trựng
1. Chuyển gen văo tinh trựng
Tinh trựng trưởng thănh cú genome bất hoạt khụng cú khả năng tõi bản. DNA của nú được bao phủ bởi protamine lăm cho DNA ngoại lai rất khú đi văo trong genome tinh trựng. Vỡ vậy DNA ngoại lai khụng cú cơ hội để hợp nhất văo DNA tinh trựng.
Cõc thớ nghiệm thực hiện cõch đđy khoảng gần một thập kỷ cho thấy rằng tinh trựng ủ với DNA cú thể mang DNA đến trứng trong quõ trỡnh thụ tinh dẫn đến kết quả lă tạo ra chuột chuyển gen. Cõc nghiớn cứu húa sinh học cho thấy DNA bõm văo tinh trựng một cõch dễ dăng nhưng khụng chứng minh được rằng điều năy xảy ra do sự xđm nhập của DNA. Vỡ thế tinh trựng đúng vai trũ lă một thể truyền đối với DNA ngoại lai.
Sau một văi năm, phương phõp năy được õp dụng rộng rời với bũ, lợn, cừu vă cõ medaka (Hỡnh 2.24). Trong tất cả cõc trường hợp năy khụng hiểu tại sao cõc thớ nghiệm rất khú thănh cụng. Hơn nữa, phần lớn cõc trường hợp, DNA ngoại lai hợp nhất văo genome vật chủ đờ được sắp xếp lại ở mức độ cao. Một nghiớn cứu đờ cho thấy rằng ngay cả sau khi đờ rửa cẩn thận, tinh trựng chứa DNAse đờ phđn hủy DNA ngoại lai. DNAse cú rất nhiều trong nguyớn sinh chất của tinh trựng vă lượng enzyme năy bõm văo tinh trựng lă thay đổi đờ giải thớch tại sao thớ nghiệm năy khụng thănh cụng vă tại sao DNA ngoại lai bị phđn cắt. DNA ngoại sinh dường như gđy ra hoạt tớnh DNAse ở tinh trựng đờ tõch chiết ra. Cú thể giải thớch hiện tượng năy lă DNAse một phương tiện để bảo vệ tinh trựng trõnh khỏi sự nhiễm DNA ngoại sinh trớn đường từ măo tinh hoăn đến tế băo trứng (Baccetti vă Spadafora, 2000).
Cõc thử nghiệm để tăng DNA xđm nhập văo tinh trựng đờ được thực hiện. Sự xung điện hoặc chuyển nhiễm với cõc tõc nhđn húa học đờ lăm tăng sự hấp thu DNA văo tinh trựng. Hiện tượng năy thường được kỉm theo do khả năng thụ tinh cho băo trứng của tinh trựng.
Ở Xenopus, chuyển gen văo phụi bằng vi tiớm dẫn đến sự biểu hiện của gen ngoại lai vă nú tồn tại từ văi ngăy đến văi tuần nhưng lại khụng hợp nhất văo genome vật chủ. éể khắc phục khú
Hỡnh 2.24: Chuyển gen văo tinh trựng
A.Tinh trựng đờ rửa ủ với DNA được sử dụng để thụ tinh in vivo hoặc in vitro. Phương phõp năy khụng cú hiệu quả đặc hiệu đối với việc tạo động vật chuyển gen vă cõc gen đờ hợp nhất thường bất hoạt do sự sắp xếp lại DNA
B.Măng tinh trựng bị tổn thương bởi chất tẩy nhẹ. DNA ngoại lai đi văo tinh trựng một cõch tự do. Cõc tinh trựng năy được sử dụng để thụ tinh in vitro bằng phương phõp ICSI
khăn năy, cõc nhă nghiớn cứu đờ sử dụng tinh trựng lăm thể mang (carrier). Protocol đờ được xõc định sớm hơn cho động vật cú vỳ đờ chứng tỏ khụng hiệu quả ở Xeponus. éể tăng khả năng hấp thu DNA, tinh trựng được xử lý với Triton, một chất tẩy nhẹ. éiều năy dẫn đến sự khụng ổn định của măng tinh trựng lăm cho DNA tự do đi văo tinh trựng. Kết quả tương tự cũng đạt được khi lăm lạnh vă ấm tinh trựng. Chromatin đờ bị phđn hủy do enzyme hạn chế nhận biết một văi vị trớ ở chromatin của tinh trựng nhưng đối với DNA ngoại lai thỡ khụng xảy ra. éiều năy gđy ra cơ chế sửa chữa vă lăm tăng cơ hội hợp nhất DNA ngoại lai văo genome của phụi. Phương
phõp năy cú tớn gọi lă REMI (restriction enzyme mediated intergration=sự hợp nhất qua trung gian ezyme hạn chế), một phương phõp lăm tăng sự biến nạp của tế băo. Sau cõc xử lý năy, tinh trựng mất khả năng thụ tinh cho trứng. Tiớm trực tiếp tinh trựng văo trứng (intra-cytoplasmic sperm ịnjection=ICSI) được sử dụng đối với sự thụ tinh in vitro ở người. Phương phõp năy đờ được õp dụng cho Xeponus vă đờ tạo ra Xeponus chuyển gen với kết quả cú thể chấp nhận (Hỡnh 2.12B). éặc biệt hiện nay cõc nhă sinh học đờ ứng dụng chuyển gen văo loăi năy để nghiớn cứu sự phõt triển (Marrsh-Arrmstrong, 1999; Perrny, 2001).
Phương phõp năy, trước tiớn được sử dụng cho Xeponus, đờ chứng tỏ thănh cụng ở chuột. Tuy nhiớn nú khụng cho kết quả cao hơn phương phõp vi tiớm văo tiền nhđn lă một phương phõp đơn giản hơn nhiều. Phương phõp ISCI đờ được sử dụng thănh cụng hoăn toăn ở chuột khi chuyển cõc đoạn DNA dăi được thiết kế trong cõc vector BAC vă YAC (Perry, 2001). Vỡ vậy phương phõp năy cú thể được õp dụng rộng rời đối với cõc loăi khõc kể cả gia sỳc lớn. Hiện nay hạn chế của việc sử dụng ICSI ở cõc loăi năy lă khú khăn. Dường như lă khụng thể õp dụng với cõc loăi khụng thuộc bộ Linh trưởng mă việc chuyển gen lă khú khi sử dụng cõc phương phõp khõc.
Gần đđy, một phương phõp tuyệt vời đờ được đề xuất (Qian, 2001). DNA bõm văo khõng thể đơn dũng nhận biết một protein trớn bề mặt tinh trựng hỡnh thănh nớn một phức hợp ổn định với tinh trựng. Phương phõp năy đờ được sử dụng để thụ tinh in vitro ở chuột, gă bằng thụ tinh nhđn tạo vă lợn bằng cõch tiớm văo sừng tử cung. Trong ba trường hợp năy, khoảng 30% cõ thể con sinh ra lă động vật chuyển gen. Gen chuyển đờ khụng bị sắp xếp lại. Nú đờ biểu hiện vă truyền lại cho thế hệ sau. éiều quan tđm lă khõng thể đơn dũng giống nhau nhận biết tinh trựng của động vật cú xương sống thấp hơn vă cao hơn kể cả con người. Phương phõp năy cú thể được dựng để tạo Linh trưởng chuyển gen.
2. Chuyển gen văo tiền thể tinh trựng in vitro
Tinh trựng thănh thục được tạo ra từ cõc tế băo gốc thụng qua cõc giai đoạn khõc nhau của sự biệt húa (Hỡnh 2.25). Cõc tế băo gốc
tinh trựng cú thể được tõch chiết, nuụi cấy in vitro trong một thời gian ngắn vă được cấy chuyển văo tinh hoăn nhận. Cõc tế băo cấy chuyển năy hoạt động theo chương trỡnh biệt húa của chỳng lăm cho tinh trựng hoạt động chức năng. Tỉ lệ tinh trựng tạo thănh từ cõc tế băo gốc cấy chuyển được tăng lớn nhiều nhờ sự xử lý cõc con đực nhận với bisulfan. Bisulfan lă một loại thuốc ngăn cản sự biệt húa của tế băo gốc tinh hoăn. Protocol năy đờ được sử dụng một cõch thănh cụng để chuyển gen văo tế băo gốc trong quõ trỡnh nuụi cấy. éiều năy đạt được nhờ sử dụng vector retrovirus hiệu quả. Cõc tế băo gốc cấy chuyển văo con đực nhận đờ xử lý bisulfan dẫn đến kết
Hỡnh 2.25: Sử dụng cõc tế băo tiền thể của tinh trựng để chuyển gen
A. Cõc bước khõc nhau của sự biệt húa tế băo gốc thănh tinh trựng
B.Cõc tế băo gốc hoặc cõc tế băo đờ biệt húa một cõch cục bộ được tõch chiết, nuụi cấy vă chuyển DNA chọn lọc văo. Tinh trựng mang DNA ngoại lai năy được sử dụng để thụ tinh bằng phương phõp ICSC
C.Tế băo gốc được tõch chiết, nuụi cấy dưới những điều kiện ngăn cản sự biệt húa của chỳng, được chuyển DNA ngoại lai văo, được
chọn lọc vă đưa văo lại một tinh hoăn nhận, nơi mă chỳng biệt húa. Tinh trựng tạo ra được sử dụng để thụ tinh trứng bằng phương phõp thụng thường
quả lă tạo ra chuột chuyển gen với tỉ lệ cao, khoảng 4%(Nagano, 2001). Phương phõp năy lă hữu dụng để nghiớn cứu ảnh hưởng sinh học của gen trong quõ trỡnh thănh thục tế băo gốc tinh trựng vă để tạo động vật chuyển gen. Cú thể suy ra phương phõp năy ớt thănh cụng hơn đối với cõc loăi lớn hơn chuột. Dường như cần thiết phải sử dụng cõc tế băo đờ được biến nạp cao hơn để tăng cơ hội định cư ở tinh hoăn với một tỉ lệ chấp nhận được.
2.2. Chuyển gen văo tiền thể của tinh trựng in vivo
DNA liớn kết với thể chuyển nhiễm cú thể được tiớm văo cõc ống sinh tinh (Hỡnh 2.26). Một số nhúm nghiớn cứu đờ thănh cụng trong việc tạo chuột chuyển gen bằng cõch sử dụng tinh trựng của cõc động vật đờ được xử lý (Sato, 2002). Những kết quả khớch lệ năy cú hiệu quả vừa phải vă hờy cũn chưa đạt chuẩn. Hiện chỳng đang được cải tiến nhưng chắc chắn lă chưa cú cõch năo lăm cho cú thể õp dụng rộng rời phương phõp năy đối với cõc động vật lớn hơn chuột. Quả thực cấu trỳc của cõc ống dẫn tinh khõc nhau vă việc tiớm DNA lă khú. Mặt khõc, lượng DNA tiớm văo cú thể lă rất lớn vă khú điều khiển.
DNA bỡnh thường hoặc DNA bõm văo thể chuyển nhiễm được tiớm trực tiếp văo cõc ống sinh tinh. Cõc tế băo đờ hợp nhất DNA ngoại lai sẽ tạo ra động vật chuyển gen sau khi thụ tinh bỡnh thường
Một điểm khõc cũng cần được nghiớn cứu. éú lă ở chuột, gen chuyển văo tiền thể của tinh trựng in vivo xảy ra một cõch độc lập trong cõc tế băo khõc nhau dẫn đến tạo ra cõc động vật sơ sinh cú sự hợp nhất khõc nhau. éđy lă một thuận lợi vỡ sự hợp nhất khõc nhau cú thể cho cõc kiểu hỡnh hơi khõc biệt. Với phương phõp năy, cõc nhă nghiớn cứu cú thể đõnh giõ cõc dũng động vật chuyển gen phức tạp từ một thớ nghiệm đơn giản.