Phân lập vi khuẩn từ một số loại thực phẩm lên men chua (kim chi, nem chua, dưa cải muối chua, cà muối chua) trên môi trường chọn lọc MRS. Kết quả phân lập được 16 chủng vi khuẩn. Hình thái khuẩn lạc, tế bào được mô tả ở Bảng 3.1.
Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng vi khuẩn LB2
Hình 3.2: Hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng vi khuẩn LB4
Bảng 3.1: Một số đặc điểm hình thái của 16 chủng vi khuẩn phân lập được
Thời gian
phân lập Nguồn gốc
Kí hiệu
chủng Hình thái khuẩn lạc Hình thái tế bào
28/11/2012 Kim chi - M1 LB1
Vàng, tâm xậm màu,
tròn. Trực khuẩn
28/11/2012 Nem chua -M1 LB2 Nhỏ, tròn, trắng đục Trực khuẩn, kết chùm
28/11/2012 Nem chua –M2 LB3 Trắng trong, tròn, to Trực khuẩn
28/11/2012 Cà muối chua -
M1 LB4 Tròn, trắng sữa, trong Trực khuẩn, kết chùm
28/12/2012 Kim chi - M 2 LB5 Nhỏ, tròn, trắng sữa Trực khuẩn, đơn
28/12/2012 Nem chua – M3 LB6 Trắng đục, tròn lồi Hình cầu kết dạng chùm
28/12/2012 Kim chi - M1 LB7
Nhỏ, tròn, bóng, màu
trắng sữa Trực khuẩn, kết đôi
28/12/2012 Cà muối chua -
M2 LB8
Tròn, bề mặt khô,
nhăn Trực khuẩn kết chuỗi
18/12/2012 Kim chi - M3 LB9 Tròn, trơn bóng, trắng Cầu kết đôi
18/12/2012 Dưa cải muối -
M1 LB10
Nhỏ, tròn, trắng sữa, bóng
Trực khuẩn kết chuỗi, kết chùm
18/12/2012 Dưa cải muối -
M2 LB11 Trắng, bề mặt khô Cầu kết dạng chùm
18/12/2012 Cà muối chua -
M3 LB12 Trắng đục, trơn lồi Trực khuân
18/12/2012 Kim chi – M3 LB13 Tròn, trắng đục Trực khuẩn, đơn, kết
chùm
18/12/2012 Dưa cải - M2 LB14 Tròn, trắng đục, bóng Trực khuẩn
18/12/2012 Cà muối chua –
M3 LB15 Trắng trong, dẹt,tròn Trực khuẩn, tạo chuỗi
18/12/2012 Dưa cải - M3 LB16 Tròn, trắng đục, nhăn Cầu kết chùm
Khi phân lập vi khuẩn từ nguồn tôm thịt lên men chua sẽ thu được chủng vi khuẩn lactic có tính đặc hiệu cao, thích nghi với cơ chất nên phát triển nhanh và mạnh trong nguyên liệu đầu tôm. Tuy nhiên, trong đề tài này thực hiện phân lập từ thực phẩm lên men chua tự nhiên (kim chi, cà muối chua, dưa cải muối chua, nem chua) vì nguồn thực phẩm này chứa nhiều chủng vi khuẩn lactic đa dạng và phong phú [31]nên khi phân lập vi khuẩn lactic từ nguồn này có thể thu được nhiều chủng vi khuẩn để ứng dụng trong công đoạn lên men đầu tôm. Hơn nữa, trong nghiên cứu của Rao và
cộng sự đã sử dụng chủng vi khuẩn L. plantarum nguồn gốc từ nguyên liệu rau lên men
chua để ứng dụng cho lên men phế liệu tôm [81]. Do đó, có thể sử dụng chủng vi khuẩn phân lập từ nguồn rau lên men để lên men nguyên liệu đầu tôm.
Trong nghiên cứu phân lập vi khuẩn từ thực phẩm lên men này sử dụng 3 mẫu kim chi, 3 mẫu nem chua, 3 mẫu cà muối chua, 3 mẫu dưa cải muối chua. Vậy từ 12 mẫu thực phẩm lên men chua tự nhiên phân lập được 16 chủng vi khuẩn.
Kết quả ở Bảng 3.1 cho thấy, trong 16 chủng vi khuẩn đã phân lập có 5 chủng vi khuẩn phân lập từ nguồn kim chi chiếm 31%, 3 chủng từ nem chua chiếm 19%, 4 chủng từ dưa chua chiếm 25% và 4 chủng từ cà muối chua chiếm 25%. Bên cạnh đó, đã có nhiều nghiên cứu về lĩnh vực phân lập vi khuẩn từ các nguồn khác nhau như nghiên cứu của Đào Thị Lương và cộng sự phân lập vi khuẩn lactic từ 30 nguồn cỏ, ngô, dưa, cà muối chua, nước bún, kết quả đã phân lập được 134 chủng vi khuẩn trên môi trường
MRS, thời gian 48 h ở 30 oC [23] hay nghiên cứu của Hồ Diễm Thúy phân lập được 27
chủng vi khuẩn lactic từ các mẫu bã sắn ủ với các nguồn lên men lactic (nem chua, kim chi, tôm chua) và từ bã sắn ủ với kim chi đã phân lập được nhiều chủng vi khuẩn nhất, chiếm 37% [30]. Vậy từ các nguồn khác nhau ta có thể phân lập được nhiều chủng vi khuẩn và từ đó chọn lọc ra chủng vi khuẩn lactic cần thiết để ứng dụng cho các công trình nghiên cứu tiếp theo.
Theo Akhter chủng vi khuẩn lactic thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương [37] nên để chọn được chủng vi khuẩn lactic thì bước đầu 16 chủng vi khuẩn phân lập được nhuộm Gram. Kết quả nhuộm và hình ảnh Gram của một số chủng vi khuẩn được trình bày ở Bảng 3.2 dưới đây.
Bảng 3.2: Một số đặc tính sinh hóa của 16 chủng vi khuẩn Chủng vi khuẩn Hoạt tính catalase Nhuộm Gram Chủng vi khuẩn Hoạt tính
catalase Nhuộm Gram
LB1 + - LB9 - - LB2 - + LB10 + + LB3 - - LB11 - - LB4 - + LB12 - - LB5 - + LB13 + + LB6 + - LB14 - - LB7 - + LB15 - - LB8 - - LB16 - -
Kết quả ở Bảng 3.2 cho thấy, trong 16 chủng phân lập từ nguyên liệu lên men có 6 chủng vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương và 10 chủng thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm. Môi trường MRS là môi trường tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn lactic, tuy nhiên trong quá trình phân lập không tránh khỏi việc nhiễm vi sinh vật từ môi trường bên ngoài, những vi khuẩn này vẫn có khả năng phát triển trong môi trường MRS vì vậy những chủng phân lập được có thể thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương hoặc Gram âm.
Vi khuẩn Gram dương bắt màu tím sau khi được nhuộm Gram có thể giải thích là do cấu tạo của thành tế bào vi khuẩn bắt màu Gram dương gồm các thành phần peptidoglycan nhiều hơn ở thành tế bào vi khuẩn bắt màu Gram âm, nhưng thành phần lipid lại thấp hơn. Trong giai đoạn rửa cồn, lớp chất béo ở vi khuẩn Gram âm bị cồn hòa tan nên chất nhuộm ban đầu hòa tan vào dung môi. Ngược lại, vi khuẩn Gram dương chất nhuộm ban đầu bao bọc thành tế bào thành lớp dày và hợp chất violet – iodine không bị phai ra dung môi xung quanh do đó vi khuẩn Gram dương vẫn giữ được màu nhuộm ban đầu [4].
Bên cạnh đó, trong 6 chủng vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương thì vi khuẩn được phân lập từ nguồn kim chi chiếm 50% số lượng vi khuẩn được chọn vậy đây là nguồn thực phẩm lên men chua chiếm ưu thế trong quá trình phân lập.
a b Hình 3.4: Hình nhuộm Gram của một số chủng vi khuẩn
(a): chủng LB2; (b): chủng LB4
Ngoài ra, việc xác định các chủng vi khuẩn đã chọn có khả năng phát triển trong điều kiện kị khí và tạo ra acid là quan trọng vì vi khuẩn lactic thuộc nhóm vi khuẩn hô hấp yếm khí tùy ý và dựa vào lượng acid tổng số do vi khuẩn sinh ra trong môi trường MRS lỏng ta có thể đánh giá được khả năng lên men của những chủng vi khuẩn ở công đoạn sau này, việc tạo ra acid nhiều giúp cho công đoạn lên men đầu tôm diễn ra thuận lợi hơn vì làm giảm pH nên có thể khống chế quá trình thối do trực khuẩn butyric yếm khí gây ra [20]. Do đó, 6 chủng được nuôi trong môi trường MRS lỏng yếm khí, chọn những chủng có thể phát triển tạo sinh khối trong môi trường
không có khí oxy. Đánh giá khả năng phát triển của 6 chủng ta tiến hành đo OD600 sau
thời gian nuôi 24 giờ, tại nhiệt độ 37 oC, đồng thời đo lượng acid tổng số sinh ra theo
phương pháp Therner. Kết quả thu được trình bày ở Bảng 3.3.
Bảng 3.3: Giá trị OD600 của một số chủng vi khuẩn
Chủng LB2 LB4 LB5 LB7 LB10 LB13
OD600 0,919 0,873 1,016 1,024 0,927 1,105
Acid tổng số (g/l) 5,4 19,8 16,2 22,1 6,7 14,7
Từ Bảng 3.3 cho thấy, trong cùng một điều kiện môi trường yếm khí cả 6 chủng
vi khuẩn đều có khả năng phát triển tạo sinh khối, trong đó chủng LB13 có giá trị OD
cao nhất so với 5 chủng vi khuẩn còn lại. Tuy nhiên, kết quả đo hàm lượng acid tổng
số trong Bảng 3.3 cho thấy, khả năng tạo ra acid tổng số cao nhất là chủng LB7, lượng
Trong nghiên cứu của Bùi Thị Thu Huyền và cộng sự thì khả năng sinh acid trên môi trường MRS lỏng của 8 vi khuẩn phân lập từ các mẫu cỏ voi, thân cây ngô sau thu bắp được ủ chua đạt cao nhất là 23,4 g/l [17]. Kết quả trên so với kết quả được ghi nhận ở nghiên cứu của Bùi Thị Thu Huyền thì lượng acid tổng số thu được thấp hơn nhưng không đáng kể.
Các chủng trên có khả năng tạo ra acid trong môi trường nuôi cấy MRS lỏng
yếm khí, ở 37 oC nên có thể nghi ngờ 6 chủng vi khuẩn được chọn thuộc chủng vi
khuẩn lactic vì vậy sử dụng 6 chủng đã chọn thực hiện kiểm tra một số test sinh hóa
bao gồm: tạo sản phẩm indol trong môi trường SIM, sinh H2S trong môi trường SIM,
khử nitrat thành nitrit trong canh trường chứa nitrat [72].