Khảo sát in silico thiết kế mồi phản ứng dò đột biến của gen ldlr và apob gây tăng cholesterol máu có tính gia đình nghiên cứu khoa học

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA XÉT GIẢI THƯỞNG CẤP TRƯỜNG KHẢO SÁT IN SILICO – THIẾT KẾ MỒI PHẢN ỨNG DÒ ĐỘT BIẾN CỦA GEN LDLR H T R APOB G T NG T NH GI Đ NH Thuộc nhóm ngành khoa học: Y dược TP Hồ Chí Minh, tháng 04/2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA XÉT GIẢI THƯỞNG CẤP TRƯỜNG KHẢO SÁT IN SILICO – THIẾT KẾ MỒI PHẢN ỨNG DÒ ĐỘT BIẾN CỦA GEN LDLR H T R APOB G T NG T NH GI Đ NH Thuộc nhóm ngành khoa học: dược Sinh viên thực hiện: Nguyễn Trà My (trưởng nhóm) Nam, nữ: Nữ Dân tộc: Kinh Lớp, khoa: SH09A1, Công Nghệ Sinh Học Năm thứ:4/4 Ngành học: Công Nghệ Sinh Học Sinh viên thực hiện: Lê Thị Đan Diễm Nam, nữ: Nữ Dân tộc: Kinh Lớp, khoa: SH09A1, Công Nghệ Sinh Học Ngành học: Công Nghệ Sinh Học GVHD: PGS TS Lê Huyền Ái Thúy TP Hồ Chí Minh, tháng 04/2013 Năm thứ:4/4 MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC BẢNG iii DANH MỤC HÌNH VẼ iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI vi THÔNG TIN VỀ SINH VIÊN CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI x Phần I MỞ ĐẦU 12 I.1 TỔNG QUAN VỀ TĂNG CHOLESTEROL MÁU GIA ĐÌNH3 I.2 TỔNG QUAN VỀ GENE LDLR I.3 TỔNG QUAN VỀ GENE APOB I.4 TỔNG QUAN VỀ CÁC KỸ THUẬT PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN Phần II VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 II VẬT LIỆU 12 II PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 II.2.1.Khai thác liệu: .12 II.2.2.Khảo sát in silico – thiết kế mồi: 12 II.2.3.Khảo sát in vitro 12 II.2.3.1 Tách chiết DNA 12 a Nguyên tắc: 12 b Thiết bị hóa chất 13 c Các bƣớc tiến hành 13 II.2.3.2 Kiểm tra chất lượng DNA thu nhận: 14 Mục lục a Nguyên tắc: 14 b Thiết bị hóa chất 14 c Các bƣớc tiến hành: 14 II.2.3.3 Phản ứng PCR 14 a Thiết bị, hóa chất: 14 b Các bƣớc tiến hành: 14 II.2.3.4 Phương pháp điện di 16 a Nguyên tắc: 16 b Thiết bị hóa chất: 16 c Các bƣớc tiến hành: 16 Phần III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17 III.1 KHAI THÁC DỮ LIỆU: 18 III.2 KHẢO SÁT IN SILICO – THIẾT KẾ MỒI: 26 III.3 CÁC KHẢO SÁT THỰC NGHIỆM 29 III.3.1 Tách chiết DNA 29 III.3.2 Phản ứng PCR giải trình tự exon gen LDLR .29 III.3.3 Phản ứng AS – PCR phát đột biến R3500Q gen APOB 34 Phần IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40 IV.1 KẾT LUẬN 41 IV.2 KIẾN NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC SỐ 1: BẢNG CHỈ SỐ LÂM SÀNG 20 MẪU BỆNH PHẨM57 PHỤ LỤC SỐ 2: KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ EXON GEN LDLR MỘT SỐ MẪU 58 PHỤ LỤC SỐ 3: KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ TẠI CODON 3500 GEN APOB TRÊN MỘT SỐ MẪU 68 Mục lục DANH MỤC BẢNG PHẦN I MỞ ĐẦU PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Bảng II Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi LDLR 15 Bảng II Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR với cặp mồi LDLR 15 Bảng II Thành phần phản ứng PCR với mồi APOB 15 Bảng II Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR với mồi APOB 16 PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Bảng III Bảng thống kê loại mẫu sử dụng nghiên cứu 18 Bảng III Bảng tổng hợp loại đột biến exon gen LDLR từ nghiên cứu giới 22 Bảng III Bảng tỷ lệ tổng đột biến exon gen LDLR thống kê ANOVA tổng đột biến exon gen LDLR châu lục thê giới 24 Bảng III Bảng tổng hợp loại đột biến gen APOB 25 Bảng III Bảng mồi sử dụng nghiên cứu 28 Bảng III Chỉ số OD 20 mẫu máu tách chiết .29 Bảng III Tổng kết kết giải trình tự exon gen LDLR 32 Bảng III Kết giải trình tự sản phẩm AS – PCR gen APOB 37 Mục lục iii DANH MỤC HÌNH VẼ PHẦN I MỞ ĐẦU Hình I Vị trí gen LDLR nhiễm sắc thể số 19 Hình I Vị trí gen APOB nhiễm sắc thể số PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Hình III Biểu đồ thể tỷ lệ loại đột biến exon intron gen LDLR 20 Hình III Các vùng chức thụ thể LDLR 21 Hình III Vị trí cặp mồi giải trình tự exon gen LDLR .28 Hình III Vị trí cặp mồi AS – PCR phát đột biến R3500Q gen APOB 28 Hình III Kết điện di sản phẩm PCR với mồi LDLR nhiệt độ lai 540C 30 Hình III Kết điện di sản phẩm PCR với mồi LDLR nhiệt độ lai 680C .31 Hình III Kết diện di sản phẩm PCR 10 mẫu với mồi APOB 34 Hình III Kết điện di sản phẩm PCR với DNA pha loãng 15 lần 35 Hình III Kết điện di sản phẩm PCR lặp lại, với DNA pha lỗng 15 lần .36 Hình III 10 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi AS – PCR thực lần riêng biệt Chứng dương DNA chạy với mồi khuếch đại bên 38 Mục lục iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT APOB : Apolipoprotein B – 100 ARH : Autosomal Recessive Hypercholesterolemia ASOs : Allele – Specific Oligonucleotides cDNA : Complementary DNA CHD : Coronary Heart Disease DGGE : Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DHPLC : Denaturing High Performance Liquid Chromatography FDB: : Familial Defective Apolipoprotein B FH : Familial Hypercholesterolemia HEX – SSCP : Heteroduplex Single Strand Conformation Polymorphism IDLs: : Intermediate – Density Lipoproteins IDOL : Inducible Degrader of the LDLR LDL – C : Low Density Lipoprotein Cholesterol LDLR : Low Density Lipoprotein Receptor LDLRAP1 : LDLR adaptor protein LDLs: : Low – Density Lipoproteins MAPH : Multiplex Amplifiable Probe Hybridization MLPA : Multiplex Ligation – dependent Probe Amplification NCBI: : National Center Biotechnology Information NICE: : National Institute for Health and Clinical Excellence NST : Nhiễm sắc thể PCSK9 : Proprotein Convertase Subtilin/Kexin QMFSP : Quantitative Multiplex PCR Methodology RT – PCR : Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction SRE : Steroid Response Element SREBP : Steroid Response Element Binding Protein SSCP : Single – Strand Conformation Polymorphism UPQFM – PCR : Universal Primer Quantitative Fluorescent VLDLs : Very Low – Density Lipoproteins Mục lục v BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Thông tin chung:  Tên đề tài: Khảo sát in silico – thiết kế mồi phản ứng dò đột biến gen LDLR APOB gây tăng cholesterol máu có tính gia đình  Sinh viên thực hiện: Nguyễn Trà My (trƣởng nhóm)  Lớp: SH09A1 Khoa: CNSH Năm thứ: Số năm đào tạo:  Sinh viên thực hiện: Lê Thị Đan Diễm  Lớp: SH09A1 Khoa: CNSH Năm thứ: Số năm đào tạo:  Ngƣời hƣớng dẫn: PGS TS LÊ HUYỀN ÁI THÚY Mục tiêu đề tài: Mục tiêu lớn đề tài hƣớng tới việc hiểu chế phân tử bệnh cao cholesterol máu có yếu tố gia đình ngƣời bệnh Việt Nam, bệnh mà hệ lụy bệnh lý tim mạch, đột quỵ,…vvv, gia tăng số lƣợng ngƣời mắc bệnh nhƣ trẻ hóa độ tuổi bệnh nhân Trong khuôn khổ đề tài NCKH sinh viên, mục tiêu đề tài tóm gọn lại mục tiêu lớn nói trên, tập trung hai gen LDLR APOB – sát nữa, vùng nóng (hot spot) hay đột biến trội hai gen dẫn đến bệnh Trên sở hiểu chế phân tử này, mục tiêu đề xây dựng quy trình kỹ thuật nhằm phát đột biến hai gen này, ứng dụng tầm sốt bệnh cao cholesterol máu có yếu tố gia đình, hỗ trợ cho công tác điều trị, hay cung cấp thông tin (di truyền) nhằm tƣ vấn cho bệnh nhân có nguy mắc bệnh cách phịng ngừa bệnh, áp dụng chế độ ăn uống, tập thể dục hợp lý để tránh nguy dẫn đến bệnh di truyền gen trội, nhiễm sắc thể thƣờng quy định Tính sáng tạo: Đây cơng trình nghiên cứu chế phân tử bệnh cao cholesterol máu có yếu tố gia đình Việt Nam Chính vậy, thơng tin cung cấp thông tin vi bệnh ngƣời Việt Nam Chúng tơi tập trung gen, vùng nóng gen (nơi mang nhiều đột biến nhất) hay đột biến trội gen (xuất nhiều, đột biến xuất làm ảnh hƣởng trực tiếp đến chức protein nguyên trực tiếp dẫn đến bệnh), với phƣơng pháp dễ tiếp cận nhƣ PCR – giải trình tự, Allele Specific PCR nhằm dễ dàng triển khai ứng dụng sau Kết nghiên cứu: Trong bƣớc đầu thực đề tài, chúng tơi hồn thành việc xây dựng sở khoa học cho đề tài: bƣớc khai thác liệu đƣợc thực công phu, tỉ mỉ, số liệu cập nhật đến tháng 1/2013, khẳng định: việc bắt đầu tìm hiểu chế bệnh cao cholesterol máu có yếu tố gia đình liên quan đến hai gen LDLR APOB hồn tồn đáng, gen gen chủ yếu liên quan đến bệnh Trong hai gen, LDLR, exon exon tập trung đột biến đa dạng cao nhất, vƣợt trội so với gen khác; hay APOB, đột biến điểm R3500Q exon 26 gen đột biến đƣợc cơng bố chủ yếu Khẳng định tính hợp lý việc xuất đột biến nêu chúng liên quan đến chức năng: làm hỏng hoàn toàn gần nhƣ hoàn toàn khả gắn kết chất mang cholesterol thụ thể, cholesterol bị thải hồi không mong muốn vào máu dẫn đến bệnh Các mồi cho phƣơng pháp tiếp cận thực nghiệm: PCR – Giải trình tự (ứng với gen LDLR) Allele Specific PCR (ứng với gen APOB) đƣợc xác định, kiểm tra đầy đủ thông số vật lý, tính đặc hiệu mồi Thực nghiệm đƣợc triển khai 20 mẫu máu đƣợc bác sĩ BV Đa khoa Khu Vực Thủ Đức cung cấp (với số lâm sàng cho thấy cao cholesterol máu), ghi nhận tính đặc hiệu mồi phản ứng PCR, với nhiệt độ lai thích hợp; kết giải trình tự hai gen Allele Specific PCR gen APOB ghi nhận đột biến (đã công bố xuất mới) ngƣời bệnh Việt Nam Đột biến đa dạng kiểu, nhiều số lƣợng bƣớc đầu đƣợc ghi nhận Đóng góp mặt kinh tế – xã hội, giáo dục đào tạo, an ninh, quốc phòng khả áp dụng đề tài: vii Tuy kết thực nghiệm bƣớc đầu, nhƣng hồn tồn có đầy đủ sở khoa học để tiếp tục nghiên cứu mức cao hơn: tăng cỡ mẫu thực hiện, so sánh với tiêu lâm sàng, để rút đặc điểm bệnh ngƣời Việt Nam Dự đoán đột biến vừa đƣợc phát đề tài dấu chứng (marker) phân tử quan trọng, tiềm bệnh, ứng dụng tầm sốt bệnh cao cholesterol máu có yếu tố gia đình, hỗ trợ cho cơng tác điều trị, hay cung cấp thông tin (di truyền) nhằm tƣ vấn cho bệnh nhân có nguy mắc bệnh cách phòng ngừa bệnh, áp dụng chế độ ăn uống, tập thể dục hợp lý để tránh nguy dẫn đến bệnh di truyền gen trội, nhiễm sắc thể thƣờng quy định điều mà hƣớng đến để phục vụ cộng đồng Công bố khoa học sinh viên từ kết nghiên cứu đề tài (ghi rõ tên tạp chí có) nhận xét, đánh giá sở áp dụng kết nghiên cứu (nếu có): Ngày 18 tháng 04 năm 2013 Sinh viên chịu trách nhiệm thực đề tài (kí, họ tên) Nguyễn Trà My viii Khảo sát in silico – thiết kế mồi phản ứng dò đột biến củ gen D APO g y tăng chole te ol máu có t nh gi đ nh mutations (C292X; Q363X; D365E & C660X) in Cyprus”, Mutation in Brief #302 Online [101] Nissen H, Hansen PS, Faergeman O, Horder M (1995), “Mutation Screening of the Codon 3500 Region of the Apolipoprotein B Gene by Denaturing Gradient – Gel Electrophoresis”, Clin Chem, 41:419 – 23 Tài liệu tham khảo 56 Khảo sát in silico – thiết kế mồi phản ứng dò đột biến củ gen D APO g y tăng chole te ol máu có t nh gi đ nh PHỤ LỤC SỐ 1: BẢNG CHỈ SỐ LÂM SÀNG 20 MẪU BỆNH PHẨM STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 KÍ HIỆU MẪU 8881 8879 9675 9677 9035 9615 8880 9024 8845 9676 9014 8875 9013 8876 9012 8899 8873 9010 9011 8862 CHOLESTEROL TRIGLYCERIDE 6.11 2.54 5.89 3.86 6.32 2.72 6.48 2.35 6.41 2.31 5.84 2.51 5.33 1.98 6.09 2.12 6.27 2.51 7.31 1.37 5.88 2.09 5.5 2.08 6.24 1.9 6.45 2.18 5.84 1.81 6.36 1.92 5.89 1.37 5.87 1.65 7.05 1.83 6.93 1.71 CHOLESTEROL TRIGLYCERIDE 3.9 - 5.2 0.46 - 1.88 Tài liệu tham khảo HDL 0.9 - 2.5 HDL 0.68 0.86 0.62 0.99 0.98 0.85 0.91 1.09 1.14 1.22 1.19 0.98 0.63 1.37 1.33 0.79 1.05 1.49 0.85 0.95 LDL 4.28 3.28 4.46 4.42 4.41 3.85 3.52 4.04 3.99 5.47 3.74 3.57 3.29 4.09 3.69 4.7 4.22 3.63 5.37 5.2 LDL ĐƠN VỊ