gồm cõc exon (Hỡnh 4.2). Hoặc từ sản phẩm protein, cú thể suy ra trỡnh tự nucleotid của gen cấu trỳc trớn cơ sở trỡnh tự cõc axit amin trong phđn tử protein. Sau đú cú thể thiết kế cặp mồi (primer) để dũ tỡm đoạn gen mong muốn.
Hỡnh 4.2: So sõnh hai dạng gen chuyển
Dạng genome bao gồm tất cả cõc đoạn exon vă intron xuất hiện một cõch tự nhiớn. Cõc đoạn intron liớn quan đến việc cắt ghĩp mRNA vă biểu hiện của gen. Dạng cDNA lă một trỡnh tự chỉ bao gồm cõc đoạn exon mờ hoõ protein của gen.
1. 2. Tạo tổ hợp gen chuyển biểu hiện trong tế băo động vật
éể tạo tổ hợp gen chuyển biểu hiện trong tế băo động vật, cõc vựng chức năng khõc nhau của gen cú nguồn gốc từ cõc loăi khõc
nhau cú thể được kết hợp lại với nhau trong ống nghiệm bằng cõch sử dụng enzyme hạn chế vă ligase. Tất cả cõc thănh phần của gen cú thể được tõch chiết vă tõi tổ hợp để tạo thănh một cấu trỳc gen chuyển biểu hiện (Hỡnh 4.3).
Ở cõc đầu của cấu trỳc đầy đủ năy cú thể được sửa đổi bằng cõch bổ sung cõc trỡnh tự polylinker chứa một số vị trớ nhận biết cõc enzyme hạn chế khõc nhau. Trỡnh tự polylinker cho phĩp cú thể xen văo cấu trỳc năy một vector để kiểm tra vă tạo dũng.
Hỡnh 4.3: Sơ đồ cấu trỳc gen chuyển biểu hiện
enhancer: gen tăng cường ATG: vị trớ khởi đầu phiớn mờ
SIG: trỡnh tự tớn hiệu AAA: đuụi polyA
Gen chuyển được đi kỉm với cõc trỡnh tự khụng mờ hoõ cú vai trũ điều hoă sự biểu hiện của gen. Cõc yếu tố điều hoă cũng cú thể nằm ở trong đoạn intron. Yếu tố điều hoă ở gần đầu 5’ của gen lă promoter, cú vai trũ quyết định trong việc điều hoă sự biểu hiện của gen. Sự biểu hiện của gen cú thể xảy ra trong tất cả cõc mụ của cơ thể (khụng đặc hiệu) hoặc chỉ ở cõc mụ đặc biệt. Hay núi cõch khõc gen cấu trỳc muốn hoạt động để biểu hiện ra protein mă nú qui định trong hệ thống tế băo nhất định thỡ phải cú promoter thớch hợp với hệ thống mă nú hoạt động. Promoter ở tế băo động vật cú nguồn gốc hoặc từ động vật như methallothionein (MT), thymidine kinase, ò- actin, amylase, insulin, ò-lactoglobulin, adiposite P2 ... hoặc từ virus động vật như Simian virus (SV40), Rous sarcoma virus (RSV)...
Một yếu tố điều hoă khõc lă yếu tố tăng cường (enhancer), cú chức năng tăng cường sự biểu hiện của gen, khụng phụ thuộc văo vị trớ vă sự định hướng đối với gen. Cõc yếu tố tăng cường xuất hiện cú tương quan với cõc trỡnh tự quõ mẫn cảm với Dnase vă ở cõch gen một đoạn khoảng văi kilobase. éầu 3’ của gen cũng phải mang một trỡnh tự poly-A để đảm bảo thớch hợp cho quõ trỡnh phiớn mờ vă dịch mờ.
2. Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen
Ở động vật cú vỳ thỡ giai đoạn biến nạp gen thớch hợp nhất lă trứng ở giai đoạn tiền nhđn (pronucleus), giai đoạn mă nhđn của tinh trựng vă trứng chưa dung hợp (fusion) với nhau. Ở giai đoạn năy tổ hợp gen lạ cú cơ hội xđm nhập văo genome của động vật nhờ sự tõi tổ hợp DNA của tinh trựng vă của trứng. Do tế băo phụi chưa phđn chia vă phđn hoõ nớn tổ hợp gen lạ được biến nạp văo giai đoạn năy sẽ cú mặt ở tất cả cõc tế băo kể cả tế băo sinh sản của động vật trưởng thănh sau năy.
éối với động vật cú vỳ, trứng chớn được thu nhận bằng phương phõp sử dụng kớch dục tố theo chương trỡnh đờ được xđy dựng cho mỗi loăi hoặc bằng phương phõp nuụi cấy trứng trong ống nghiệm. Sau đú thụ tinh nhđn tạo để tạo ra trứng tiền nhđn.
Cõc phương phõp sử dụng hiện nay để chuyển gen văo tế băo chủ núi chung lă hiệu quả khụng cao. éể tạo ra một động vật chuyển gen, yớu cầu cần phải sử dụng hăng trăm thậm chớ hăng ngăn trứng thụ tinh. Ở bũ để đạt được một lượng phụi lớn như thế, nú phải được kớch thớch để rụng một lượng lớn trứng (siớu rụng trứng) thănh thục vă được thụ tinh nhđn tạo. Sự hiểu biết về sự kiểm soõt chức năng buồng trứng tăng lớn đang cải tiến hiệu quả để cú đủ số lượng trứng thụ tinh. Việc kớch thớch gđy siớu rụng trứng đũi hỏi sự hiểu biết một cõch chi tiết cõc yếu tố hormone kiểm soõt sự phõt triển của trứng ở trong buồng trứng. Quõ trỡnh phõt triển của trứng đờ được nghiớn cứu mạnh mẽ vă đờ đạt được một số kết quả trong những năm qua. Cõc nghiớn cứu đờ tập trung khảo sõt cõc cơ chế cơ bản kiểm soõt sự sinh trưởng vă thănh thục của trứng vă chức năng của thể văng. Chỳng mở đường cho sự phõt triển cõc phương phõp điều hoă chu trỡnh động dục để gđy siớu rụng trứng một cõch tỉ mỉ vă chớnh xõc hơn.
Cú lẽ sự phõt triển quan trọng nhất trong sinh lý học buồng trứng trong những năm mới đđy lă sự khõm phõ ra hormone inhibin. Inhibin lă hormone ức chế sự rụng trứng, nú lăm giảm tỉ lệ rụng trứng. Một văi giống động vật cú tốc độ rụng trứng cao hiếm thấy như dũng Booroola của cừu Merino ở Úc cú mức inhibin trong mõu thấp. Trđu bũ miễn dịch với inhibin cú mức inhibin trong mõu thấp
vă tăng tỉ lệ rụng trứng. Cõc gen kiểm tra sự sản xuất inhibin đờ được tạo dũng vă khả năng tạo ra động vật chuyển gen mă trong đú cõc gen năy bị ức chế hoặc bị loại bỏ lă hoăn toăn cú thể.
Một quõ trỡnh nghiớn cứu khõc cũng đờ được thực hiện để tỡm hiểu cõc cơ chế kiểm soõt điều hoă chức năng của thể văng vă sự sản xuất hormone progesterone của nú. Hormone năy điều hoă thời gian chu kỳ động dục vă giỳp duy trỡ sự thụ thai. Sự hiểu biết năy mở đường cho sự phõt triển cõc phương phõp điều hoă chu kỳ động dục cho khớp với con mẹ thay thế vă gđy siớu rụng trứng. Sự xử lý gđy siớu rụng trứng được bắt đầu khi hai buồng trứng chịu ảnh hưởng của progesterone. Hiện nay cõc xử lý gđy siớu rụng trứng sử dụng cõc hormone cú độ tinh khiết cao đựơc sản xuất bằng kỹ thuật DNA tõi tổ hợp vă đờ tạo ra trung bỡnh khoảng 10 trứng cú thể phõt triển đối với một lần xử lý (trong khi đú một con bũ bỡnh thường mỗi lần rụng trứng tạo ra 1 trứng cú thể phõt triển). Khi sự hiểu biết mới về cõc yếu tố kiểm soõt sự phõt triển của trứng vă hoạt động chức năng của thể văng được õp dụng, số lượng phụi cú thể phõt triển tạo ra sau một lần xử lý sẽ tăng lớn như mong muốn.
Sự thănh thục vă thụ tinh nhđn tạo của trứng đờ tăng lớn nhờ sự gđy siớu rụng trứng, cung cấp một phương tiện khắc phục vấn đề sinh sản ớt hiệu quả của vật nuụi. Thụng thường một buồng trứng bũ chứa khoảng 50.000 trứng chưa thănh thục. Tuy nhiớn, trung bỡnh chỉ 3-4 trong số trứng năy sẽ cú kết quả trong việc sinh sản ra cõc bớ con trong suốt thời gian sống của một bũ mẹ. Sự sử dụng cõc phương phõp gđy siớu rụng trứng hiện nay, từ một con bũ đờ xử lý cú thể thu nhận được 10 trứng cú thể phõt triển vă một nửa số trứng năy phõt triển thănh phụi thớch hợp cho chuyển gen. Kỹ thuật siớu rụng trứng cải tiến cú thể dẫn đến sự tăng số lượng trứng thớch hợp cho thụ tinh nhđn tạo. Như thế số con sinh ra từ một động vật cú thể hoăn toăn cao.
Sự thụ tinh nhđn tạo chỉ xảy ra khi một tinh trựng đờ chuẩn bị một cõch đặc biệt để xđm nhập văo tế băo trứng gặp một trứng ở trạng thõi thănh thục tối ưu.
éối với cõ, giai đoạn biến nạp thớch hợp lă phụi ở giai đoạn 1-4 tế băo. Giai đọan năy được tạo ra bằng thu nhận trứng, tinh dịch bằng phương phõp sử dụng kớch dục tố (kớch thớch tố trong nhau thai của người (HCG) hoặc nờo thuỳ thể cõ chĩp...), rồi thụ tinh nhđn tạo.
3. Chuyển gen văo động vật
Việc đạt được mục đớch của việc tạo ra động vật chuyển gen đũi hỏi sự phõt triển của cõc phương phõp cú hiệu quả để chuyển gen mong muốn văo phụi. Hiện nay cú nhiều phương phõp khõc chuyển gen nhau đang được sử dụng để tạo động vật chuyển gen: vi tiớm, chuyển gen bằng cõch sử dụng cõc tế băo gốc phụi, chuyển gen bằng cõch sử dụng vector virus...(xem chương 2).
4. Nuụi cấy phụi trong ống nghiệm (đối với động vật bậc cao)
Tế băo trứng tiền nhđn sau khi vi tiớm được nuụi cấy trong ống nghiệm để phõt triển đến giai đoạn phụi dđu (morula) hoặc tỳi phụi (blastocyst). Ở giai đoạn năy măng trong (pellucida) bị bong ra vă phụi cú thể lăm tổ được ở dạ con. Những phụi năy được cấy chuyển văo con nhận đờ được gđy chửa giả (pseudopregnant) để phõt triển thănh cõ thể con.
éối với động vật bậc thấp như cõ khụng cần giai đoạn năy. Tuy nhiớn ở cõ, trứng sau khi thụ tinh măng thứ cấp (chorion) dăy lớn, rất dai vă dớnh gđy trở ngại cho việc định vị chớnh xõc mũi kim tiớm văo vị trớ mong muốn để cú thể đưa được DNA văo trứng (Hỡnh 4.4A). Mặt khõc giai đoạn phụi một tế băo ở cõ rất ngắn trong khi đú việc vi tiớm đũi hỏi nhiều thao tõc tỉ mỉ vă chớnh xõc. éể khắc phục cõc nhược điểm năy, người ta cú thể tiến hănh loại măng thứ cấp (Hỡnh 4.4B), kĩo dăi giai đoạn phụi 1-4 tế băo vă ấp nhđn tạo phụi trần để tạo cõ bột.
A B
Hỡnh 4.3: Trứng cõ chạch (Misgurnus anguillicaudatus) trước vă sau khi khử măng thứ cấp (chorion)
A. Trứng cõ chạch chưa khử măng thứ cấp
B. Trứng cõ chạch đờ được khử măng thứ cấp
5. Kiểm tra động vật được sinh ra từ phụi chuyển gen
éể khẳng định động vật cú được chuyển gen lạ văo hay khụng, người ta phải kiểm tra xem gen lạ cú xđm nhập được văo bộ mõy di truyền của động vật trưởng thănh hay khụng vă sản phẩm của gen lạ cú được tổng hợp ra hay khụng.
éối với vấn đề thứ nhất người ta sử dụng phương phõp lai phđn tử trớn pha rắn (Southern blot, Northern blot...) hoặc PCR.
éối với vấn đề thứ hai, sản phẩm của gen lạ được đõnh giõ ở hai mức độ: phiớn mờ vă dịch mờ. Sản phẩm phiớn mờ được đõnh giõ bằng phương phõp RT-PCR, sản phẩm dịch mờ được đõnh giõ bằng phương phõp Western blot, ELISA hoặc kỹ thuật miễn dịch phúng xạ (RIA) để phõt hiện protein lạ trong động vật.
Theo dừi cõc thế hệ sau của động vật chuyển gen (F1, F2, F3, ...) để xõc định gen lạ cú di truyền hay khụng.
6. Tạo nguồn động vật chuyển gen một cõch liớn tục
Sau khi kiểm tra thấy gen ngoại lai đờ được di truyền ổn định, tiến hănh lai tạo vă chọn lọc để tạo dũng động vật chuyển gen.