Luận văn thạc sĩ nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học một số loài thực vật thuộc chi agrimonia họ hoa hồng rosaceae

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HOÁ HỌC HỒ ĐẮC HÙNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT THUỘC CHI AGRIMONIA HỌ HOA HỒNG (ROSACEAE) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - năm 2013 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HOÁ HỌC HỒ ĐẮC HÙNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT THUỘC CHI AGRIMONIA HỌ HOA HỒNG (ROSACEAE) Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 60 44 27 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Phạm Gia Điền Hà Nội – năm 2013 LỜI CẢM ƠN Bản luận văn hồn thành phịng Cơng nghệ chất có hoạt tính sinh học-Viện Hóa học-Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Phạm Gia Điền, Trưởng phịng Cơng nghệ chất có hoạt tính sinh học người ủng hộ, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập làm luận văn, người thầy hướng dẫn tơi hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn TS Bùi Kim Anh tận tình bảo, giúp đỡ trình làm luận văn, cảm ơn nhà thực vật học Nguyễn Kim Đào việc thu hái mẫu định tên Xin cảm ơn đồng nghiệp thuộc phịng Cơng nghệ chất có hoạt tính sinh học-Viện Hóa học động viên giúp đỡ nhiều Nhân dịp này, tơi xin bày tỏ kính trọng cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Hóa học tới thầy giáo Khoa Hóa - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc Gia Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho học tập hoàn thành luận văn Hà nội, ngày tháng năm 2013 Hồ Đắc Hùng NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN IR Phổ hồng ngoại EI-MS Phổ khối ion hóa va chạm electron H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer HMBC Phổ tương quan 1H-13C xa HSQC Phổ tương quan 1H-13C gần sử dụng kỹ thuật đo HSQC s Singlet d Duplet dd Duplet duplet m Multiplet t Triplet J (Hz) Hằng số tương tác tính Hz δ (ppm) Độ chuyển dịch hóa học tính ppm MeOH Metanol EtOH Etanol ppm Phần triệu Hz Hertz IC50 Nồng độ cần thiết hoạt chất ức chế 50% tăng sinh invitro MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN ii MỤC LỤC iii Mở đầu Chƣơng I: TỔNG QUAN 1.1 Vài nét thực vật chi Long nha thảo (Agrimonia) 1.2 Một số kết nghiên cứu hóa thực vật chi Agrimonia 1.2.1 Các hợp chất flavonoit 1.2.2 Các hợp chất tecpenoit 10 1.2.3 Các hợp chất khác 11 Một số kết nghiên cứu hoạt tính sinh học chi 12 Agrimonia 2.1 Cơng dụng số lồi thực vật chi Agrimonia đƣợc sử dụng 12 y học dân tộc Việt Nam: 2.2 Những nghiên cứu nƣớc hoạt tính sinh học thực 13 vật chi Agrimonia : CHƢƠNG ĐỒI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Đối tƣợng, nhiệm vụ nghiên cứu: 17 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu: 17 2.2.1 Phương pháp phân lập hợp chất: 17 2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất: 18 2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học: 18 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19 3.1 Đặc điểm thực vật Long nha thảo (Agrimonia pilosa 19 Ledeb.) 3.2 Chiết xuất phân lập hợp chất 19 3.2.1 Thu hái xử lý mẫu thực vật: 19 3.2.2 Sơ đồ phân lập chiết tách mẫu thực vật 20 3.3 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất: 23 3.4 Kết khảo sát hoạt tính sinh học cặn dịch chiết từ Long nha thảo: 3.4.1 Hoạt tính chống oxi hóa (antioxidant activity) 36 3.4.2 Hoạt tính độc tế bào (Cytotoxic activity) 37 3.4.3 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (antimicrobial activity) 38 CHƢƠNG IV: THỰC NGHIỆM 40 4.1 Dụng cụ thiết bị nghiên cứu: 40 4.2 Dung mơi hóa chất: 40 4.3 Ngun liệu thực vật: 40 4.4 Chiết xuất phân lập: 40 4.4.1 Xử lý mẫu phương pháp chiết tách: 40 4.4.2 Phân lập hợp chất: 41 36 Phân lập chất dịch chiết CH2Cl2 41 Phân lập chất dịch chiết etylaxetat 42 Phân lập cặn dịch chiết butanol 42 4.5 Hằng số vật lý liệu phổ chất thu đƣợc: 43 KẾT LUẬN 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC 55 MỞ ĐẦU Thực vật kho tàng vô phong phú hợp chất thiên nhiên, hàng trăm nghìn hợp chất thiên nhiên tìm nghiên cứu để phục vụ cho nhiều lĩnh vực sống, đặc biệt y học Thiên nhiên không nguồn nguyên liệu cung cấp hoạt chất q để tạo biệt dược mà cịn cung cấp chất dẫn đường để tổng hợp loại thuốc Từ tiền chất phân lập từ thiên nhiên, nhà khoa học chuyển hóa chúng thành hợp chất có khả trị bệnh cao Các kết thống kê gần cho thấy hợp chất đăng ký làm thuốc tồn giới 61% hợp chất thiên nhiên chất có liên quan tới chúng Trong có 6% hợp chất thiên nhiên, 27% dẫn xuất hợp chất thiên nhiên, 5% hợp chất tổng hợp có mang nguyên liệu đầu bắt nguồn từ hợp chất thiên nhiên 23% chất tổng hợp thiết kế sở cấu trúc phân tử thu từ hợp chất thiên nhiên (các chất mô hợp chất thiên nhiên) Trong số lĩnh vực trị liệu có đến 78% hoạt chất dùng làm thuốc kháng sinh 74% hoạt chất dùng làm thuốc chữa ung thư hợp chất thiên nhiên có nguồn gốc từ hợp chất thiên nhiên [*] Việt nam nằm khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa vùng có tính đa dạng sinh học cao Riêng thực vật, Việt Nam có khoảng 12000 lồi, có 2300 lồi thực vật sử dụng làm lương thực, thuốc chữa bệnh… Khoảng 25% loại thuốc sử dụng thông thường xuất phát từ loài thực vật dùng y học dân gian Cây Long nha thảo có tên khoa học: Agrimonia pilosa Ledeb thuộc họ Hoa hồng (Rosaceae) loại thảo sống lâu năm có nguồn gốc vùng Hymalaya, bao gồm Trung quốc Ấn độ Việt Nam Trong y học dân gian Long nha thảo sử dụng làm thuốc cầm máu, chữa thổ huyết, khái huyết (ho máu), nục huyết (đổ máu cam), lỵ phân lẫn máu, sốt rét mụn nhọt lở loét da [1] Các nghiên cứu gần cho thấy, Long nha thảo vị thuốc có phổ tác dụng tương đối rộng, từ chống viêm nhiễm, tăng cường khả miễn dịch thể, có tác dụng ức chế khối u đến khả kháng HIV… quan tâm nghiên cứu nhiều nhà khoa học giới, Việt Nam sử dụng theo kinh nghiệm dân gian chưa nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học Ngoài ra, Long nha thảo mười thành phần vị thuốc nhóm lương y thuộc phòng nghiên cứu thuốc, thuốc dân tộc thuộc Trung Tâm Cơng nghệ Hóa dược hóa sinh hữu - Viện KH & CNVN sử dụng từ năm 2004 điều trị thành công số bệnh nhân nhiễm HIV chuyển sang AIDS Trên sở thuốc nam chúng tơi chọn Long nha thảo làm đối tượng nghiên cứu luận văn với mục đích tìm hiểu thành phần hóa học tác dụng dược lý với nội dung là: Nghiên cứu phân lập hợp chất có Long nha thảo (Agrimonia pilosa Ledeb.) họ hoa hồng (Rosaceae), thu hái Sapa-Lào Cai Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập Khảo sát hoạt tính sinh học phân đoạn dịch chiết chất phân lập [*] David J Newman, Gordon M Cragg, and Kenneth M Snader (2003), “Natural products as sources of new drugs over the periode 1981-2002” J Nat prod 66, pp1022-1037 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Vài nét thực vật chi Long nha thảo (Agrimonia) Chi Long nha thảo (danh pháp khoa học: Agrimonia) chi chứa khoảng 12-15 loài Chi Long nha thảo thuộc họ Hoa hồng (Rosaceae) có nguồn gốc vùng Hymalaya, bao gồm Trung Quốc, Ấn Độ ngồi cịn có khu vực ôn đới Bắc bán cầu, châu Âu châu Phi Theo thống kê loài thuộc chi Agrimonia phân bố giới: - Agrimonia eupatoria (1 loài phân bố Châu Âu, Châu Á, Châu Phi) - A coreana, A nipponica (1 lồi phân bố Đơng Á) - Agrimonia pilosa (1 lồi phân bố Đơng Âu, Châu Á) - Agrimonia procera (1 loài phân bố Châu Âu) - Agrimonia repens (1 loài phân bố Nam Á) - A rostellata, A striata, A gryposepala, A incisa, A microcarpa, A parviflora, A pubescens (7 loài phân bố Bắc Mỹ) Ở Việt Nam có nhiều Lào Cai, Lai Châu, Hà Giang, Cao Bằng, Lạng Sơn, Hịa Bình, Tam Đảo chủ yếu lồi A pilosa [1] 1.2 Một số kết nghiên cứu hóa thực vật chi Agrimonia Thành phần hóa học chi Agrimonia nghiên cứu giới nhiên Việt Nam chưa có nghiên cứu chi Loài A pilosa Ledeb sử dụng thuốc dân gian, chưa nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học Đã có số cơng trình nghiên cứu nhà khoa học Hàn quốc, Trung quốc số loài thực vật thuộc chi Agrimonia Các nghiên cứu thành phần hóa học từ lồi Agrimonia pilosa có mặt hợp chất flavonoid, tritecpen, saponin tanin [2,3,4] có số nghiên cứu cơng bố hoạt tính sinh học từ phần dịch chiết từ thân loài này; đáng ý hoạt tính sinh học kháng khuẩn, chống oxy hóa, hoạt tính ức chế acetylcholinesterase, chống ung thư hoạt tính kháng HIV [5,6 ,7] Thành phần hóa học lồi thuộc chi Agrimonia tecpenoit, flavonoit số hợp chất khác 1.2.1 Các hợp chất flavonoit Flavonoit nhóm hợp chất thường gặp thực vật, có nửa loại rau dùng hàng ngày Flavonoit nhóm hoạt chất lớn dược liệu Phần lớn flavonoit có màu vàng, ngồi cịn có chất màu xanh, tím, đỏ khơng màu Flavonoit có mặt tất phận loài thực vật bậc cao, đặc biệt hoa, tạo cho hoa sắc màu rực rỡ để quyến rũ loại côn trùng giúp cho thụ phấn Trong cây, flavonoit giữ vai trò chất bảo vệ, chống oxy hóa, bảo tồn axít ascorbic tế bào, ngăn cản số tác nhân gây hại cho (vi khuẩn, virus, côn trùng, ) số cịn có tác dụng điều hịa sinh trưởng cối Flavonoit nhóm hợp chất có nhiều tác dụng sinh học Trước hết, dẫn chất flavonoit chất chống xy hóa, có khả bắt gốc tự OH, ROO (là yếu tố gây biến dị, hủy hoại tế bào, ung thư, tăng nhanh lão hóa, ) Đồng thời, flavonoit tạo phức với ion kim loại nên ngăn cản phản ứng oxy hóa mà ion enzym xúc tác Do đó, chất flavonoit có tác dụng bảo vệ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạnh, tai biến mạnh, lão hóa, thối hóa gan, tổn thương xạ Các flavonoit cịn có tác dụng làm bền thành mạch, dùng trường hợp rối loạn chức tĩnh mạnh, trĩ, rối loạn tuần hồn võng mạc, Các chất flavonoit cịn có tác dụng chống độc, làm giảm thương tổn gan, bảo vệ chức gan Nhiều hợp chất flavonoit thuộc nhóm flavon, flavanon, flavanol có tác dụng lợi tiểu rõ rệt có diếp cá, râu mèo, Trên hệ tim mạch, nhiều hợp chất flavonoit quercetin, rutin, myciretin, hỗn hợp catechin trà có tác dụng làm Phụ lục 22a: Phổ 1H-NMR quercitrin Phụ lục 22b: Phổ 1H-NMR quercitrin Phụ lục 23a: Phổ 13C-NMR quercitrin Phụ lục 23b: Phổ 13C-NMR quercitrin Phụ lục 24a: Phổ DEPT quercitrin Phụ lục 24b: Phổ DEPT quercitrin Phụ lục 25a: Phổ 1H-NMR ß-sitosterol Phụ lục 25b: Phổ 1H-NMR ß-sitosterol Phụ lục 26a: Phổ 1H-NMR ß-sitosterol-3-O-ß-D-glucopyranosit Phụ lục 26b: Phổ 1H-NMR ß-sitosterol-3-O-ß-D-glucopyranosit Phụ lục 26c: Phổ 1H-NMR ß-sitosterol-3-O-ß-D-glucopyranosit Phụ lục 27a: Phổ 13C-NMR ß-sitosterol-3-O-ß-D-glucopyranosit Phụ lục 27b: Phổ 13C-NMR ß-sitosterol-3-O-ß-D-glucopyranosit Phụ lục 28a: Phổ DEPT ß-sitosterol-3-O-ß-D-glucopyranosit Phụ lục 28b: Phổ 13C-DEPT ß-sitosterol-3-O-ß-D-glucopyranosit ... chưa nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học Đã có số cơng trình nghiên cứu nhà khoa học Hàn quốc, Trung quốc số loài thực vật thuộc chi Agrimonia Các nghiên cứu thành phần hóa học từ loài. ..ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HOÁ HỌC HỒ ĐẮC HÙNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT THUỘC... Những nghiên cứu nƣớc ngồi hoạt tính sinh học thực vật chi Agrimonia : Đã có số cơng trình nghiên cứu nhà khoa học Hàn quốc, Trung quốc số loài thực vật thuộc chi Agrimonia Các nghiên cứu hoạt tính