a. Phương pháp phân tích (Phương pháp phân tích chi tiết đính kèm phụ lục): - Xác định hàm lượng khoáng, độ ẩm theo phương pháp chuẩn của AOAC [38]. - Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Kjeldahl [26].
- Định lượng acid lactic bằng phương pháp xác định hàm lượng acid toàn phần theo phương pháp Therner [56].
- Xác định hàm lượng carotenoid (chủ yếu astaxanthin) bằng phương pháp
quang phổ [81], [1]. [1]
- Xác định hàm lượng lipide tổng số theo phương pháp Folch [27].
- Kiểm tra khả năng sinh indol và sinh H2S [46] , khả năng khử nitrat thành
nitrit của vi khuẩn [48].
- Xác định số lượng vi sinh vật theo 10TCN 863:2006: Tiêu chuẩn vi sinh ”Thức ăn hỗn hợp cho gia súc, gia cầm”.
- Xác định màu sắc của cá Tứ Vân theo phương pháp so màu.
- Xác định tốc độ tăng trưởng về chiều dài và tốc độ tăng trưởng về khối lượng của cá Tứ Vân [19].
Sinh trưởng tuyệt đối về chiều dài (GRL): GRL = Lt – Lo trong đó Lt:Chiều
dài của cá tại thời điểm t (mm), Lo: chiều dài của cá tại thời điểm đầu (mm).
Sinh trưởng tuyệt đối về khối lượng (GRw): GRw = Wt – Wo trong đó Wt:
Khối lượng của cá tại thời điểm t (gram), Wo: Khối lượng tại thời điểm ban
đầu (gram).
- Hiệu suất thu hồi protein, astaxanthin được xác định theo công thức theo công thức của Dauphin [55] như sau:
Đánh giá cảm quan: Màu sắc, mùi, trạng thái, ... trong quá trình thí nghiệm và mẫu thu được sau lên men.
Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần, lấy giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD (độ lệch chuẩn) để báo cáo. Sự khác nhau có ý nghĩa về mặt thống kê thí nghiệm (p < 0,05) của các giá trị trung bình được phân tích bởi phương pháp phân tích phương sai một yếu tố bằng phần mềm SPSS 16 và phần mềm Microsoft Excel 2007.
b. Phương pháp phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic
Hình 2.1: Sơ đồ phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic
Thuyết minh sơ đồ: Sử dụng thực phẩm lên men tự nhiên như nem chua, nước dưa cải muối chua, nước kim chi, nước cà muối chua đê phân lập trên môi trường thạch MRS như sau:
Mẫu thực phẩm lên men chua được pha loãng bằng cách rót 9 ml dung dịch muối sinh lý được hấp khử trùng vào các ống nghiệm. Hút 1 ml dịch mẫu nước thực
phẩm lên men chua pha loãng với nồng độ 10-1, rồi đưa lên máy vortex để trộn đều.
Từ ống nghiệm 10-1. Pha loãng ra ống nghiệm có nồng độ thấp hơn 10-2 bằng
cách hút 1 ml từ ống nghiệm 10-1 cho vào 9 ml dung dịch muối sinh lý đã hấp khử
trùng ở ống nghiệm khác, rồi đưa lên máy vortex để trộn đều, thu được ống nghiệm có
độ pha loãng mẫu 10-2, tiếp tục làm tương tự, ta có các ống nghiệm có độ pha loãng
mẫu 10-3 đến 10-9.
Thực phẩm lên men chua tự nhiên
Phân lập trên môi trường MRS
Test hình thái
Test sinh hóa
Lựa chọn chủng vi khuẩn lactic
Đánh giá khả năng lên men trong nguyên liệu đầu tôm
Sau đó gieo cấy vi khuẩn lên môi trường thạch MRS. Dùng thạch MRS trong
bình tam giác đã đun nóng, làm nguội đến nhiệt độ khoảng 50 oC thì tiến hành đổ môi
trường vào các đĩa petri 1 lớp mỏng vừa phải, để thạch thật khô. Lấy ống nghiệm có mẫu pha loãng ở trên, mỗi ống lấy 0,1 ml mẫu cho vào các đĩa petri. Nhúng que trang
vào cồn 96o , hơ nóng trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội. Tiếp đến dùng que trang trang
đều dịch mẫu lên mặt thạch. Trước khi trang cần phải ghi rõ nồng độ pha loãng, mỗi nồng độ lặp lại 2 đĩa petri. Hơ và khử trùng que trang sau mỗi lần trang dịch, mọi thao tác đều tiến hành trong điều kiện vô trùng trong tủ cấy, bên ngọn lửa đèn cồn. Sau khi
trnag xong dùng giấy báo gói lại, lật ngược đĩa và nuôi trong tủ ấm 37 oC trong vòng
24 giờ đến 48 giờ thì tiến hành đếm, và quan sát hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào.
Sau khi nuôi vi khuẩn ở nhiệt độ 37 oC trong 24 – 48 giờ thì các khuẩn lạc xuất
hiện. Khuẩn lạc có đặc điểm hình tròn, bề mặt bóng, có nhiều dạng khác nhau, có mùi đặc trưng của acid lactic. Chọn khuẩn lạc có hình thái khác nhua trên môi trường MRS để đem đi cấy ria tạo khuẩn lạc thuần. Dùng que cấy ria thu sinh khối các khuẩn lạc đã chọn, cấy ria thành 3 đường trên đĩa thạch cho đến khi các khuẩn lạc thuần tạo ra. Sau
khi cấy, lật ngược đĩa thạch lại. Bao gói bằng giấy báo và nuôi trong tủ ấm ở 37 oC
trong vòng 24 giờ.
Tiến hành nhuộm Gram các chủng vi khuẩn đã phân lập thuần. Sau đó kiểm tra hoạt tính catalase. Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn hô hấp hiếu khí tùy tiện nên sau khi cấy các chủng phân lập được vào ống nghiệm chứa môi trường MRS lỏng thì đổ một lớp parafin lên phía trên, mục đích là để ngăn cách môi trường thạch với môi trường không khí xung quanh và sau thời gian nuôi 24 giờ tiến hành đo các mẫu ở bước sóng 600 nm để xác định giá trị OD, từ đó xác định được chủng vi khuẩn có thể hô hấp trong môi trường không có oxy. Chọn ra các chủng vi khuẩn thuộc nhóm
catalase âm tính, Gram+ và hô hấp hiếu khí tùy tiện để cấy vào trong môi trường ống
nghiệm chứa MRS lỏng, sau 24 giờ kiểm tra lượng acid lactic sinh ra trong thời gian nuôi và từ đó chọn ra chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh acid mạnh. Xác định lượng acid lactic sinh ra thông qua việc xác định acid tổng số. Bên cạnh đó, kiểm tra
tính sinh hóa của chủng vi khuẩn bao gồm kiểm tra khả năng tạo indol, tạo H2S và khử
nitrate thành nitrit trong điều kiện yếm khí.
Đánh giá khả năng lên men của những chủng vi khuẩn đã lựa chọn thông qua việc kiểm tra chất lượng dịch men đầu tôm: Sử dụng các chủng đã phân lập tiến hành tăng sinh khối trong ống nghiệm chứa môi trường MRS lỏng, thời gian 24 giờ tại nhiệt độ phòng. Sau thời gian tăng sinh khối đưa môi trường chứa các vi khuẩn về cùng một
mật độ vi khuẩn là 106 CFU/ml, sau đó bổ sung vào các mẻ đầu tôm khác nhau, điều chỉnh môi trường đầu tôm về pH thích hợp trước khi đưa vi khuẩn vào, thêm thành phần rỉ đường và muối NaCl làm nguồn thức ăn cho vi khuẩn, bên cạnh đó bổ sung kali sorbat và natri benzoat nhằm mục đích phòng thối cho các mẫu. Lên men trong thời gian 24 giờ, nhiệt độ thường. Sau khi lên men tiến hành kiểm tra hàm lượng astaxanthin, hàm lượng protein trong dịch và từ đó chọn ra chủng vi khuẩn thích hợp nhất để sử dụng vào việc lên men đầu tôm thẻ chân trắng.