PHÂN TÍCH TÍNH đa HÌNH (TG)(T)n và một số đột BIẾN của GEN CFTR TRÊN BỆNH NHÂN bất sản ỐNG dẫn TINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ Y TẾ *** DƯƠNG THỊ HẢI VÂN PHÂN TÍCH TÍNH ĐA HÌNH (TG)(T)n VÀ MỘT SỐ ĐỘT BIẾN CỦA GEN CFTR TRÊN BỆNH NHÂN BẤT SẢN ỐNG DẪN TINH LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC HÀ NỘI – 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI *** BỘ Y TẾ DƯƠNG THỊ HẢI VÂN PHÂN TÍCH TÍNH ĐA HÌNH (TG)(T)n VÀ MỘT SỐ ĐỘT BIẾN CỦA GEN CFTR TRÊN BỆNH NHÂN BẤT SẢN ỐNG DẪN TINH Chuyên ngành : Y sinh học di truyền Mã số : 62720301 LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: Ts.Bs.LƯƠNG THỊ LAN ANH HÀ NỘI – 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi Dương Thị Hải Vân, bác sĩ nội trú khóa XXXIX Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Y sinh học di truyền, xin cam đoan: Đây luận văn thân trực tiếp thực hướng dẫn Ts.Bs Lương Thị Lan Anh Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thông tin nghiên hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, Ngày… tháng….năm 2017 Người viết cam đoan MỤC LỤC Lời cảm ơn Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng, biểu, sơ đồ, hình vẽ ĐẶT VẮN ĐỀ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Không để bảng CFTR CBAVD ACMG CFTR- RDs DNA WHO mPCR : : Cystic fibrosis transmembrane conductance regular - Điều hòa vận chuyển màng bệnh xơ nang Congenital bilateral aplasia of the vas deferens - Bất sản ống dẫn tinh American College Medical Genetics - Đại học y khoa di truyền Hoa Kỳ Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator related disorder - Rối loạn liên quan tới gen CFTR Deoxyribonucleic acid World heath organization – Tổ chức y tế giới Mutilplex polymerase chain reaction – Phản ứng khuếch đại chuỗi DANH MỤC BẢNG Cách dòng nhiều q DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ Cách dòng nhiều ĐẶT VẤN ĐỀ Bất sản ống dẫn tinh tình trạng ống dẫn tinh khơng hình thành đầy đủ từ lúc trước sinh Bệnh lý xuất bên hai bên ống dẫn tinh [1],[2] Bất sản ống dẫn tinh chiếm khoảng 1-2% vô sinh nam chiếm 6% số nam giới vơ sinh khơng có tinh trùng[3], theo Rapour cộng bất sản ống dẫn tinhcó thể chiếm tới 10% nam giới khơng có tinh trùng[4].Ngun nhân gây bệnh phần lớn bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh có liên quan đến đột biến gen điều hòa vận chuyển màng CFTR bệnh xơ nang –một bệnh di truyền gen lặn nhiễm sắc thể[1],[2].Hơn 95% trường hợp bệnh nhân xơ nang có kèm bất sản ống dẫn tinh[5].Bất sản ống dẫn tinh xếp vào nhóm rối loạn có liên quan đến gen CFTR ( CFTR- RDs)[6] Nghiên cứu đột biến kiểu gen đa hình gen CFTR bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh thực nhiều nước phương Tây Tuy nhiên, Đông Nam Á, nghiên cứu bệnh lý Điều tỉ lệ mang gen bệnh cộng đồng khu vực thấp hạn chế điều kiện, khả thực Theo thống kê Đại học Di truyền Y học Hoa Kỳ (ACMG), người Mỹ gốc Á, tỉ lệ người mang gen bệnh xơ nang CFTR 1/ 8780 tỉ lệ sinh trẻ bị bệnh 1/ 35100 [7] Thống kê nghiên cứu CFTR châu Á, đặc biệt Việt Nam chưa nhiều Để góp phần tìm hiểu đột biến gen CFTR bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh, thực đề tài “Phân tích đa hình (TG)m(T)n số đột biến gen CFTRtrên bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh” nhằm mục tiêu sau: Xác định tỉ lệ đa hình (TG)m (T)n intron số đột biến khác gen CFTR bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh Mô tả tương quan (TG)m (T)n số đột biến gen CFTR bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh 10 Chương TỔNG QUAN 1.1 1.1 Bất sản ống dẫn tinh 1.1.1 1.1.1 Khái niệm Bất sản ống dẫn tinh tình trạng ống dẫn tinh khơng hình thành đầy đủ từ lúc trước sinh Bệnh lý xuất bên hai bên ống dẫn tinh [1, 2] 1.1.2 1.1.2 Dịch tế học Tỷ lệ bất sản ống dẫn tinh chiếm khoảng 1-2% vô sinh nam tới 6% nam giới vô sinh tinh trùng [3] Theo tác giả Radpour cộng sự, tỉ lệ bất sản ống dẫn tinh lên đến 10% nam giới khơng có tinh trùng [4] Tại Việt Nam, nghiên cứu Lê Thế Vũ cộng nguyên nhân gây vô sinh nam cho thấy tỉ lệ bất sản ống dẫn tinh chiếm 1% nam giới khơng có tinh trùng [8] Nghiên cứu đặc điểm tinh dich đồ 1000 cặp vợ chồng cho thấy vơ sinh khơng có tinh trùng chiếm 8% Nghiên cứu Trần Văn Sắc, Trần Đức Phấn đặc điểm tinh dịch đồ lâm sàng bệnh nhân vô sinh nặng, thiểu tinh… 1.1.3 1.1.3 Đặc điểm lâm sàng bất sản ống dẫn tinh Bất sản ống dẫn tinh xuất bệnh lý đơn độc nam giới triệu chứng kèm với bệnh xơ nang.Đây bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường tuyến nhầy, gây tổn thương tiến triển hệ thống hơ hấp bệnh hệ tiêu hóa mạn tính Hơn 95% nam giớixơ nang bị vơ sinh khơng có tinh trùng gây khơng có, thiểu sản hay xơ hóa cấu trúc ống Wolffian xảy từ thời kì bào thai [5] 33 Trình tự gen bệnh nhân thực phân tích tự động máy Applied Biosystems 3500 phần mềm 3500 series Software Hình 2-2: Máy giải trình tự tự động Biosystems 3500 Đọc kết quả: Trình tự gốc xơ nang lấy nguồn http://asia.ensembl.org/ Bằng cách sử dụng phần mềm bioedit 7.1,trình tư gốc instron8 exon 10 dùng để so sánh với trình tự gốc để phát đột biến bệnh nhân Phải đưa mã trình tự gen gốc NCBI để so sánh 34 Chương DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Đặc điểm chung nam giới khơng có tinh trùng??? đối tượng nghiên cứu 3.1.1 Phân bố theo tuổi Bảng 3-8: Đặc điểm phân bố tuổi bệnh nhân nam giới bất sản ống dẫn tinh Tuổi Số mẫu( n) 40 Tổng số Nhận xét: Tỉ lệ % 3.1.2 Đặc điểm tinh dịch nam giới khơng có tinh trùng ?? Sử dụng cân để đo trọng lượng từ tính thể tích tinh dịch bệnh nhân tham gia nghiên cứu, thu thập kết phân chia thành nhóm bệnh nhân: • • • Nhóm 1:< 1ml Nhóm 2: 1- 1,5 ml Nhóm 3: > 1,5ml Bảng 3-9: Phân bố thể tích tinh dịch nam giới bất sản ống dẫn tinh Nhận xét: 3.1.3 Độ PH tinh dịch nam giới khơng có tinh trùng ??? Bảng 3-10: Đặc điểm pH nam giới bất sản ống dẫn tinh Độ pH N < 7,2 ≥7,2 Tổng số Nhận xét: Tỷ lệ (%) 35 3.2 Đặc điểm đa hình (TG)m(T)n số đột biến gen CFTR khác bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh 3.2.1 Đặc điểm tính đa hình (TG)m(T)n bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh Bảng 3-11: Phân bố kiểu gen đa hình (TG)m(T)n bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh (TG)11 (TG)12 (TG)13 Tổng số Tỷ lệ (%) 5T 7T 9T Tổng số Nhận xét: 3.2.2 Đặc điểm đa hình M470V Hình 3-3: Phân bố tính đa hình M470V Nhận xét:………… 3.2.3 Đặc điểm loại đột biến gen CFTR khác Đặc điểm số lượng đột biến gen CFTR bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh Bảng 3-12: Tỉ lệ phát đột biến gen CFTR bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh Đột biến CFTR đột biến đột biến đột biến ≥3 đột biến Tổng số Nhận xét: n Tỷ lệ % Đặc điểm phân bố loại đột biến gen CFTR Bảng 3-13: Phân bố loại đột biến Đột biến gen CFTR n Tỉ lệ 36 del21kb L138ins 3944delTG delF508 delI507 1677delTA 2143delT 2184insA 394delTT 3821delT 604insA Tổng số Nhận xét:……………………………… Đặc điểm kết hợp đa hình (TG)m(T)n đột biến gen CFTR khác Bảng 3-14: Bảng phân bố đa hình (TG)m(T)n đột biến CFTR khác Kiểu đa (TG)m(T)n hình Đột biến gen CFTR khác kết hợp n Tỉ lệ (TG)11(T)5 (TG)12(T)5 (TG)13(T)5 …… Tổng số Nhận xét: 3.3 Đặc điểm mối tương quan đa hình (TG)m(T)5 đột biến gen CFTR khác Bảng 3-15: Tương quan đa hình (TG)m(T)5 đột biến CFTR khác Đột biến gen CFTR del21kb L138ins … Tổng số Kiểu đa hình (TG)m(T)n (TG)11T5 (TG)12(T)5 (TG)13(T)5 R p 37 38 Chương DỰ KIẾN BÀN LUẬN 4.1 Đặc điểm chung bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh • • Đặc điểm tuổi Đặc điểm tinh dịch đồ: thể tích tinh dịch, pH, fructose tinh dịch 4.2 Đặc điểm đa hình (TG)m(T)n số đột biến CFTR • • Đặc điểm đa hình (TG)m(T)n Đặc điểm số đột biến gen CFTR 4.3 Mối liên quan đa hình (TG)m(T)n đột biến gen CFTR khác 4.4 39 DỰ KIẾN KẾT LUẬN 40 DỰ KIẾN KIẾN NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 10 11 12 13 14 15 16 17 Ana Grangeia, et al., Molecular characterization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene in congenital absence of the vas deferens Genetics in Medicine, 2007 9: p 163–172 T.J McCallum, et al., Unilateral renal agenesis associated with congenital bilateral absence of the vas deferens: phenotypic findings and genetic considerations Human reproduction, 2001 16(2): p 282- 288 Wang, Z., Milunsky, J., Yamin, M., Maher, T., Oates, R & Milunsky, A, Analysis by mass spectrometry of 100 cystic fibrisis gene mutations in 92 patients with congenital bilateral absence of the vas deferens Human reproduction, 2002 17: p 2066-2072 Ramin Radpour, et al., Correlation Between CFTR Gene Mutations in Iranian Men With Congenital Absence of the Vas Deferens and Anatomical Genital Phenotype Journal of Andrology, 2008 29(1): p 35-40 SM, M., et al., CFTR-Related Disorders 2001 Bombieri, C., et al., Recommendations for the classification of diseases as CFTR-related disorders Journal of Cystic Fibrosis, 2011 10, Supplement 2: p S86-S102 Jean Amos, et al., American College of Medical Genetics STANDARDS AND GUIDELINES FOR CLINICAL GENETICS LABORATORIES 2008 Vũ, L.T and N.Đ Hinh, Nghiên cứu số nguyên nhân vô sinh nam 2009, Đại học Y Hà Nội: Hà Nội M, C., et al., Mutions in the cystic fibrosis gene in patients with congenital absence of vas defenens 1995 Els Dequeker, et al., Best practice guidelines for molecular genetic diagnosis of cystic fibrosis and CFTR-related disorders – updated European recommendations Eur J Hum Genet, 2009 17(1): p 51-65 M, C., Molecular pathology of the CFTR locus in male infertility Reproductive biomedicine online, 2005 10(1): p 14-41 C Bombieri, et al., Recommendations for the classification of diseases as CFTR-related disorders Journal of Cystic Fibrosis 2011 10(2): p 86-102 Listens, W., et al., Cystic fibrosis and infertility caused by congenital bilateral absense of vas deferens and related clinical entities Human reproduction, 1996 11(46): p 55 -80 Ni, W.-H., et al., The CFTR polymorphisms poly-T, TG-repeats and M470V in Chinese males with congenital bilateral absence of the vas deferens Asian Journal of Andrology, 2012 14: p 687–690 Hợp, T.V and T.Đ Phấn, Hoàn chỉnh Kỹ thuật xác định đột biến gen CFTR nam giới khơng có tinh trùng 2015, Đại học Y Hà Nội: Hà Nội Mai H Nam, et al., Variations of the CFTR gene in the Hanoi-Vietnamese, in Am J Med Genet A 2005 p 249-53 Massie RJ, et al., Intron-8 polythymidine sequence in Australasian individuals with CF mutations R117H and R117C Eur Respir J, 2001 17: p 1195–2000 42 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Kiesewetter S, et al., A mutation in CFTR produces different phenotypes depending on chromosomal background Nat Genet, 1993 5: p 274–8 Chmiel JF, et al., Pitfall in the use of genotype analysis as the sole diagnostic criterion for cystic fibrosis Pediatrics, 1999 103: p 823–6 Radpour, R., et al., Molecular study of (TG)m(T)n polymorphisms in Iranian males with congenital bilateral absence of the vas deferens Journal of Andrology, 2007 28(4): p 541546 Du, Q., et al., The CFTR M470V, Intron Poly-T, and TG- repeats detection in Chinese Males with congenital bilateral absence of vas deferens Biomed research international, 2014 Xu, X., et al., Meta-analyses of CFTR variants associated with the risk of the congenital bilateral absence of the vas deferens J Clin Bioinforma, 2014 4: p 11 WHO, WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen 2010 Audrézet MP, et al., Genomic rearrangements in the CFTR gene: extensive allelic heterogeneity and diverse mutational mechanisms Hum Mutat 2004 23: p 343–357 Hantash FM, et al., Novel and recurrent rearrangements in the CFTR gene: clinical and laboratory implications for cystic fibrosis screening Hum Genet, 2006 17: p 1–11 Niel F, et al., Rapid detection of CFTR gene rearrangements impacts on genetic counselling in cystic fibrosis J Med Genet 2004 41: p e118 C Bombieri , et al., Frequency of large CFTR gene rearrangements in Italian CF patients Eur J Hum Genet 2005 13: p 687–689 C, F., C T, and C.N.e al, Gross genomic rearrangements involving deletions in the CFTR gene: characterization of six new events from a large cohort of hitherto unidentified cystic fibrosis chromosomes and meta-analysis of the underlying mechanisms Eur J Hum Genet, 2006 14: p 567–576 Ratbi I, et al., Detection of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene rearrangements enriches the mutation spectrum in congenital bilateral absence of the vas deferens and impacts on genetic counselling Hum Reprod, 2007 22: p 1285– 1291 HS Chiang, et al., CFTR (TG)m(T)n polymorphism in patients with CBAVD in a population expressing low incidence of cystic fibrosis Clinical genetics, 2009 76(3): p 282-6 43 PHỤ LỤC BỆNH ÁN NGHIÊN CỨU Số thứ tự……………………………… Mã bênh án………………………… ngày xét nghiệm:…………………… I HÀNH CHÍNH: Họ tên:…………………………………… tuổi:……………… Địa chỉ:………………………………………………………………………………………… Nghề nghiệp:…………………………………………………… Số điện thoại:……………………………………………………………………… II CHUYÊN MÔN: 2.1 Tiền sử: Gia đình:……………………………………………………………………………………………… Phả hệ: Nội khoa…………………………………………………………………………………………… Ngoại khoa…………………………………………………………………………… Sinh sản: Chậm con:………… năm Điều trị can thiệp:…………………………………………………… Quai bị: có/ khơng Mấy tuổi:…………… ……………………………………………………………………………………… 44 Người vợ:……………………………………………………………… II.2 Thăm khám: Bìu :………………………………………………………………………………… Mào tinh hoàn…………………………………………………………………………… ống dẫn tinh:…………………………………………………………………………… tinh hoàn:……………………………………………………………………………… II.3 Xét nghiệm: II.3.1 Tinh dịch đồ: Chỉ số Lần1(……./……./………… ) Thể tích pH Mật độ Tổng số tinh trùng II.3.2 Xét nghiệm fructose- kẽm: Lần 2(…./… /…… ) Chỉ số Fructose Kẽm II.3.3 Lần Lần Tinh hoàn trái Tinh hồn phải Siêu âm bìu Chỉ số Có Thể tích Mào tinh hồn: ……………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………… ……… ống dẫn tinh: ……………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………… … II.3.4 Siêu âm ổ bụng: Bình thường/ bât thường ……………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………… …………… II.3.5 Siêu âm qua trực tràng: Túi tinh: có/ khơng…………………………………………………………………………… 45 ống dẫn tinh: có/ khơng………………………………………………………………………… II.4 Xét nghiệm đột biến CF: ……………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………… …………… II.5 Xét nghiệm NST:……… II.6 Xét nghiệm ZFY:…………………… 46 PHỤ LỤC 2: DANH SÁCH BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU 47 PHỤ LỤC 3: KÍ HIỆU TRÌNH TỰ ACID AMIN Tên acid amin Glycine Histidine Isoleucine Lysine Leucine Methionine Asparagine Proline Glutamine Arginine Serine Threonine Valine Tryptophan Tyrosine Mã chữ G H I K L M N P Q R S T V W Y Mã ba chữ Gly His Ile Lys Leu Met Asn Pro Gln Arg Ser Thr Val Trp Tyr Bộ ba mã hóa ... đột biến gen CFTR liên quan đến bất sản ống dẫn tinh Đột biến gen CFTR gây bệnh nam giới bất sản ống dẫn tinh khác biệt so với đột biến gen CFTR tìm thấy bệnh nhân xơ nang Bệnh nhân bất sản ống. .. hình (TG)m(T)n số đột biến gen CFTRtrên bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh nhằm mục tiêu sau: Xác định tỉ lệ đa hình (TG)m (T)n intron số đột biến khác gen CFTR bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh Mô tả... bất sản ống dẫn tinh liên quan với bệnh xơ nang đột biến gen CFTR Hơn 95% nam giới bị xơ nang có kèm bất sản ống dẫn tinh [5] 12 Tuy nhiên, kiểu đột biến gen CFTR bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh