Sử dụng chu kỳ tự nhiên, sử dụng aspirrin, dùng thuốc tránh thai khoảng 3 tháng trƣớc khi kích thích buồng trứng.Tuy nhiên các nghiên cứu chƣa nhiều, chủ yếu vẫn dựa vào kinh nghiệm của mỗi ngƣời.
CHƢƠNG 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu đƣợc tiến hành tại Trung tâm Hỗ trợ sinh sản - Bệnh viện Phụ sản Trung ƣơng từ tháng 1 năm 2012 đến tháng 6 năm 2013.
2.2. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Bao gồm những bệnh nhân làm thụ tinh trong ống nghiệm tại Trung tâm hỗ trợ sinh sản, Bệnh viện Phụ sản Trung ƣơng trong thời gian nghiên cứu, phù hợp với tiêu chuẩn lựa chọn và tiêu chuẩn loại trừ dƣới đây và đồng thuận tham gia vào nghiên cứu.
* Tiêu chuẩn lựa chọn:
- Nhóm có tiền sử buồng trứng đáp ứng kém trong thụ tinh ống nghiệm: • Số nang trên siêu âm ngày tiêm hCG ≤ 4 nang.
• Chọc hút ≤ 4 noãn.
- Nhóm có nguy cơ đáp ứng kém khi có 1 trong các dấu hiệu sau: • Tuổi ≥ 35.
• AFC (Antral Follicle Count- Siêu âm đếm nang thứ cấp) < 7 nang. • FSH cơ bản >10mIU/ml.
* Tiêu chuẩn loại trừ:
- Tuổi ≥ 40.
- Có tiền sử phẫu thuật ở buồng trứng.
- Có bất thƣờng ở tử cung: u xơ tử cung, tử cung xơ hoá, dính buồng tử cung. - Tinh dịch đồ của chồng bất thƣờng.
- Số lần làm thụ tinh trong ống nghiệm ≥ 3.
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu: thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên so sánh hai phác đồ điều trị. phác đồ điều trị.
2.3.2. Cỡ mẫu: theo công thức tính cỡ mẫu cho nghiên cứu can thiệp của WHO [93]
2 P 1 P 2 P 1 2 P 1 P 1 1 P z1 P 1 P 2 Z1 /2 2 2 N
- N = số lƣợng đối tƣợng cho mỗi nhóm - Mức ý nghĩa: α = 5%, Z1-α/2 = 1,96 - Độ mạnh: 1- =80%, Z1- = 0,84
- P1= 42,3%: tỷ lệ thai lâm sàng phác đồ ngắn/hMG theo nghiên cứu của Kolibianakis (2007 tại Bilbao- Spain) [94].
- P2= 30% tỷ lệ thai lâm sàng của phác đồ ngắn/rFSH theo nghiên cứu của Marr R, Scholcaraft (2004 tại Colorado – USA) [95].
- P= (P1 + p2)2/2 = (0,42+ 0,3)2/2 ~ 0,26 Thay số ta có N= 93
Dự kiến tỷ lệ huỷ bỏ điều trị là 15%.
Nhƣ vậy, nghiên cứu sẽ lấy cỡ mẫu là 110 BN cho mỗi phác đồ.
2.3.3.1. Các biến số về đặc điểm bệnh nhân
Tuổi của bệnh nhân.
BMI.
Nguyên nhân vô sinh: do vòi tử cung, rối loạn phóng noãn, giảm dự trữ buồng trứng, phối hợp.
2.3.3.2. Các biến số về đặc điểm chu kỳ thụ tinh trong ống nghiệm
Liều FSH khởi đầu.
Tổng liều FSH.
Số ngày sử dụng FSH.
Số trƣờng hợp tăng, giảm liều FSH, số ngày và tổng liều tăng, giảm FSH.
Độ dày của niêm mạc tử cung.
Số nang noãn ≥14 mm vào ngày tiêm hCG.
Số noãn thu đƣợc.
Số noãn thụ tinh.
Tỷ lệ thụ tinh.
Số phôi.
Đánh giá chất lƣợng phôi theo 3 độ: độ 1, độ 2, độ 3.
Số phôi chuyển, số trƣờng hợp chuyển phôi.
Số phôi đông lạnh, số trƣờng hợp có phôi đông lạnh.
Tỷ lệ thai sinh hóa.
Tỷ lệ thai lâm sàng.
Tỷ lệ đáp ứng kém.
Tỷ lệ quá kích buồng trứng.
Các xét nghiệm nội tiết cơ bản vào ngày 2 của chu kỳ kinh: FSH, LH, E2.
Các xét nghiệm nội tiết LH, E2, P4 đƣợc định lƣợng vào ngày 7 tiêm FSH và vào ngày tiêm hCG.
Tinh dịch đồ: mật độ tinh trùng, tỷ lệ tinh trùng di động nhanh, tỷ lệ tinh trùng di động chậm, tỷ lệ bình thƣờng và tỷ lệ sống.
2.3.4. Các phƣơng tiện và vật liệu nghiên cứu
2.3.4.1. Các thuốc được sử dụng trong nghiên cứu GnRH agonist:
GnRH agonist đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này là triptorelin. Biệt dƣợc của triptorelin là Diphereline® do công ty Beaufour Ipsen của Pháp sản xuất và phân phối. Thuốc đƣợc tiêm dƣới da với liều 0,1 mg vào ngày 2 của vòng kinh, 0,5mg/ngày từ ngày 3 của vòng kinh. Thời gian tối đa để đạt hàm lƣợng đỉnh trong huyết thanh là 0,63 ± 0,26 giờ. Thời gian bán huỷ là 7,6 ± 1,6 giờ [39].
FSH tái tổ hợp (rFSH):
rFSH đƣợc sử dụng là Gonal- F® (sản xuất bởi Laboratoires Serono S.A., Thụy Sĩ, phân phối tại Việt Nam bởi Merk-Serono) hàm lƣợng 75IU, 300IU, 450IU hoặc Puregon® (sản xuất bởi Organon, Hà Lan, phân phối tại Việt Nam bởi MSD) hàm lƣợng 50IU, 100IU, 300IU, 600IU [45].
Sử dụng rFSH bằng đƣờng tiêm dƣới da. Hàm lƣợng đỉnh đạt đƣợc khoảng 12 giờ sau khi tiêm. rFSH đào thải chậm ra ngoài cơ thể 12- 70 giờ. Khoảng 1/8 liều follitropin đào thải vào nƣớc tiểu [45].
● FSH có nguồn gốc từ nước tiểu (Human Menopausal Gonadotropins -hMG)
hMG bao gồm 75 IU FSH và 75 IU LH với tỷ lệ 1:1 đã đƣợc sử dụng rộng rãi trong vài thập kỷ qua trong kích thích buồng trứng. Tuy nhiên chế phẩm này có bất lợi là chứa LH có thể gây hoàng thể hoá sớm, thành phần và hoạt tính sinh học giữa các lô thuốc không ổn định và chứa các loại protein không cần thiết [47].
Cơ chế tác dụng của thuốc là cung cấp một lƣợng Gonadotropins ngoại sinh gồm FSH và LH để làm tăng sự phát triển của các nang noãn ở buồng trứng [46]. Gonadotropins có nguồn gốc từ nƣớc tiểu có chứa protein nên phải dùng theo đƣờng tiêm bắp. hMG đƣợc sử dụng trong nghiên cứu là Menogon (Hãng sản xuất và phân phối - Ferring), hàm lƣợng 75 IU (FSH:LH = 1:1) [47].
hCG
hCG có biệt dƣợc là Pregnyl® hàm lƣợng 5000 IU (sản xuất bởi công ty Organon, Hà Lan, phân phối tại Việt Nam bởi công ty MSD). Liều dùng 5000 IU-10000 IU.
Sử dụng hCG bằng đƣờng tiêm bắp. Hàm lƣợng đỉnh đạt đƣợc trong vòng 6 giờ và kéo dài khoảng 36 giờ. Hàm lƣợng hCG giảm lúc 48 giờ và tiếp cận mức cơ sở sau khoảng 72 giờ. Sau khi tiêm bắp hCG, khoảng 10-12% liều bài tiết vào nƣớc tiểu trong 24 giờ.
Progesterone
Progesterone (P4) đƣợc sử dụng để hỗ trợ pha hoàng thể là Utrogestan® do công ty Tedis của Pháp sản xuất có hàm lƣợng là 100mg, 200 mg. Sử dụng Utrogestan bằng đƣờng đặt trong âm đạo với liều dùng là 600 mg mỗi ngày.
2.3.4.2. Các phương tiện nghiên cứu
Máy siêu âm đầu dò âm đạo tần số 7,5 MHz. Hãng ALOKA SSD 1400 (Nhật Bản).
Máy AXSIM ABBOTT (Mỹ) định lƣợng các hormon nội tiết bằng kỹ thuật E.I.A (Enzym Immuno Assay): FSH (IU/l), LH (IU/l), Estradiol (pg/ml), P4 (nmol/l), định lƣợng hCG (IU/l).
Tủ nuôi cấy phôi ở nhiệt độ 370
C và 5% CO2 : Themoforma (Mỹ). Kính hiển vi soi nổi Olympus (Nhật): quan sát và nhặt noãn, đánh giá tinh dịch đồ.
Kính hiển vi đảo ngƣợc và bộ vi thao tác của hãng Olympus (Nhật): thực hiện ICSI, quan sát noãn thụ tinh, đánh giá chất lƣợng phôi. (Phụ lục 10: Hình ảnh kính hiển vi đảo ngƣợc).
Môi trƣờng sử dụng để thao tác với noãn: ASPTM của hãng Vitrolife (Thụy Điển).
Môi trƣờng để lọc rửa tinh trùng: SpermgradTM
, SpermrinseTM của hãng Vitrolife (Thụy Điển).
Môi trƣờng để thực hiện ICSI: HyaseTM
-10X, GameteTM của hãng Vitrolife (Thụy Điển).
Môi trƣờng để nuôi cấy phôi và chuyển phôi: IVFTM
hãng Vitrolife (Thụy Điển).
Môi trƣờng để đông lạnh phôi: FreezeKit 1 hãng Vitrolife (Thụy Điển). Kim hút noãn dài 30 cm số 17 của hãng Laboratoire C.C.D (Pháp). Catheter long Frydman set để chuyển phôi của hãng Laboratoire C.C.D (Pháp).
2.3.5. Các bƣớc tiến hành nghiên cứu
Trƣớc khi bắt đầu thực hiện các quy trình thụ tinh trong ống nghiệm, mỗi cặp vợ chồng đều đƣợc khám lâm sàng và làm các xét nghiệm cơ bản.
Đối với ngƣời vợ:
Khám phụ khoa tổng quát.
Xét nghiệm: HbsAg, TPHA, HIV, Chlamydia, công thức máu, sinh hóa máu, xét nghiệm nội tiết cơ bản FSH, LH, E2 vào ngày 2 hoặc ngày 3 của chu kỳ kinh.
Siêu âm tử cung và hai buồng trứng. Đối với ngƣời chồng:
Khám nam khoa tổng quát.
Xét nghiệm: HbsAg, TPHA, HIV và tinh dịch đồ.
2.3.5.2. Các bước thực hiện nghiên cứu
Sau khi hoàn thành hồ sơ điều trị vô sinh, các đối tƣợng nghiên cứu đủ điều kiện về tiêu chuẩn lựa chọn và tiêu chuẩn loại trừ sẽ đƣợc thực hiện theo các bƣớc sau đây:
1. Phân nhóm nghiên cứu theo cách chọn mẫu ngẫu nhiên phân tầng: • Nhóm hMG nhận phác đồ ngắn kết hợp với hMG (phác đồ ngắn/hMG). • Nhóm rFSH nhận phác đồ ngắn kết hợp với rFSH (phác đồ ngắn/rFSH). 2. Theo dõi sự phát triển của nang noãn bằng siêu âm và xét nghiệm nội tiết.
3. Gây trƣởng thành noãn bằng hCG. 4. Chọc hút noãn và lọc rửa tinh trùng. 5. Đánh giá chất lƣợng noãn.
6. Thực hiện kỹ thuật thụ tinh tiêm tinh trùng vào bào tƣơng của noãn (ICSI). 7. Đánh giá chất lƣợng phôi.
8. Chuyển phôi vào buồng tử cung: chuyển phôi ngày 3. 9. Hỗ trợ pha hoàng thể.
10. Thử βhCG để xác định có thai và siêu âm theo dõi sự phát triển của thai. 11. Đánh giá kết quả của hai phác đồ về kết quả kích thích buồng trứng và kết quả thụ tinh trong ống nghiệm bao gồm:
Đáp ứng của buồng trứng. Số nang noãn ≥ 14 mm. Số noãn. Số phôi. Số phôi tốt (phôi độ 3). Số phôi đông.
Tỷ lệ thai sinh hoá.
Tỷ lệ thai lâm sàng.
2.3.5.3. Sơ đồ nghiên cứu
Sơ đồ 2.1. Các bƣớc tiến hành nghiên cứu
2.3.5.4. Các phác đồ kích thích buồng trứng Phác đồ ngắn/hMG Phác đồ ngắn/rFSH Sử dụng hCG & lọc rửa ICSI Chuyển phôi Hỗ trợ pha hoàng thể
Thử β hCG. Siêu âm thai
Theo dõi sự phát triển của thai
Theo dõi sự phát triển của nang noãn
Đánh giá kết quả của hai phác đồ Đánh giá các yếu tố liên quan Kết quả kích thích
buồng trứng
● Nhóm hMG: Phác đồ ngắn/hMG
Bệnh nhân có kinh ngày 2 xét nghiệm LH, E2, P4 và siêu âm.
Tiêm dƣới da Diphereline 0,1mg vào ngày 2 của chu kỳ kinh.
Từ ngày 3 của chu kỳ kinh, tiêm dƣới da ½ ống Diphereline 0,1mg và hMG. Liều khởi đầu FSH 300IU/ngày (225IU rFSH + 75IU hMG).
Sơ đồ 2.2. Phác đồ kích thích buồng trứng của nhóm hMG
●Nhóm rFSH: Phác đồ ngắn/rFSH
Bệnh nhân có kinh ngày 2 xét nghiệm LH, E2, P4 và siêu âm.
Tiêm dƣới da Diphereline 0,1mg vào ngày 2 của chu kỳ kinh.
Từ ngày thứ 3 của chu kỳ kinh, tiêm dƣới da ½ ống Diphereline 0,1mg và rFSH. Liều khởi đầu 300IU rFSH/ ngày.
Sơ đồ 2.3. Phác đồ kích thích buồng trứng của nhóm rFSH
2.3.5.5.Theo dõi sự phát triển của nang noãn
GnRHa 225 IU rFSH + 75IUhMG N2CK N7- XN hCG 8 - 10 ngµy Chäc hót no·n ChuyÓn ph«i GnRHa 300 IU rFSH N2CK N7- XN hCG 8 - 10 ngµy Chäc hót no·n ChuyÓn ph«i
Theo dõi sự phát triển của nang noãn bằng siêu âm đƣờng âm đạo và các xét nghiệm nội tiết.
Siêu âm nang noãn vào các thời điểm: ngày 8, ngày 10 hoặc ngày 11... sau khi tiêm rFSH. Khi có ít nhất một nang noãn có đƣờng kính ≥ 18 mm trên siêu âm thì tiêm bắp hCG 10000 IU để trƣởng thành noãn.
Xét nghiệm các chỉ số nội tiết E2, LH, P4 vào các thời điểm: ngày 2, ngày 7, ngày 10 sau khi tiêm FSH và ngày tiêm hCG.
2.3.5.6. Hút noãn
Hút noãn đƣợc tiến hành sau khi tiêm hCG 34-36 giờ.
(Phụ lục 1: Quy trình hút noãn. Phụ lục 2: Đánh giá chất lƣợng noãn. Phụ lục 3: Hình ảnh noãn sau khi hút).
2.3.5.7. Chuẩn bị tinh trùng
Ngƣời chồng kiêng xuất tinh 3 - 5 ngày và lấy tinh trùng vào ngày ngƣời vợ chọc hút noãn, tinh trùng đƣợc lọc rửa theo phƣơng pháp thang nồng độ sau đó sẽ thụ tinh với noãn. (Phụ lục 4: Quy trình chuẩn bị tinh trùng).
2.3.5.8. Phương pháp thụ tinh
ICSI: Phƣơng pháp thụ tinh bằng cách tiêm tinh trùng vào bào tƣơng của noãn (Phụ lục 5: Quy trình thụ tinh. Phụ lục 6: Hình ảnh kỹ thuật ICSI).
2.3.5.9. Chuyển phôi vào buồng tử cung
Chuyển phôi vào buồng tử cung ngày 3 sau khi hút noãn dƣới sự hƣớng dẫn của siêu âm đƣờng bụng. (Phụ lục 7: Quy trình chuyển phôi).
2.3.5.10. Hỗ trợ pha hoàng thể
Hỗ trợ pha hoàng thể bằng Utrogestan đặt âm đạo với liều mỗi ngày 600 mg, bắt đầu ngay sau hút noãn.
Định lƣợng βhCG 14 ngày sau chuyển phôi. Nếu có thai thì siêu âm xác định túi thai 4 tuần sau chuyển phôi. Xác định số túi thai và sự hoạt động của tim thai.
2.3.6. Các tiêu chuẩn đánh giá liên quan đến nghiên cứu
Các thuật ngữ và các tiêu chuẩn đánh giá trong nghiên cứu này đƣợc áp dụng theo Ủy ban quốc tế theo dõi về kỹ thuật hỗ trợ sinh sản và tổ chức y tế thế giới (The International Committee for Monitoring Assisted Reproductive Technology (ICMART) and WHO) [96].
Đánh giá BMI: BMI = cân nặng(kg)/chiều cao2
(m)
BMI: < 18,5: thấp cân.
BMI: 18,5-22,9: bình thƣờng.
BMI: ≥ 23: dƣ cân.
Tiêu chuẩn về tinh dịch đồ bình thƣờng: theo tiêu chuẩn của WHO năm 1999 [97].
Thể tích tinh dịch: 2 ml.
Mật độ tinh trùng: ≥ 20 triệu/ml.
Tinh trùng di động tiến tới nhanh A: ≥ 25%.
hoặc A + B ≥ 50% (B là tinh trùng di động tiến tới chậm).
Tỷ lệ tinh trùng sống ≥ 75%.
Tỷ lệ tinh trùng có hình dạng bình thƣờng ≥ 30%. Tiêu chuẩn xác định độ dày niêm mạc tử cung:
Siêu âm đầu dò âm đạo để xác định niêm mạc tử cung ở mặt cắt dọc giữa của tử cung. Cố định hình ảnh siêu âm và đo độ dày niêm mạc tử cung ở khoảng cách lớn nhất tính từ ranh giới giữa niêm mạc tử cung và cơ tử cung.
16-18 giờ sau khi ICSI. Noãn đã thụ tinh là khi có 2 tiền nhân quan sát dƣới kính hiển vi đảo ngƣợc. Đánh giá số noãn đã thụ tinh và số noãn không thụ tinh. (Phụ lục 8).
Xác định tỷ lệ thụ tinh:
Tỷ lệ thụ tinh = số noãn thụ tinh/ tổng số noãn ICSI.
Đánh giá chất lƣợng phôi: Tiêu chuẩn Ariff Bongso [98]
Dựa vào tỷ lệ các mảnh vỡ bào tƣơng (fragment), tốc độ phân chia của phôi và độ đồng đều của các tế bào:
Phôi độ 3: có 4-5 tế bào vào ngày thứ 2 hoặc có 7-8 tế bào vào ngày
thứ 3, các tế bào đồng đều, không có mảnh vỡ (fragment) hoặc tỷ lệ mảnh vỡ (fragment) < 10%.
Phôi độ 2: có 3- 4 tế bào vào ngày thứ 2 hoặc có 6-8 tế bào vào ngày
thứ 3, các tế bào không đồng đều hoặc tỷ lệ mảnh vỡ (fragment) lớn hơn 10% và ít hơn 25%.
Phôi độ 1: có 2 tế bào vào ngày thứ 2 hoặc có < 5 tế bào vào ngày
thứ 3 hoặc tỷ lệ mảnh vỡ trên 25%.
(Phụ lục 9: Hình ảnh về chất lƣợng phôi)
Đánh giá về kỹ thuật chuyển phôi:
Chuyển phôi dễ: đƣa catheter chứa phôi vào buồng tử cung dễ dàng,
catheter sạch.
Chuyển phôi khó: phải cặp cổ tử cung kéo ra thì mới đƣa đƣợc
catheter vào buồng tử cung hoặc sau khi chuyển phôi kiểm tra thấy máu ở catheter chứa phôi hoặc sót phôi.
● Tiêu chuẩn đánh giá điểm chuyển phôi:
• ≥ 2 phôi độ 3: 2 điểm. • 1 phôi độ 3: 1 điểm.
• Không có phôi độ 3: 0 điểm.
* Đặc điểm niêm mạc tử cung:
• 8-14mm, dạng 3 lá: 2 điểm.
• >14mm hoặc 8-14mm đậm âm: 1 điểm. • <8mm: 0 điểm.
* Chuyển phôi:
• Chuyển phôi dễ sạch: 2 điểm.
• Chuyển phôi khó vừa: 1 điểm (nòng ngoài catheter có máu). • Chuyển phôi rất khó: 0 điểm.
(các yếu tố chuyển phôi khó: thời gian chuyển phôi >5 phút, có cặp cổ tử cung, có máu trong catheter, chuyển phôi 2 lần, sót phôi)
Xác định tỷ lệ làm tổ = tổng số túi ối/tổng số phôi chuyển. Xác định có thai sinh hóa.
Định lƣợng hCG trong máu 2 tuần sau chuyển phôi. Nếu hCG < 25 IU/l là không có thai. Thai sinh hóa là khi có thai xác định bằng hCG ≥ 25 IU/l nhƣng không phát triển thành thai lâm sàng.
Xác định có thai lâm sàng:
Thai lâm sàng đƣợc xác định khi có hình ảnh túi ối trên siêu âm đƣờng