Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển vi củ sâm ngọc linh (panaxvietnamensis ha et grushv ) từ nuôi cấy phôi soma

1 MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Mục đích đề tài 10 Cơ sở khoa học tính thực tiễn đề tài 10 3.1 Cơ sở khoa học 10 3.2 Tính thực tiễn 10 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu đề tài 11 4.1 Đối tƣợng nghiên cứu 11 4.2 Phạm vi nghiên cứu đề tài 11 CHƢƠNG TỔNG QUAN ĐỀ TÀI 12 1.1 SƠ LƢỢC VỀ CHI PANAX 12 1.1.1 Phân bố loài thuộc chi Panax 12 1.1.2 Phân loại 13 1.1.3 Đặc điểm thực vật 16 1.1.4 Thành phần hóa học 16 1.1.5 Tác dụng 17 1.1.6 Các dạng chế biến từ sâm 18 1.2 TỔNG QUAN VỀ SÂM NGỌC LINH 20 1.2.1 Phân loại khoa học 20 1.2.2 Đặc điểm hình thái 20 1.2.3 Đặc điểm sinh trƣởng phát triển sâm Ngọc Linh 21 1.2.4 Đặc điểm phân bố 22 1.2.5 Đặc tính dƣợc liệu 22 1.2.6 Công dụng 23 1.2.7 Giá trị kinh tế 24 1.2.8 Một số nghiên cứu sâm Ngọc Linh nƣớc 24 1.2.9 Các yếu tố ảnh hƣởng đến q trình ni cấy 27 1.2.10 Điều kiện nuôi cấy 31 1.2.11 Các yếu tố khác ảnh hƣởng đến nuôi cấy in vitro 33 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 38 2.1.1 Thời gian 38 2.1.2 Địa điểm 38 2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 38 2.2.1 Vật liệu nghiên cứu 38 2.2.2 Điều kiện nuôi cấy 38 2.2.3 Dụng cụ thiết bị 39 2.2.4 Môi trƣờng hóa chất 39 2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 39 2.3.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hƣởng hóa chất ni cấy giai đoạn hình thành vi củ sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy phôi soma 39 2.3.2 Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy giai đoạn hình thành vi củ sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy phôi soma 39 2.4 PHƢƠNG PHÁP BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 40 2.4.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hƣởng hóa chất ni cấy giai đoạn hình thành vi củ sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy phôi soma 40 2.4.2 Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hƣởng điều kiện ni cấy giai đoạn hình thành vi củ sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy phôi soma 43 2.5 PHƢƠNG PHÁP LẤY SỐ LIỆU 47 2.6 PHÂN TÍCH VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU 47 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48 3.1 NỘI DUNG 1: NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA HĨA CHẤT NI CẤY TRONG GIAI ĐOẠN HÌNH THÀNH VI CỦ SÂM NGỌC LINH TỪ NUÔI CẤY PHÔI SOMA 48 3.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng Myo-inositol lên khả hình thành vi củ sâm Ngọc Linh 48 3.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng adenine sulphate lên khả hình thành vi củ sâm Ngọc Linh 51 3.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng L-tyrosine lên khả hình thành vi củ sâm Ngọc Linh 54 3.1.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng casein hydrolysate lên khả hình thành vi củ sâm Ngọc Linh 57 3.1.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng peptone lên khả hình thành vi củ sâm Ngọc Linh 61 3.1.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng cao nấm men lên khả hình thành vi củ sâm Ngọc Linh 64 3.2 NỘI DUNG 2: NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NI CẤY TRONG GIAI ĐOẠN HÌNH THÀNH VI CỦ SÂM NGỌC LINH TỪ NUÔI CẤY PHÔI SOMA 66 3.2.1 Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hƣởng điều kiện chiếu sáng lên khả hình thành vi củ sâm Ngọc Linh 66 3.2.2 Thí nghiệm 8: Khảo sát ảnh hƣởng điều kiện thống khí lên khả hình thành vi củ sâm Ngọc Linh 69 3.2.3 Thí nghiệm 9: Khảo sát ảnh hƣởng điều kiện nhiệt độ lên khả hình thành vi củ sâm Ngọc Linh 72 3.2.4 Bài toán tối ƣu 75 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 77 4.1 KẾT LUẬN 77 4.2 KIẾN NGHỊ 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO 79 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT BA 6-benzyladenine CĐHSTTV Chất điều hòa sinh trƣởng thực vật GA3 Acid gibberellic G-Rb1 Ginsenoside-Rb1 G-Rg1 Ginsenoside-Rg1 G-Rg2 Ginsenoside-Rg2 G-Rd Ginsenoside-Rd HPLC High performance liquid chromatography IBA Indole- 3-butyric LED Light-Emmitting Diode MS Môi trƣờng Murashige Skoog NAA α-Naphtaleneacetic acid OA Olean OCT Ocotillol saponin PPD Protopanaxadiol PPT Protopanaxatriol SH Môi trƣờng Schenk Hildebrandt YE Yeast extract DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Các loài thuộc chi Panax giới [2] 12 Bảng 1.2: Bảng hệ thống phân loại loài thuộc chi Panax Châu Á giới [2] 14 Bảng 1.3: Một số vi lƣợng thông dụng 30 Bảng 1.4: Các vitamin thƣờng dùng nuôi cấy mô tế bào thực vật 31 Bảng 2.1: Các mức khoảng biến thiên thí nghiệm 45 Bảng 2.2: Bảng bố trí ma trận nghệm thức thực nghiệm 46 Bảng 3.1: Ảnh hƣởng myo-inositol lên hình thành vi củ từ mẫu phơi soma sâm Ngọc Linh 48 Bảng 3.2: Ảnh hƣởng adenine sulphate lên hình thành vi củ từ mẫu phơi soma sâm Ngọc Linh 52 Bảng 3.3: Ảnh hƣởng L-tyrosine lên hình thành vi củ từ mẫu phơi soma sâm Ngọc Linh 55 Bảng 3.4 : Ảnh hƣởng casein hydrolysate lên hình thành vi củ từ mẫu phôi soma sâm Ngọc Linh 58 Bảng 3.5: Ảnh hƣởng peptone lên hình thành vi củ từ mẫu phôi soma sâm Ngọc Linh 61 Bảng 3.6: Ảnh hƣởng cao nấm men lên hình thành vi củ từ mẫu phơi soma sâm Ngọc Linh 64 Bảng 3.7: Ảnh hƣởng điều kiện chiếu sáng lên hình thành vi củ từ mẫu phôi soma sâm Ngọc Linh 67 Bảng 3.8: Ảnh hƣởng điều kiện thống khí lên hình thành vi củ từ mẫu phôi soma sâm Ngọc Linh 69 Bảng 3.9: Ảnh hƣởng điều kiện nhiệt độ lên hình thành vi củ từ mẫu phơi soma sâm Ngọc Linh 72 Bảng 3.10: Bố trí ma trận thí nghiệm thực nghiệm 75 Bảng 3.11: Bảng mức độ ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy lên hình thành vi củ sâm Ngọc Linh 76 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hồng sâm (trái) Hắc sâm (phải) [5] 18 Hình 1.2: Các sản phẩm phong phú từ sâm thị trƣờng [5] 19 Hình 1.3: Sâm Ngọc Linh [9] 20 Hình 2.1: Phơi soma sâm Ngọc Linh nuối cấy in vitro 38 Hình 3.1: Ảnh hƣởng myo-inositol lên hình thành vi củ sâm Ngọc Linh 49 Hình 3.2: Ảnh hƣởng adenine sulphate lên hình thành vi củ sâm Ngọc Linh 53 Hình 3.3: Ảnh hƣởng L-tyrosine lên hình thành vi củ sâm Ngọc Linh 56 Hình 3.4: Ảnh hƣởng casein hydrolysate lên hình thành vi củ sâm Ngọc Linh 59 Hình 3.5: Ảnh hƣởng peptone lên hình thành vi củ sâm Ngọc Linh 62 Hình 3.6: Ảnh hƣởng cao nấm men lên hình thành vi củ sâm Ngọc Linh 65 Hình 3.7: Ảnh hƣởng ánh sáng lên hình thành vi củ sâm Ngọc Linh 67 Hình 3.8: Ảnh hƣởng điều kiện thống khí lên hình thành vi củ sâm Ngọc Linh 70 Hình 3.9: Ảnh hƣởng nhiệt độ lên hình thành vi củ sâm Ngọc Linh 73 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Sâm Ngọc Linh có tên khoa học Panax vietnamensis Ha et Grushv., thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae) Từ sâm Ngọc Linh chiết đƣợc 50 hợp chất, xác định cấu trúc hóa học cho thấy 26 hợp chất có cấu trúc biết (thƣờng thấy sâm Triều Tiên, sâm Mỹ, sâm Nhật) 24 saponin dammarane có cấu trúc khơng bắt gặp loài sâm khác giới [1] Với mục đích bảo tồn phát triển nguồn gen quý quốc gia đồng thời phát triển vùng trồng để cung cấp nguyên liệu cho ngành dƣợc, từ lâu công tác tạo nguồn giống sâm Ngọc Linh đƣợc đề cập đến với hai hình thức chủ yếu nhân giống từ hạt tạo giống từ đầu mầm (thân rễ ngầm) nhƣng kết đạt đƣợc hạn chế số lƣợng hạt giống chất lƣợng ngày khai thác mức sâm cho hạt, cơng nghệ vi nhân giống chƣa đáp ứng đƣợc chất lƣợng giống canh tác đồng ruộng (tỷ lệ giống chết chậm phát triển, không tạo củ hồn chỉnh trồng ngồi đồng ruộng) Do đó, cần phải cải tiến công nghệ vi nhân giống sâm Ngọc Linh yêu cầu cấp thiết cần giải Việc ứng dụng phƣơng pháp phát sinh phôi soma sâm Ngọc Linh hứa hẹn mang lại nhiều ƣu điểm tạo số lƣợng lớn có chất lƣợng tốt thời gian ngắn, tỷ lệ sống sót vƣờn ƣơm cao phát triển từ phơi vơ tính theo đƣờng tƣơng tự nhƣ phơi hữu tính Tuy nhiên kết nghiên cứu gần phát sinh phôi soma sâm Ngọc Linh cịn nhiều hạn chế hiệu hình thành vi củ (micro - rhizome) từ phôi, giai đoạn quan trọng để tăng tỷ lệ hình thành giống hồn chỉnh đơn vị ni cấy Các kết nghiên cứu trình sinh lý giai đoạn hình thành giai đoạn phát triển vi củ (micro - rhizome) sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy phơi soma ứng dụng sản xuất sinh khối sâm điều kiện Plant factory (canh tác nhà) 10 Với sở lý trên, đề tài: “Nghiên cứu số yếu tố ảnh hƣởng đến phát triển vi củ sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) từ nuôi cấy phôi soma” cần đƣợc tiến hành nghiên cứu Mục đích đề tài Nghiên cứu tìm loại nồng độ chất hữu nhƣ điều kiện nuôi cấy in vitro thích hợp cho giai đoạn hình thành vi củ sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy phôi soma Cơ sở khoa học tính thực tiễn đề tài 3.1 Cơ sở khoa học Sâm Ngọc Linh lồi sâm có hàm lƣợng saponin khung dammaran cao (khoàng 12 - 15%) lƣợng saponin nhiều so vói lồi khác cùa chi Panax giới [2] Với đặc điểm đó, sâm Ngọc Linh khơng lồi sâm q mà cịn có nhiều nghiên cứu nhân giống công dụng sâm Ngọc Linh Việt Nam giới Theo nghiên cứu dƣợc lý lâm sàng sâm Ngọc Linh cho kết tốt: bệnh nhân ăn ngon, ngủ ngon, cải thiện thị lực, hoạt động trí tuệ, thể lực sức đề kháng, cải thiện trƣờng hợp suy nhƣợc thần kinh, nâng cao huyết áp ngƣời bị huyết áp thấp Hiện nay, với nhu cầu gia tăng từ ngành dƣợc phẩm thảo dƣợc sâm Ngọc Linh đƣợc khai thác mức nên lâm vào tình trạng bị đe dọa tuyệt chủng cao Nhân giống sâm Ngọc Linh cịn gặp nhiều khó khăn Nhân giống hữu tính theo cách thơng thƣờng (gieo hạt) khơng cho kết cao hạt gieo nằm đất sau thời gian dài nảy mầm, hạt thƣờng bị lồi động vật, trùng gặm nhấm ăn…, ngồi tỷ lệ nảy mầm từ hạt thấp (chỉ đạt khoảng 30 - 40%) [3] Do việc ni cấy tạo in vitro góp phần tăng sức sống cây, nâng cao tỷ lệ sống sót đƣa vƣờn ƣơm bƣớc mới, góp phần bảo tồn phát triển lồi dƣợc liệu quý 3.2 Tính thực tiễn Xác định đƣợc loại nồng độ chất hữu nhƣ điều kiện nuôi 74 thức nhiệt độ 23 °C (0,27 cm) Ở điều kiện nhiệt độ 25 °C cho đƣờng kính vi củ nhỏ 0,22 cm, có khác biệt mặt thống kê so với nghiệm thức điều kiện nhiệt độ 19 °C 21 °C Tƣơng tự, khối lƣợng tƣơi vi củ điều kiện nhiệt độ 19 °C cho khối lƣợng tƣơi cao với giá trị 0,05 g, khơng có khác biệt so với nghiệm thức nhiệt độ 21 °C (0,04 g) nhƣng có khác biệt mặt thống kê so với nghiệm thức nhiệt độ 23 °C 25 °C Nghiệm thức có khối lƣợng tƣơi vi củ thấp (0,02 g) nghiệm thức điều kiện nhiệt độ 25 °C, khơng có khác biệt mặt thống kê so với nghiệm thức 21 °C (0,03 g) Nhiệt độ ảnh hƣởng đến trình sinh lý khác nhau, chẳng hạn nhƣ hô hấp quang hợp, ngồi cịn ảnh hƣởng sâu sắc đến nuôi cấy mô thực vật vi nhân giống Nhiệt độ nuôi cấy phổ biến khoảng từ 20 °C đến 27 °C, nhƣng nhiệt độ tối ƣu khác nhau, tùy thuộc vào kiểu gen [81];[91] Theo kết trên, nhiệt độ ảnh hƣởng nhiều đến hình thành vi củ sâm Ngọc Linh Tƣơng tự kết nghiên cứu Lin cộng (2020) cho thấy điều kiện nuôi cấy tối ƣu giai đoạn tăng sinh protocorm D cariniferum 23 ± °C [92] Bên cạnh đó, nhiệt độ cao q trình hình thành vi củ giảm rõ rệt Sự khác biệt thực vật tiếp xúc với nhiệt độ bị tổn thƣơng, biểu giảm ngừng tăng trƣởng [93] mức độ tổn thƣơng thay đổi theo lồi thực vật, giai đoạn phát triển trồng với điều kiện xử lý nhƣ chiếu xạ khoáng chất, dinh dƣỡng [94] Nhƣ nghiên cứu Tang cộng (2020) cho thấy nhiệt độ tối ƣu để nhân giống L davidii var unicolor 30 °C [95] Qua kết thu đƣợc thí nghiệm nghiệm thức nhiệt độ 19 °C 21 °C cho số vi củ cao nên tiến hành chạy toán tối ƣu nghiệm thức 75 3.2.4 Bài tốn tối ƣu Bảng 3.10: Bố trí ma trận thí nghiệm thực nghiệm Biến mã hố TT X1 X2 X3 Biến thực Z1 Nhiệt độ Y1:Số Z2: Điều vi củ kiện thống khí Z3:Ánh sáng (µmol m-2s-1) (oC) (Vi củ/mẫu 1 -1 21 A 53,6 1 21 B 53,6 1,4 -1 19 B 53,6 2,4 -1 21 A 53,6 1,2 1 21 B 53,6 1,4 1 21 B 53,6 1,4 -1 19 B 53,6 2,4 -1 -1 19 A 53,6 -1 -1 19 A 53,6 10 -1 21 A 53,6 11 -1 19 B 53,6 2,2 12 -1 -1 19 A 53,6 13 -1 20 A 53,6 1,4 14 -1 20 A 53,6 1,4 15 -1 20 A 53,6 1,6 76 Phƣơng trình hồi quy nhận đƣợc nhƣ sau: Y1= 1,68889 - 0,466667x1 + 0,177778x2 Kết phân tích ANOVA cho thấy, mơ hình có ý nghĩa thống kê (P 0,75 chứng tỏ mơ hình tƣơng thích với thực nghiệm Hơn nữa, giá trị R2 dự đoán 0,962 phù hợp với R2 điều chỉnh Kết phân tích phƣơng sai (ANOVA) cho thấy ảnh hƣởng nhân tố đến hàm mục tiêu Mơ hình cho thấy yếu tố nhiệt độ, điều kiện thống khí có ảnh hƣởng lên khả tạo vi củ Yếu tố ánh sáng có ảnh hƣởng đến phát sinh vi củ nhƣng số nên mức độ ảnh hƣởng đến hàm mục tiêu ln ln số với bậc tự Bảng 3.11: Bảng mức độ ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy lên hình thành vi củ sâm Ngọc Linh Yếu tố ảnh hƣởng Nhiệt độ Đơn vị o C Kí hiệu Mức độ ảnh hƣởng Giá trị P x1 - 0,93333 2,9-10 x2 0,355556 4,6-6 x3 Df = Điều kiện thống khí Ánh sáng µmol m-2s-1 Theo kết phân tích nhiệt độ 19 oC, điều kiện thống khí chai nút bơng sử dụng ánh sáng LED với cƣờng độ 53,6 µmol m-2s-1 cho kết cực trị 2,46 vi củ/mẫu Tiến hành thử nghiệm lại nghiệm thức cực trị cho kết trung bình nhận đƣợc 2,33 vi củ/mẫu gần so với kết phân tích 77 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Từ kết thu nhận đƣợc, đề tài rút đƣợc số kết luận nhƣ sau: Khảo sát đƣợc ảnh hƣởng hố chất giai đoạn hình thành vi củ sâm Ngọc Linh Số vi củ hình thành cao 1,80 (vi củ/mẫu) mơi trƣờng có bổ sung g/l casein hydrolysate so với mơi trƣờng có bổ sung myoinositol, L-tyrosine, adenine sulphate, pepton cao nấm men Vậy mơi trƣờng thích hợp cho q trình hình thành vi củ mẫu phôi soma sâm Ngọc Linh in vitro mơi trƣờng SH có bổ sung 1,0 mg/l BA 2,0 mg/l NAA, sucrose 50 g/l 1,0 g/l casein hydrolysate Mẫu phôi soma sâm Ngọc Linh cho khả hình thành vi củ cao 2,13 (vi củ/mẫu) nuôi cấy dƣới ánh sáng đèn LED so với mẫu phôi soma nuôi cấy dƣới đèn huỳnh quang Mẫu phôi soma sâm Ngọc Linh nuôi cấy chai dùng nút bơng cho khả hình thành vi củ cao 1,67 (vi củ/mẫu) so với mẫu phôi soma ni cấy chai dùng lọc khí, bịch có lọc khí bịch khơng có lọc khí Mẫu phơi soma sâm Ngọc Linh ni cấy điều kiện nhiệt độ 19 °C cho khả hình thành vi củ cao 1,93 (vi củ/mẫu) so với mẫu phôi soma nuôi cấy nhiệt độ 21 °C, 23 °C 25 °C Từ yếu tố vật lý ban đầu (nuôi cấy dƣới ánh sáng đèn LED, nuôi cấy chai dùng nút chai dùng lọc khí, ni cấy điều kiện nhiệt độ 19 °C 21 °C), sử dụng phần mềm MODDE tối ƣu hóa điều kiện vật lý cho q trình hình thành vi củ mẫu phơi soma sâm Ngọc Linh cao với nhiệt độ 19 °C, dƣới ánh sáng đèn LED chúng đƣợc nuôi cấy chai nƣớc biển dùng nút 4.2 KIẾN NGHỊ Tiếp tục tiến hành khảo sát ảnh hƣởng loại đèn LED lên trình hình thành vi củ từ phôi soma sâm Ngọc Linh 78 Tiếp tục tiến hành thí nghiêm khảo sát mơi trƣờng điều kiện vật lý thích hợp cho q trình hình thành rễ vi củ sâm Ngọc Linh Hoàn thiện quy trình hồn chỉnh từ vi củ sâm Ngọc Linh 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyen Minh Duc, 1994, Chemical Study on the Saponin Composition of Vietnamese Ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv - Araliaceae), Doctoral Thesis, Hiroshima University School of Medicine, Japan Nguyễn Thƣợng Dong, Trần Công Luận, Nguyễn Thị Thu Hƣơng, 2007, Sâm Việt Nam số thuốc họ Nhân sâm, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội http://baochinhphu.vn/Utilities/PrintView.aspx?distributionid=397375 Nguyễn Văn Đạt, Trần Thị Phƣơng Anh, Vũ Tiến Chính, Phan Kế Long, Hồng Lê Tuấn Anh, 2017, Chi sâm – Panax L (Họ ngũ gia bì araliaceae), Hội nghị khoa học toàn quốc sinh thái tài nguyên sinh vật lần thứ 7, tr 106 - 112 Nguyễn Minh Đức, Lê Thị Hồng Vân, 2019, Báo cáo phân tích xu hƣớng cơng nghệ: xu hƣớng công nghệ trồng sâm phi lâm nghiệp, Sở khoa học công nghệ Tp.HCM, trung tâm thông tin thống kê khoa học công nghệ Nguyễn Minh Đức, Lê Thị Hồng Vân, 2019, Tổng quan tình hình phát triển thị trƣờng sâm https://vi.wikipedia.org/wiki/Chi_S%C3%A2m https://vi.wikipedia.org/wiki/S%C3%A2m_Ng%E1%BB%8Dc_Linh http://tracuuduoclieu.vn/sam-ngoc-linh.html 10 Đỗ Huy Bích, 2006, Những thuốc động vật làm thuốc việt nam (tập 2) – phần 1, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, tr 704 - 713 11 Đỗ Tất Lợi, 1999, Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, tr 808 - 810 12 Luan T.C., De P.V., Bich L.K., Nguyen N.T., Huan V.D., Huong N.T.T., Phu D.T., 2001, Screening for medicinal plants of Araliaceae family which have effects of strengthening and antistress, Proceeding Pharma Indochina II, SRV Ministry of Health and Hanoi College of Pharmacy, Vietnam, pp 329 - 334 13 Huong N.T.T., Matsumoto K., Kasai R., Yamasaki K.,Watanabe H., 1998, In vitro antioxidant activity of Vietnamese ginseng saponin and its 80 components, Biological and Pharmaceutical Bulletin, 21, pp 978 - 981 14 Ngô Văn Thu, 2004, Bài giảng dược liệu tập 1, Bộ môn dƣợc liệu trƣờng đại học Y Dƣợc TP Hồ Chí Minh trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội, Hà Nội 15 Deng J., Zhou Y., Bai M., Li H., Li L., 2010, Anxiolytic and sedative activities of Passiflora edulis f flavicarpa, Journal of Ethnopharmacology, 128(1), pp 148 - 153 16 Duc N.M., Nham N.T., Kasai R., Ito A., Yamasaki K., Tanaka O., 1993, Saponins from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv collected in central Vietnam I, Chemical and pharmaceutical bulletin, 41(11), pp 2010 - 2014 17 Vũ Thị Hiền, 2018, Nghiên cứu trình tái sinh nhân giống in vitro sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào, Luận án tiến sĩ sinh học 18 Dƣơng Tấn Nhựt, Hoàng Xuân Chiến, Nguyễn Bá Trực, Nguyễn Bá Nam, Trần Xuân Tình, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Văn Bình, Vũ Thị Hiền, Trịnh Thị Hƣơng, Nguyễn Cửu Thành Nhân, Lê Nữ Minh Thùy, Lý Thị Mỹ Nga, Thái Thƣơng Hiền, Nguyễn Thành Hải, 2010, Nhân giống vơ tính sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 8(3B), tr 1211-1219 19 Hồng Xn Chiến, Ngơ Thanh Tài, Nguyễn Bá Trực, Trần Xn Tình, Lâm Bích Thảo, Trần Công Luận, Dƣơng Tấn Nhựt, 2011, Nghiên cứu số yếu tố tạo củ sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro xác định hàm lƣợng saponin tạo từ củ trồng thử nghiệm núi Ngọc Linh, Tạp chí Cơng Nghệ Sinh học, 9(3), tr 317 - 331 20 Ngô Thanh Tài, Nguyễn Bá Nam, Hồ Thanh Tâm, Hà Thị Mỹ Ngân, Dƣơng Tấn Nhựt, 2013, Nghiên cứu tác động ánh sáng đèn LED lên khả tăng sinh mô sẹo hình thành hồn chỉnh từ phơi vơ tính sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), Kỷ yếu Hội nghị CNSH toàn quốc, Hà Nội, tr 1038 - 1042 21 Duong Tan Nhut, Nguyen Phuc Huy, Ngo Thanh Tai, Nguyen Ba Nam, Vu Quoc Luan, Vu Thi Hien, Hoang Thanh Tung, Bui The Vinh, Tran Cong 81 Luan, 2015, Light - emitting Diodes and Their Potential in Callus Growth, Plantlet Development and Saponin Accumulation During Somatic Embryogenesis of Panax vietnamensis Ha et Grushv., Biotechnology & Biotechnological Equipment, 29(2), pp 299 - 308 22 K Claire, Le Gal N., Monteiro M., Dommes J., Gaspar T., 2000, Somatic embryogenesis of panax ginseng in liquid cultures: a role for polyamines and their metabolic pathways, Plant Growth Regulation, 31(3), pp 209 - 214 23 Palazón J., Mallol A., Eibl R., Lettenbauer C., Cusidó R.M., Piđol M.T., 2003, Growth and ginsenoside production in hairy root cultures of Panax ginseng using a novel bioreactor, Planta medica, 69(04), pp 344 - 349 24 Wu J.Y., Wong K., Ho K., Zhou L., 2005, Enhancement of saponin production in Panax giseng cell cutures by osmotic stress and nutrient feeding, Enzyme and Microbial Technology, 36, pp 133 - 138 25 Marsik P., Langhansova L., Dvorakova M., Digler P., Hruby M., Vanek T., 2014, Increased ginsenosides production by elicitation of in vitro cultivated Panax ginseng adventitious roots, Med Aromat Plants, 3, pp - 26 Vasyutkina E.A., Adrianova I.Y., Reunova G.D., Nguyen T.P.T., Zhuravlev Y.N., 2018, A Comparative Analysis of Genetic Variability and Differentiation in Panax vietnamensis Ha et Grushv., P ginseng CA Meyer Using ISSR Markers, Russian Journal of Genetics, 54(2), pp 262 - 265 27 Majerowicz N., Peres L.E.P., 2008, Fotomorfogenese em plantas In: Kerbauy G.B (ed), Fisiologia vegetal, Rio de Janeiro: Guanabara Koogan 28 Faravani M., Bakar B.B., 2007, Effects of light on seed germination, growth pattern of traits Rhododendron (Melastoma malabathricum L.), Journal of Agricultural and Biological Science, 2(3), pp - 29 Lee S.H., Tewari R.K., Hahn E.J., Paek K.Y., 2007, Photon flux and light quality induce changes in growth, stomatal development, photosynthesis and transpiration of Withania somnifera (L.) Dunal, Plantlets, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 90(2), pp 141 - 151 30 Montagnoli G., 2008, Biological effects of light on proteins: Enzyme activity modulation, Photochemistry and Photobiology, 26(6), pp 679 - 683 82 31 Ma L., Li J., Qu J., Hager J., Chen Z., Zhao H., Deng X.W., 2001, Light control of Arabidopsis development entails coordinated regulation of genome expression and cellular pathways, Plant Cell, 13(12), pp 2589 2607 32 Rout G.R., Samantaray S., Das P., 1995, Somatic embryogen-esis and plant regeneration from callus culture of Acacia catechu: a multipurpose leguminous tree, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 42(3), pp 283 - 285 33 Zhong J.J., Yoshida T., 1993, Effects of temperature on cell growth and anthocyanin production by suspension cul-tures of Perilla frutescenscells, Journal of fermentation and bioengineering, 76(6), pp 530 - 531 34 Verbruggen N., Hermans C., 2008, Proline accumulation in plants: a review, Amino Acids, 35(4), pp 753 - 759 35 Pawar B., Prashant K., Bahurupe J., Jadhav A., Anil K., Pawar S., 2015, Proline and glutamine improve in vitro callus induction and subsequent shooting in rice, Rice Science, 22(6), pp 283 - 289 36 Đỗ Đăng Giáp, Phạm Ngọc Vinh, Trần Trọng Tuấn, Nguyễn Thị Huyền Trang, Phạm Ngô Ánh Thƣ, Thái Xuân Du, 2012, Tăng hệ số nhân nhanh chồi chuối Laba (musa sp.) nuôi cấy in vitro cách sử dụng ánh sáng, myo-inositol adenin sulphate, Tạp chí sinh học, 34(3), tr 180 - 187 37 Saha M., Phatak A., Chandra N., 2004, In vitro culture studies in four dioecious varieties of Carica papaya L using axillary buds from field-grown plants, Journal of Tissue Research, 4(2), pp 211 - 214 38 Đỗ Đăng Giáp, Nguyễn Thị Kim Loan, Trần Trọng Tuấn, Lê Thanh Tuấn, Huỳnh Lê Thiên Tứ, Thái Xuân Du, Nguyễn Đình Lâm, Dƣơng Tấn Nhựt, 2013, Ảnh hƣởng số acid amine spemindin lên hình thành phơi vơ tính cọc rào (jatropha curcas L.), Tạp chí sinh học, 35(3), tr 136 - 144 39 Cote G.G., Crain R.C., 1993, Biochemistry of phosphoinositides, Annual Review of Plant Physiology, 44(1), pp 333 - 356 40 Loewus F., 1990, Structure and occurrence of inositols in plants, Inositol Metabolism in Plants, pp - 11 41 Bohnert H.J., Nelson D.E., Jensen R.G., 1995, Adaptations to 83 environmental stresses, The Plant Cell, 7(7), pp 1099 - 1111 42 Bandurski R.S., 1979, Chemistry and physiology of myo-inositol esters of indole 3-acetic acid, Cyclitols and phosphoinositides, Academic Press, pp 35 - 54 43 Kowalczyk S., Bandurski R., 1991, Enzymatic synthesis of 1-O-(indol3-ylacetyl)-beta-D-glucose: purification of the enzyme from Zea mays, and preparation of antibodies to the enzyme, Biochemistry Journal, 279(2), pp 509 - 514 44 Lee S.W., 2003, Micropropagation of Cavendish banana in Taiwan, Taiwan Banana Research Institute 45 Kaul K., Sabharwal P.S., 1975, Effect of inositol on growth and differentiation, American Journal of Botany, 62, pp 655 – 659 46 Ertola R.J., Hours R., 1998, Role of yeast extract components in microbial cultures not associated with amino acid, vitamins and minerals a review, Applied Biological Sciences, 4, pp - 15 47 Georg E.F., Hall M.A., De Klerk G.J., 2008, Plant propagation by tissue culture, Volume 1, Dordrecht: The Background, Springer 48 George E.F., Hall M.A., De Klerk G.J., 2008, The components of plant tissue culture media II: organic additions, osmotic and pH effects, and support systems, In Plant propagation by tissue culture, Springer, Dordrecht, pp 115 173 49 Robbin W.J., Bartley M.A., 1937, Vitamin B and the growth of excised tomato roots, Science, 85, pp 246 - 247 50 Thom M., Maretzki A., Komor E., Sakai W.S., 1981, Nutrient uptake and accumulation by sugarcane cell cultures in relation to the growth cycle, Plant Cell Tissue Organ Culture, 1(1), pp - 14 51 Franek F., Hohenwarter O., Katinger H., 2000, Plant protein hydrolysates: preparation of defined peptide fractions promoting growth and production in animal cells cultures, Biotechnology progress, 16(5), pp 688 692 52 Chen J.T., Chang W.C., 2002, Effects of tissue culture conditions and explants characteristics on direct somatic embryogenesis in Oncidium „Gower 84 Ramsey‟, Plant cell, tissue and organ culture, 69(1), pp 41 - 44 53 Sivakumar G., Yu K.W., Hahn E.J., Paek K.Y., 2005, Optimization of organic nutrients for ginseng hairy roots production in large˗scale bioreactors, Curr.Sci., 89(4), pp 641 - 649 54 Seyring M., 2005, Einfluss von peptone auf die differenzierung und keimung somatischer embryonen von Cyclamen persicum Mill, BHGL Schriftenreihe, 23, S119 55 Schenk RU., Hildebrandt A.C., 1972, Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures, Canadian Journal of Botany, 50(1), pp 199 - 204 56 Sepahvand S., Ebadi A., Kamali K., Ghaemmaghami S.A., 2012, Effects of myo-inositol and thiamine on micropropagation of GF677 (peach× almond hybrid), Journal of Agricultural Science, 4(2), pp 275 57 Mazri M.A., Meziani R.E., Fadile J., Ezzinbi A.E., 2016, Optimization of medium composition for in vitro shoot proliferation and growth of date palm cv Mejhoul, Biotech, 6(1), pp 111 58 https://vi.wikipedia.org/wiki/Auxin 59 Van Staden J., Zazimalova E., George E.F., 2008, Plant growth regulators II: Cytokinins, their analogues and antagonist, Plant Propagation by Tissue Culture, Springer, The Netherlands, pp 205 - 226 60 Shrivastava S., Banerjee M., 2008, In vitro clonal propagation of physic nut (Jatropha curcas L.): Influence of additives, International Journal of Integrative Biology, 3(1), pp 73 - 79 61 Premkumar G., Sankaranarayanan R., Jeeva S., Rajarathinam K., 2011, Cytokinin induced shoot regeneration and flowering of Scoparia dulcis L (Scrophulariaceae) an ethnomedicinal herb, Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 1(3), pp 169 - 172 62 Kumar S.P., Kumari B.R., 2010, Effect of amino acids and growth regulators on indirect organogenesis in Artemisia vulgaris L., Asian Journal of Biotechnology, 2, pp 37 - 45 63 Hamasaki R.M., Purgatto E., Mercier H., 2005, Glutamine enhances competence for organogenesis in pineapple leaves cultivated in vitro, 85 Brazilian Journal of Plant Physiology, 17(4), pp 383 - 389 64 Grewal D., Gill R., Gosal S.S., 2006, Role of cysteine in enhancing androgenesis and regeneration of indica rice (Oryza sativa L.), Plant growth regulation,, 49(1), pp 43 - 47 65 Saklani K., Singh S., Purohit V.K., Prasad P., Nautiyal A.R., 2015, In vitro propagation of Rudraksha (Elaeocarpus sphaericus (Gaertn.) K Schum): a biotechnological approach for conservation, Physiology and Molecular Biology of Plants, 21(4), pp 611 - 615 66 Sarker K.K., Kabir A.H., Sharmin S.A., Nasrin Z.A.M.F., Alam M.F., 2007, Improved somatic embryogenesis using l-asparagine in wheat (Triticum aestivum L.), Sjemenarstvo, 24(3-4), pp 187 - 196 67 Mok M.C., Mok W.S., 1977, Genotype responses to auxins in tissue culture of Phaseolus vulgaris, Physiologia Plantarum, 40, pp 260 - 264 68 Murashige T., Skoog F., 1962, A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture, Physiologia Plantarum, pp 15(3), pp 473 - 497 69 Thom M., Maretzki A., Komor E., Sakai W.S., 1981, Nutrient uptake and accumulation by sugarcane cell cultures in relation to the growth cycle, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 1(1), pp - 14 70 Filner P., 1966, Regulation of nitrate reductase in cultured tobacco cells, Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Enzymology and Biological Oxidation, 118(2), pp 299 - 310 71 Fukunaga Y., King J., 1982, The effect of L-amino acids on the growth of and nitrate reductase activity in cultured cells of Datura innoxia, Plant Science Letters, 24(1), pp 45 - 54 72 Chyuam Y.N., Saleh N.M., 2010, In vitro propagation of Paphiopedilum orchid through formation of protocorm-like bodies, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 105(2), pp 193 - 202 73 Nhut D.T., Thi N.N., Khiet B.L.T., Luan V.Q., 2008, Peptone stimulates in vitro shoot and root regeneration of avocado (Persea americana Mill.), Scientia Horticulturae, 115(2), pp 124 - 128 74 Saranjeet K., Bhutani K.K., 2012, Organic growth supplement 86 stimulants for in vitro multiplication of Cymbidium pendulum, HortScince, 9(1), pp 47 - 52 75 Chyuam Y.N., Saleh N.M., Zaman F.Q., 2010, In vitro multiplication of the rare andendangered slipper orchid, Paphiopedilum rothschildianum (Orchidaceae), African Journal of Biotechnology, 9(14), pp 2062 - 2068 76 Seiki S., Manabu H., Sumio I., 1993, Recovering vitrified carnation (Dianthus caryophyllus L.) shoots using Bacto-peptone and its subfractions, Plant cell reports, 12(7), pp 370 - 374 77 Nguyễn Thị Cúc, Nguyễn Văn Kết, Dƣơng Tấn Nhựt, Nguyễn Thị Kim Lý, 2014, Nghiên cứu ảnh hƣởng số hợp chất hữu lên trình sinh trƣởng phát triển lan hài hồng (Paphiopedilum delenatii) in vitro, Tạp chí sinh học, 36(1), tr 250 - 256 78 Nguyễn Thị Huyền Trang, Đặng Thị Kim Thúy, Đỗ Đức Thăng, Trần Thị Mỹ Trâm, Trần Trọng Tuấn, Đỗ Đăng Giáp, 2019, Ứng dụng hợp chất hữu thay nguồn nitrate vô môi trƣờng nuôi cấy sinh khối thử hoạt tính sinh học lan kim tuyến (Anoectochilus formosanus Hayata) in vitro, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 55 (1), tr 134 141 79 Sanchez-Sampedro M.A., Fernandez-Ta´rrago J., Corchete P., 2005, Yeast extract and methyl jasmonate-induced silymarin production in cell cultures of Silybum marianum (L.) Gaernt, Journal of biotechnology, 119(1), pp 60 - 69 80 Salisbury F.B., Ross C.W., 1994, Fisiologia Vegetal, México, Iberoamérica 81 Preece J.E., Read P.E., 2001, Environmental management for optimizing micropropagation, In I International Symposium on Acclimatization and Establishment of Micropropagated Plants, 616, pp 49 58 82 Lâm Ngọc Phƣơng, Nguyễn Bảo Vệ, Đỗ Thị Trang Nhã, 2005, Ảnh hƣởng cƣờng độ ánh sáng hàm lƣợng đƣờng sucrose môi trƣờng nuôi cấy đến phát triển chồi dƣa hấu tam bội in vitro, Tạp chí Nghiên cứu Khoa học Đại học Cần Thơ, 4, tr 1- 87 83 Lê Thị Thúy, Trần Thị Anh Thoa, 2017, Ảnh hƣởng ánh sáng đèn LED lên sinh trƣởng Dendrobium lituiflorum Lindl Dendrobium Shavin White., Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Thực phẩm, 13(1), tr 68 - 73 84 Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Đình Lâm, Dƣơng Tuấn Nhựt, 2012, Ảnh hƣởng loại mẫu cấy hệ thống chiếu sáng đơn sắc lên khả tái sinh chồi hoa cúc (Chrysanthemum morifolium ramat Cv “jimba”) ni cấy in vitro, Tạp chí Khoa học Công nghệ, 50(6), tr 593 - 604 85 Cybularz-Urban T., Hanus-Fajerska E., Swiderski A., 2007, Effect of light wavelength on in vitro organogenesis of a Cattleya hybrid, Acta Biologica Cracoviensia, 49(1), pp 113 - 118 86 Dƣơng Tấn Nhựt, Nguyễn Bá Nam, 2009, Ảnh hƣởng hệ thống chiếu sáng đơn sắc lên sinh trƣởng phát triển hoa cúc (Chysanthemum Morifolum CV "Nút") nuôi cấy in vitro, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 7(1), tr 93 – 100 87 Teixeira da Silva J.A., 2004, Ornamental chrysanthemums: improvement by biotechnology - Review of Plant Biotechnology and Applied Genetics, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 79(1), pp - 18 88 Mackay W.A., Kitto S.L., 1988, Factors affecting in vitro shoot proliferation of French tarragon, Journal of the American Society for Horticultural Science, 113(2), pp 282 - 287 89 Huang C., Chen C., 2005, Physical Properties of Culture Vessels for Plant Tissue Culture, Biosystems engineering, 91(4), pp 501- 511 90 Kataeva N.V., Alexandrova I.G., Butenko R.G., Dragavtceva E.V., 1991, Effect of applied and internal hormones on vitrification and apical necrosis of different plants cultured in vitro, Plant cell Tissue and Organ culture, 27(2), pp 149 - 154 91 Altaman A., 2000, Micropropagation of plants, principles and practice, In: Spier, R.E., Encyclopedia of Cell Technology, New York: John Wiley & Sons, pp 916 - 929 92 Lin W., Wang J., Xu X., Wu Y., Qiu D., He B., Chen J., 2020, Rapid propagation in vitro and accumulation of active substances of endangered Dendrobium cariniferum Rchb F, Bioengineered, 11(1), pp 386 - 396 88 93 Ting C.S., Owens T.G., Wolfe D.W., 1991, Seedling growth and chilling stress effects on photosynthesis in chilling-sensitive and chillingtolerant cultivars of Zea mays, Journal of plant physiology, 137(5), pp 559 564 94 Starck Z., Niemyska B., Bogdan J., Tawalbeh R.A., 2000, Response of tomato plants to chilling stress in association with nutrient or phosphorus starvation, Plant Soil, 226(1), pp 99 - 106 95 Tang N., Ju X., Hu Y., Jia R., Tang D., 2020, Effects of Temperature and Plant Growth Regulators on the Scale Propagation of Lilium davidii var unicolor., HortScience, 55(6), pp 870 - 875 ... (canh tác nh? ?) 10 Với sở lý trên, đề tài: ? ?Nghiên cứu số yếu tố ảnh hƣởng đến phát triển vi củ sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv. ) từ nuôi cấy phôi soma? ?? cần đƣợc tiến hành nghiên cứu... đoạn hình thành vi củ sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy phôi soma Nghiên cứu ảnh hƣởng myo-inositol, adenine sulphate, L-tyrosine lên hình thành vi củ sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy phôi soma Nghiên cứu ảnh... thành vi củ sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy phôi soma Nghiên cứu ảnh hƣởng nhiệt độ lên hình thành vi củ sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy phôi soma Nghiên cứu ảnh hƣởng điều kiện thống khí lên hình thành vi