Sự thănh cụng đầu tiớn trong nghiớn cứu tạo chuột chuyển gen bằng phương phõp vi tiớm văo tiền nhđn đờ được cụng bố văo năm 1980 (Gordon, 1980). Mặc dầu cấu trỳc tổ hợp gen chuyển được chứng minh lă đờ tớch hợp văo genome của chuột, nú đờ được sắp xếp lại nhưng gen ngoại lai khụng được biểu hiện. Cõc cụng bố tiếp theo (Brister, 1981; Costantini vă Lacy; 1981) chứng minh rằng với phương phõp vi tiớm, cõc gen chuyển đờ tớch hợp vă cú khả năng biểu hiện. Văo năm 1982, lần đầu tiớn sự thay đổi kiểu hỡnh cú thể nhỡn thấy ở chuột nhắt chuyển gen đờ được mụ tả (Palmiter, 1982). éđy lă kết quả biểu hiện của gen hormon sinh trưởng chuột cống ở chuột nhắt. Từ đú đến nay đờ cú rất nhiều cõc cụng trỡnh về chuyển gen, trong đú phần lớn lă cõc nghiớn cứu hiệu quả của gen vi tiớm với sự sinh trưởng của động vật cú vỳ vă bệnh học.
Nguyớn tắc của phương phõp vi tiớm lă một lượng nhỏ DNA được tiớm trực tiếp văo nhđn tế băo phụi trần hoặc tế băo nguyớn vẹn một cõch cơ học dưới kớnh hiển vi. Phương phõp năy cho phĩp đưa gen văo đỳng vị trớ mong muốn ở từng tế băo với hiệu quả tương đối cao.Tuy nhiớn do đũi hỏi phải tinh vi, tỉ mỉ vă cực kỳ chớnh xõc nớn hạn chế số lượng tế băo vi tiớm vă ngoăi ra cũn cú thể lăm tổn thương đến tế băo phụi do tõc nhđn cơ học gđy ra khi tiến hănh vi tiớm.
éể biến nạp gen văo tế băo bằng phương phõp vi tiớm trước hết phải chế tạo kim tiớm vă kim giữ. Kim được tạo ra từ những ống thuỷ tinh dẻo capillar đường kớnh 0,1-1,5 mm cú sợi bằng wolfram mảnh ở trong nhờ hệ thống thiết bị lăm kim. Hệ thống năy gồm cú mõy kĩo kim tự động (pipette puller), mõy măi kim vă mõy gia cố kim.
Hỡnh 2.7: Vi tiớm gen ngoại lai văo tiền nhđn của trứng thụ tinh
éể tạo kim tiớm trước hết phải tạo ra đầu kim nhọn nhờ mõy kĩo kim. Sau đú sử dụng mõy gia cố để cắt đầu nhọn của ống capillar sau khi kĩo tạo ra mũi kim tiớm cú đường kớnh thớch hợp. éường kớnh bớn trong mũi kim tiớm tuỳ thuộc văo loại tế băo chuyển gen. éối với trứng tiền nhđn động vật cú vỳ cú đường kớnh khoảng 70 àm thỡ đường kớnh của kim tiớm khoảng 0,75 àm lă thớch hợp, đối với phụi cõ một tế băo đường kớnh của kim tiớm lă khoảng 3-4 àm. Cuối cựng đưa kim lớn mõy măi để lăm sắc nhọn vă trơn lõng đầu kim (Hỡnh 2.8).
Kim giữ được chế tạo từ những ống capillar cú đầu nhẵn bỡnh thường để cố định trứng trong quõ trỡnh vi tiớm. éể tạo kim giữ, dựng mõy kĩo kim tự động để tạo ra đầu kim nhỏ sau đú dựng bỳt kim cương hoặc sợi platin đốt núng cắt bớt đầu nhọn để tạo ra đầu kim với đường kớnh thớch hợp. Lăm nhẵn đầu kim giữ bằng cõch để đứng kim năy ngay trớn mặt đoạn cong platin của mõy gia cố. éốt núng sợi platin vă điều chỉnh đầu kim giữ cho nú chảy từ từ. Quan sõt dưới kớnh hiển vi vă dừng lại khi đầu kim đờ đạt yớu cầu.
Vi tiớm được tiến hănh trớn hệ thống thiết bị vi tiớm (Hỡnh 2.9). Hệ thống năy gồm cú hai bộ phận chớnh lă kớnh hiển vi vă mõy vi thao tõc.
Hỡnh 2.8 : Cõc mõy lăm kim (Hờng Narishige)
1. Mõy gia cố kim Microforge 2. Mõy măi kim
3. Mõy kĩo kim tự động Pipette Puller
Kớnh hiển vi dựng cho mục đớch năy lă kớnh hiển vi soi ngược (vật kớnh xoay ngược lớn). éộ phúng đại thớch hợp cho việc tiến hănh vi tiớm văo phụi cõ một tế băo lă khoảng từ 40-60 lần. Mõy vi thao tõc gồm 2 phần giống hệt nhau được bố trớ hai bớn kớnh hiển vi, một dựng để điều chỉnh kim tiớm, một dựng cho kim giữ. Tớnh năng của mõy năy lă cho phĩp điều chỉnh cõc kim theo khụng gian 3 chiều. Kim tiớm vă kim giữ được lắp văo mõy vi thao tõc vă được nối với syringe qua ống bằng chất dẻo được nạp đầy dầu parafin.
Chuẩn bị dung dịch gen chuyển: gen chuyển được xen văo trong một vector plasmid vă tạo dũng trong E.coli. Cõc vi khuẩn biến nạp mang plasmid tõi tổ hợp được phõt hiện trong mụi trường
nuụi cấy cú thuốc khõng sinh do plasmid mang cõc gen khõng thuốc đặc hiệu. Cõc vi khuẩn sống sút được sinh trưởng trong mụi trường dinh dưỡng thớch hợp vă plasmid tõi tổ hợp mang gen chuyển sẽ được sao chĩp mỗi khi tế băo vi khuẩn phđn chia. Sau đú, hăng triệu bản sao của plasmid tõi tổ hợp mang gen chuyển được tõch chiết từ cõc tế băo vi khuẩn năy vă cõc đoạn gen chuyển được tõch ra từ plasmid tõi tổ hợp nhờ sử dụng enzym hạn chế. éể
Hỡnh 2.9: Mõy vi thao tõc Olympus (Hờng Narishige)
1. Kớnh hiển vi soi ngược 2. Mõy vi điều chỉnh
tinh sạch, gen chuyển được điện di trớn gel agarose. Hoă tan gen chuyển trong dung dịch đệm đặc trưng (như dung dịch Tris-EDTA; dung dịch TE...) vă tớnh nồng độ dung dịch gen chuyển nhờ quang phổ kế. Nồng độ dung dịch DNA sử dụng cho vi tiớm thường lă 1-5 àg/ml. Trước khi chuyển văo phụi, gen chuyển được kiểm tra sự biểu hiện trong cõc tế băo nuụi cấy bằng sự chuyển nhiễm (transfection).
Vi tiớm được tiến hănh qua cõc bước: nạp gen văo kim tiớm bằng phương phõp capillar (ngđm đầu kim tiớm văo dung dịch gen khoảng 10-12 giờ) hoặc bơm trực tiếp dung dịch gen văo, lắp kim tiớm vă kim giữ văo mõy vi thao tõc, chuyển trứng tiền nhđn văo đĩa
petri cú chứa mụi trường được đặt dưới kớnh hiển vi, giữ trứng tiền nhđn văo đầu kim giữ bằng lực hỳt của syringe, điều chỉnh kớnh hiển vi để xõc định đĩa phụi vă điều chỉnh mõy vi thao tõc để đưa kim tiớm văo vị trớ của trứng tiền nhđn, đẩy gen văo trứng tiền nhđn bằng cõch vặn nhẹ syringe. Khi thấy trứng tiền nhđn hơi phồng to vă trở nớn sõng hơn thỡ dừng lại vă kĩo nhanh kim tiớm ra. Trứng tiền nhđn sau khi tiớm được di chuyển xa đến cuối đĩa petri trước khi tiớm trứng tiền nhđn tiếp theo. Mỗi một nhúm trứng tiền nhđn đờ hoăn thănh được chuyển sang một đĩa mụi trường khõc để ấp vă đõnh giõ bằng mắt trong một văi tiếng. Sau đú tất cả cõc trứng tiền nhđn được nhỡn thấy rừ răng vă được chuyển văo ống dẫn trứng của con cõi nhận.
Cho đến nay, trong cõc kỹ thuật chuyển gen văo động vật thỡ phương phõp vi tiớm dung dịch DNA văo hợp tử lă phương phõp cú hiệu quả nhất trớn động vật cú vỳ vă hiện lă phương phõp chủ yếu được sử dụng để chuyển gen văo vật nuụi.
éối với thực vật thỡ phương phõp năy được sử dụng đối với cõc tế băo tiền phụi của hợp tử hoặc cõc tế băo tiền phụi của hạt phấn.
Tuy nhiớn sự xđm nhập của gen chuyển văo DNA tế băo vật chủ lă một quõ trỡnh ngẫu nhiớn vă xõc suất để gen chuyển xen văo vị trớ DNA vật chủ mă sẽ cho phĩp nú biểu hiện lă thấp. Hiệu quả của vi tiớm lă khụng cao (Bảng 2.1).
Bảng 2.1: Hiệu quả vi tiớm ở một số loăi động vật
(Hammer vă cộng sự, 1985) Loăi động vật Số lượng trứng được vi tiớm Số lượng con sinh ra từ trứng vi tiớm Số lượng con chuyển gen Thỏ 1907 218 (11,4%) 28 (1,5%) Cừu 1032 73 (7,1%) 1(0,1%) Lợn 2035 192 (9,4%) 20 (1%)
Hỡnh 2.10: Chuyển gen bằng vi tiớm V. Phương phõp chuyển gen nhờ vector virus
Văo năm 1974, lần đầu tiớn cõc nhă khoa học phõt hiện thấy rằng, sau khi tiớm DNA của retrovirus SV40 văo khoang phụi (blastocoel) của tỳi phụi chuột, DNA năy cú thể được tỡm thấy sau đú trong cõc tế băo của chuột trưởng thănh (Jaenisch,1974; Jaenisch vă Mintz,1974). DNA provirus Mo-Mulv sử dụng trong cõc thớ nghiệm như thế năy đờ tớch hợp văo genome vă truyền lại cho thế hệ
sau, do đú đờ tạo nớn cõc dũng chuột ổn định (Stuhlmann, Jahner vă Jaenisch,1981). Từ đú, việc sử dụng virus lăm vector cho cõc DNA ngoại lai đờ được phõt triển.
Phương phõp năy tuy thao tõc hơi phức tạp nhưng cú ưu điểm lă hiệu quả chuyển gen cao. Hơn nữa gen cấu trỳc gắn văo vector virus sẽ sử dụng promoter của virus, cõc promoter năy thường cú hoạt tớnh cao do đú gen cấu trỳc năy sẽ được biểu hiện mạnh trong tế băo chủ.
Về nguyớn tắc, bất kỳ loại virus năo cũng cú thể được sử dụng lăm vector để chuyển vật liệu di truyền văo trong tế băo. Nhiều nhúm trong số đú, cõc papovavirus, adenovirus, retrovirus...được sử dụng văo những mục đớch chuyớn biệt. éể sử dụng lăm vector, cõc phần khõc nhau của genome virus được thay thế bằng gen cấu trỳc quan tđm. Virus cú thể được sử dụng để lđy nhiễm văo tế băo giai đoạn sớm của phụi trước khi được chuyển ghĩp văo con mẹ. Gen chuyển với vector retrovirus xđm nhập một cõch hiệu quả văo hệ gen của vật chủ nhưng virus sử dụng phải lă virus an toăn, khụng gđy bệnh.
Cõc cơ thể chuyển gen sinh ra từ phương phõp năy lă ở dạng khảm, cú nghĩa lă khụng phải tất cả cõc tế băo của cơ thể đều mang retrovirus. Gen chuyển chỉ cú thể di truyền được nếu retrovirus hợp nhất văo một số tế băo sinh dục. éối với phương phõp năy tỉ lệ sống của cõc động vật chuyển gen sơ sinh lă rất thấp. Nếu như cõc thao tõc di truyền lă chuẩn xõc, khụng gđy ra sự sẩy thai, thỡ thế hệ động vật đầu tiớn (F1) cần kiểm tra sự biểu hiện của gen chuyển. Khi gen chuyển đờ hợp nhất trong cõc tế băo sinh dục thỡ được gọi lă thể khảm dũng mầm vă sau đú chỳng được lai cựng dũng khoảng 10-20 thế hệ cho đến khi thu được cõc động vật chuyển gen đồng hợp tử vă gen chuyển cú mặt ở trong tất cả mọi tế băo. Ở giai đoạn năy, phụi mang gen chuyển cú thể được đụng lạnh vă được bảo quản cho cõc quõ trỡnh cấy chuyển về sau.
Hỡnh 2.11: Chuyển gen nhờ vector lă virus