1.2 TỔNG QUAN VỀ SÂM NGỌC LINH
1.2.11 Các yếu tố khác ảnh hưởng đến nuôi cấy in vitro
1.2.11.1 Amino acid hoặc nitơ bổ sung
Mặc dù tế bào nuôi cấy thường có khả năng tổng hợp tất cả các amino acid cần thiết, việc bổ sung các amino acid nhất định hoặc hỗn hợp amino acid có thể được sử dụng để tiếp tục kích thích tăng trưởng tế bào. Việc sử dụng các amino acid đặc biệt quan trọng cho việc thiết lập môi trường nuôi cấy tế bào và môi trường nuôi cấy các kiểu mẫu đầu tiên. Amino acid cung cấp nitơ ngay lập tức cho tế bào thực vật nhƣ một nguồn có sẵn, nói chung chúng có thể đƣợc đƣa lên bởi hệ thống mạch dẫn trong tế bào nhanh hơn so với nitơ vô cơ.
Các nguồn nitơ hữu cơ phổ biến nhất được sử dụng trong môi trường nuôi cấy in vitro là hỗn hợp các amino acid (casein hydrolysate, L-glutamine, L-asparagin và adenine).
Casein hydrolysate
Casein hydrolysate đƣợc sử dụng rộng rãi trong kỹ thuật vi sinh vật, ở nuôi cấy mô và tế bào thực vật chủ yếu đƣợc sử dụng làm nguồn bổ sung amino acid. Casein hydrolysate nói chung đƣợc sử dụng với nồng độ 0,05 - 0,1%. Khi bổ sung casein hydrolysate và các chất khoáng của môi trường MS vào giai đoạn ổn định của quá trình nuôi cấy cho thấy sự sinh trưởng của tế bào cao hơn khoảng 50 - 60% so với đối chứng.
Việc cung cấp các amino acid ngoại sinh trong môi trường nuôi cấy có thể thúc đẩy quá trình tạo mô sẹo và tái sinh phôi ở một số loài thực vật. Casein hydrolysate là một nguồn cung cấp vitamin, các nguyên tố vi lƣợng khác nhau và quan trọng nhất là hỗn hợp của tới 18 loại amino acid. Nhiều nhà nghiên cứu đã chứng minh rằng casein hydrolysate có hiệu quả hơn đối với nuôi cấy mô thực vật so với việc bổ sung các amino acid chính [34];[35].
L-tyrosine
L-tyrosine được xem là nguồn nitrogen hữu cơ thường sử dụng trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật, được sử dụng để kích thích hình thái trong nuôi cấy tế bào nhưng chỉ nên được sử dụng trong môi trường thạch.
Mặc dù tế bào có khả năng tổng hợp tất cả các amino acid cần thiết nhưng sự bổ sung các amino acid vào môi trường nuôi cấy là để kích thích sự tăng trưởng của tế bào.
Adenin sulphate
Adenin sulphate là tiền chất của cytokinin, thường được sử dụng trong nuôi cấy in vitro các giống chuối Musa sp.. Adenin sulphate đƣợc sử dụng
trong nuôi cấy in vitro như một chất bổ sung kích thích tăng trưởng tế bào, tỷ
lệ phát sinh chồi. Adenin kích thích sự phát sinh phôi soma và phát sinh cơ quan, gia tăng sự sinh trưởng của các đỉnh mô phân sinh biệt lập, bao gồm sư tăng nhanh của chồi nách trong nuôi cấy chồi và kích thích phát sinh chồi bất định gián tiếp từ mô sẹo hay trực tiếp từ mẫu cấy [36]. Ảnh hưởng của adenin sulphate lên khả năng tạo chồi có thể do tính chất của cytokinin. Khi có mặt adenin sulphate trong môi trường, các chồi đơn sử dụng adenin sulphate làm tiền chất để tổng hợp ra cytokinin nội sinh. Adenin sulphate đƣợc sử dụng trong nuôi cấy in vitro giúp tăng nhanh số lƣợng cây giống trên đối tƣợng đu
đủ [37]. Trên đối tƣợng cây cọc rào đã chỉ ra rằng adenin sulphate kích thích tạo phôi vô tính từ mô sẹo, đạt hiệu quả cao nhất ở nồng độ là 150 mg/l khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy [38].
Myo-inositol
Myo-inositol là một trong những thành phần chủ yếu trong các môi trường nuôi cấy mô thực vật được sử dụng để lưu trữ phosphat, sinh tổng hợp
tế bào, sản xuất các phân tử liên quan đến stress, truyền thông giữa tế bào với
tế bào, lưu trữ và vận chuyển các hoocmon thực vật.
- Lưu trữ phosphat: Myo-inositol tham gia vào việc bảo quản phosphat trong hạt. Phosphat là chất dinh dưỡng quan trọng của thực vật. Thực vật lưu trữ các chất dinh dƣỡng quan trọng vào hạt giống của chúng để hỗ trợ sự phát triển sớm của cây con [39].
- Sinh tổng hợp tế bào thực vật: Myo-inositol cũng là một phân tử thiết yếu để sản xuất thành tế bào thực vật. Vách tế bào thực vật đƣợc làm chủ yếu bằng các chuỗi đường được gọi là polysaccharide. Một dạng oxy hóa của
myo-inositol là đường phổ biến và quan trọng nhất liên quan đến việc sản xuất polysaccharide cho thành tế bào. Ngoài việc tổng hợp thành tế bào, các đường dẫn xuất myo-inositol này cung cấp các thành phần quan trọng khác liên quan đến lưu trữ, vận chuyển và phát triển [40].
- Myo-inositol ảnh hưởng đến khả năng chịu mặn: Myo-inositol và các phân tử liên quan góp phần bảo vệ thực vật chống lại stress muối. Myo- inositol và các phân tử liên quan đƣợc cho là có liên quan khả năng chịu mặn theo hai cách chính: (1) để bảo vệ cấu trúc tế bào khỏi các chất oxi hóa phản ứng như hydrogen peroxide, và (2) để kiểm soát áp suất nước trong tế bào. Đã
có gợi ý rằng thay đổi sinh tổng hợp các dẫn xuất myo-inositol và myo- inositol có thể tạo khả năng chịu mặn đối với các loài cây trồng [41].
- Truyền thông tin giữa các tế bào: Cây cối, cũng nhƣ động vật, đòi hỏi khả năng phản ứng với môi trường của chúng. Các sinh vật sử dụng các đường dẫn tín hiệu hóa học để chuyển thông tin giữa các tế bào. Myo-inositol
là một thành phần thiết yếu của con đường tín hiệu trong thực vật được gọi là con đường tín hiệu PI. Con đường này đã được chứng minh là tham gia vào một loạt phản ứng của cây trồng bao gồm khả năng rễ phát triển hướng xuống dưới khi phản ứng với lực hấp dẫn và áp suất thay đổi trong các lỗ lá kiểm soát việc héo [42].
- Lưu trữ và vận chuyển hormon thực vật: Myo-inositol cũng phục vụ
để lưu trữ và vận chuyển một nhóm các hormone thực vật quan trọng, gọi là auxin. Hormone thực vật kiểm soát sự phát triển của mô thực vật. Myo- inositol liên kết với các auxin hình thành các hợp chất hormone tạm thời không hoạt động. Những hợp chất không hoạt động này cho phép lưu trữ an toàn và vận chuyển auxin, có thể điều chỉnh sự có sẵn của auxin hoạt động để đáp ứng sinh lý [43].
Một số nghiên cứu cho thấy khi môi trường nuôi cấy bổ sung 100 mg/l myo-inositol có ảnh hưởng đến sự gia tăng chồi in vitro chuối Cavendish
[44]. Trên cây Haworthia cũng nhận thấy có sự gia tăng chồi và rễ khi môi trường nuôi cấy có bổ sung myo-inositol [45].
1.2.11.2 Ảnh hưởng của dịch chiết hữu cơ
Bổ sung các loại dịch chiết xuất hữu cơ vào môi trường nuôi cấy thường dẫn đến các tác động thuận lợi trong quá trình nuôi cấy. Các loại dịch chiết hữu cơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy đã được thử nghiệm bao gồm nước dừa, dịch thủy phân protein, peptone, cao nấm men, dịch chiết xuất mạch nha, dịch chiết chuối, nước cam và nước cà chua. Tuy nhiên, việc bổ sung các dịch chiết hữu cơ vào môi trường nuôi cấy vẫn chưa xác định được vai trò nên được sử dụng như một phương pháp bổ sung, ngày nay chỉ có nước dừa và dịch thủy phân protein thường được bổ sung vào các loại môi trường nuôi cấy.
Cao nấm men (YE)
Cao nấm men chứa nhiều chất dinh dƣỡng thiết yếu cho cây trồng ngoài amino acid, vitamin (vitamin B, glutathione) trong cao nấm men còn chứa các khoáng chất (Zn, Ca và Co), carbohydrate và muối [46]. Do đó, chúng có khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật bằng cách cung cấp cho tế bào thực vật nguồn nitơ hữu cơ [47]. Trước đây, cao nấm men được sử dụng như là chất dinh dưỡng kích thích tăng trưởng như trong nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và nuôi cấy mô sẹo. Hiện nay, cao nấm men thường được sử dụng như một elicitor sinh học để cảm ứng và tăng cường sản xuất các hợp chất thứ cấp từ thực vật. Nhiều thông tin cho rằng cao nấm men đƣợc sử dụng nhƣ là một chất bổ sung để thúc đẩy sự tăng trưởng ở thực vật, do có hàm lượng amino acid cao [48]. Tuy nhiên, tùy vào các loài khác nhau mà có những đáp ứng theo những cách khác nhau khi
có sự hiện diện của cao nấm men, cao nấm men bổ sung ở nồng độ cao trong môi trường MS, ức chế sự tăng trưởng của cây trồng trong khi đó, ở nồng độ thấp cao nấm men đã cho thấy có lợi. Trong nuôi cấy mô cao nấm men lần đầu tiên đƣợc sử dụng và có tác động tích cực lên sự hình thành và phát triển rễ cà chua trong ống nghiệm. Thành phần hóa học của cao nấm men ít đƣợc chú ý phân tích, chủ yếu chứa: đường, nucleic acid, amino acid, vitamin, auxin, muối khoáng. Tác dụng của cao nấm men với rễ rất tốt nhƣng với callus thì không r ràng. Cao nấm men đƣợc biết đến nhƣ nguồn cung cấp các amino acid và các vitamin, đặc biệt là inositol và thiamine (B1) [49].
Trong môi trường chỉ có thành phần dinh dưỡng đa lượng và vi lượng, thì việc cung cấp cao nấm men là thiết yếu cho sự phát triển của tế bào thực vật. Phần trăm các amino acid trong cao nấm điển hình cao khoảng 7% amino nitrogen [50], nhƣng ít glutamic acid hơn casein hay trong các protein thủy phân khác. Cao nấm men thường được thêm vào môi trường với nồng độ 0,1 - 1,0 g/l;
có khi lên tới 5, 10 g/l hay thậm chí là 20 g/l. Vai trò của cao nấm men thường giúp cho sự phát triển của thực vật trong môi trường tương đối thấp nồng độ nitơ hoặc thiếu nitơ.
Vai trò của cao nấm men có liên quan tới những amino acid hiện diện trong thành phần của cao nấm men. Chúng kích thích quá trình tích lũy phytoalexin ở một số loài thực vật và ở huyền phù Glycyrrhiza echinata kích thích hoạt động tổng hợp chalcone dẫn đến hình thành naringin. Cao nấm men cũng kích thích tạo thành furamocoumarin trong huyền phù tế bào Glehnia littoralis.
Peptone
Peptone là các chất hoà tan thu đƣợc khi protein đƣợc hydro hoá hoặc qua phản ứng của enzyme (pepsin, papain, pancreatin,...). Chúng thường ở dạng bột trắng hoặc vàng nhạt và có khả năng hút ẩm rất cao, peptone cũng có thể ở dạng dung dịch. Những loại chính là: peptone thịt, peptone men, peptone máu và peptone casein. Peptone có chứa các thành phần thiết yếu nhƣ: peptide, amino acid, các muối vô cơ cũng nhƣ các hợp chất khác nhƣ chất béo, vitamin
và đường [51]. Trước đây, peptone được bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô
tế bào thực vật nhƣ là nguồn cung cấp carbon và nitơ cho cây trồng. Có ý kiến cho rằng ở một nồng độ hiệu quả, sự kết hợp của nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ
có thể thúc đẩy sự phát triển của mẫu cấy [52]. Gần đây, vai trò đặc biệt của peptone đã được chứng minh như là yếu tố kích thích sự tăng trưởng và phát triển của các mô thực vật. Khi được sử dụng trong môi trường ban đầu, peptone
có chức năng nhƣ một elicitor của sự hình thành rễ tóc nhân sâm [53] và cảm ứng tạo phôi của cây Oncidium [52]. Môi trường nuôi cấy bổ sung thành phần peptone có ảnh hưởng đến sự biệt hóa và nảy mầm của cây hoa anh thảo, nồng
độ peptone thích hợp là 0,25% (w/v) [54].