(Luận án tiến sĩ) nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng việt nam schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NCS Lê Thị Thơm Đề tài: “NGHIÊN CỨU DẦU SINH HỌC GIÀU AXIT BÉO OMEGA - TỪ CHỦNG VI TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG VIỆT NAM Schizochytrium mangrovei TB17 ĐỂ LÀM THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE CHO CON NGƯỜI” Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 42 01 16 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS TS Đặng Diễm Hồng Hà Nội – 2021 ii Lời cam đoan Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cộng khác Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần công bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả Phần cịn lại chưa cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày tháng Tác giả Lê Thị Thơm năm 20 MỞ ĐẦU Hiện nay, nhu cầu sống đòi hỏi cao giá trị dinh dưỡng người không sử dụng loại dầu ăn thông dụng mà cịn loại dầu đặc sản có giá trị cao (dầu salad, dầu chức năng) để phục vụ cho ăn cao cấp, ngun liệu cho cơng nghiệp thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho người, dược phẩm Các loại dầu từ thực vật chứa axít béo khơng bão hịa có mạch cacbon ≤ 18 Trong loại dầu thực vật dầu lanh, canola đậu tương chứa axit béo không bão hịa đa nối đơi dạng omega-3 (polyunsaturated fatty acid omega 3; PUFAs ω-3) chủ yếu axít α-linolenic (ALA) loại dầu khác dầu bắp, dầu hạt vải, dầu nho…lại chứa chủ yếu PUFAs ω - Đối với loại axít béo ω-3 có số cacbon lớn 20 22 chủ yếu lại có nguồn gốc từ cá biển Nguồn cung cấp axít béo docosahexaenoic (DHA; C22:6) eicosapentaenoic (EPA; C20:5) lồi cá nhiều mỡ cá trích, cá thu cá hồi Tuy nhiên, chất lượng dầu cá biển tự nhiên lại phụ thuộc vào loài cá, mùa vụ vị trí đánh bắt Việc sử dụng dầu PUFAs có nguồn gốc từ cá phần thức ăn, kể cho trẻ nhỏ dược phẩm gặp số bất lợi có mặt tạp nhiễm polychlorinated biphenyls (PCBs) dioxin, kim loại nặng… mùi vị đặc trưng cá gây Hơn nữa, dầu cá biển thực tế hỗn hợp phức tạp axít béo có chiều dài mạch cacbon mức độ chưa bão hoà khác Do vậy, việc tinh chúng khó khăn địi hỏi chi phí tốn trước sử dụng chúng vào mục đích khác nâng cao giá trị sử dụng sản phẩm tạo so với giá trị ban đầu Dầu sinh học giàu PUFAs ω - sản xuất từ số loài vi tảo thu hút quan tâm nghiên cứu dần có vị trí đáng kể, khơng ngừng mở rộng phát triển mạnh mẽ thị trường thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho người, dược phẩm giới nói chung Việt Nam nói riêng Vi tảo biển (VTB) sử dụng với nhiều mục đích khác nhau: khai thác chất có hoạt tính sinh học, để xử lý mơi trường, làm phân bón, nhiên liệu sinh học ứng dụng rộng rãi ni trồng thủy sản (NTTS) với số lồi VTB quang tự dưỡng truyền thống Tuy nhiên, việc nuôi trồng VTB quang tự dưỡng có chi phí cao làm cho giá thành sản xuất sản phẩm từ sinh khối tảo có giá thành đắt, gây hạn chế cho việc thương mại hóa quy mơ lớn Để khắc phục nhược điểm nêu trên, việc tìm kiếm, khai thác ứng dụng loài vi tảo biển dị dưỡng (VTBDD) có chi Schizochytrium thu hút nhiều quan tâm nghiên cứu nhà khoa học ngồi nước cịn mẻ Việt Nam hứa hẹn mang đến nhiều lợi ích thực tiễn cho đời sống người Các lồi VTBDD thuộc chi Schizochytrium có khả tích lũy hàm lượng lipit cao, lên tới 70% sinh khối khô (SKK) hàm lượng -3 PUFAs EPA, DHA chiếm 30-50% so với axít béo tổng số (Total fatty acid - TFA) Vai trò -3 PUFAs nêu chứng minh nhiều khía cạnh phát triển trí não trẻ nhỏ, sức khỏe hệ tim mạch, hệ thần kinh nhiều liệu pháp điều trị bệnh ung thư, trí nhớ, trầm cảm Hiện nay, chi VTBDD Schizochytrium coi ứng cử viên tiềm thay nguồn sản xuất -3 PUFAs truyền thống từ dầu cá Ở Việt Nam, nghiên cứu nhân nuôi sinh khối, tách chiết ứng dụng axít béo từ VTBDD cịn mẻ có nhiều tiềm ứng dụng Chính vậy, chúng tơi thực đề tài “Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega - từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho người” Mục tiêu nghiên cứu luận án Sàng lọc chủng/loài VTBDD tối ưu điều kiện nhân nuôi sinh khối để thu sinh khối giàu axít béo ω - 6; Tối ưu điều kiện tách chiết, tinh bảo quản dầu sinh học giàu axit béo ω - từ loài vi tảo biển dị dưỡng lựa chọn được; Sản xuất viên nang dầu sinh học giàu axít béo ω - có tính an tồn cao đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ, khả học tập viên nang động vật thực nghiệm Một số nội dung nghiên cứu luận án Sàng lọc chủng tiềm giàu axít béo ω - từ loài VTBDD Việt Nam; tối ưu điều kiện nhân nuôi thu sinh khối chủng tiềm quy mơ bình tam giác, hệ thống khác (5, 10, 30 150 Lít); Tối ưu điều kiện tách chiết, tinh bảo quản dầu sinh học giàu axít béo ω - nhằm cung cấp nguyên liệu đảm bảo chất lượng ứng dụng làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho người; Sản xuất viên nang Algae oil omega - (AOO-3-6) từ dầu sinh học giàu axít béo ω - đảm bảo chất lượng, có tính an tồn cao đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ, khả học tập viên AOO-3-6 mơ hình động vật thực nghiệm Những đóng góp luận án - Luận án cơng trình Việt Nam nghiên cứu cách bản, có hệ thống về: sàng lọc, nhân nuôi sinh khối chủng vi tảo biển dị dưỡng tiềm Schizochytrium mangrovei TB17 phân lập tỉnh Thái Bình, Việt Nam có hàm lượng PUFAs ω - cao, DHA chiếm 42,68 ±1,76% so với TFA axit docosapentaenoic (DPA) chiếm 11,02 ± 1,14% so với TFA; lựa chọn điều kiện thích hợp cho tách chiết, tinh axít béo ω - từ chủng TB17 có hàm lượng axit béo ω - cao (đặc biệt DHA, EPA DPA đạt 86,33 ± 2,34% so với TFA); bao viên nang AOO-3-6 đánh giá tính an tồn, tác dụng dược lý viên nang mơ hình động vật thực nghiệm; viên nang đủ tiêu chuẩn làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho người - Lần Việt Nam chứng minh viên nang AOO-3-6 có chứa dầu ω - tách chiết từ S mangrovei TB17 an tồn có khả cải thiện trí nhớ, khả học tập mơ hình động vật thực nghiệm Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án - Có điều kiện thích hợp cho sinh trưởng chủng S mangrovei TB17 phân lập Diêm Điền, Thái Bình năm 2010 (nhân ni sinh khối theo mẻ hệ thống lên men 30 Lít, mơi trường M12 - sử dụng cao nấm men công nghiệp) đạt sinh trưởng với mật độ tế bào (128,42 0,27 x106 tế bào/mL), SKK (30,83  0,25 g/L) lipit (65,96  0,31% SKK) Tổng hàm lượng axit béo ω - (47,35 ± 1,39% so với TFA), sản lượng DHA (40,17 ± 1,75 mg/L/giờ); - Có quy trình tách chiết dầu sinh học giàu axít béo ω - từ S mangrovei TB17 có độ tinh cao (99,46 ± 2,66% so với TFA) đạt tiêu chuẩn chất lượng để làm nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho người; - Có số liệu tính an toàn tác dụng dược lý viên AOO-3-6 động vật thực nghiệm, cung cấp sở khoa học cho việc định hướng ứng dụng làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho người Bố cục luận án Luận án gồm 148 trang, phần mở đầu trang, tổng quan tài liệu 34 trang, vật liệu phương pháp nghiên cứu 21 trang, kết thảo luận 65 trang, kết luận kiến nghị trang, danh mục cơng trình cơng bố trang, tài liệu tham khảo 22 trang gồm 241 tài liệu Trong luận án có 58 hình, 41 bảng 48 trang phụ lục CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung axit béo, vai trị, nguồn gốc đường sinh tổng hợp axít béo Các axít béo ω - có nhiều chức sinh học như: cải thiện hiệu bệnh tim mạch; giảm nguy loạn nhịp tim (có thể dẫn tới đột tử); có hiệu rõ rệt điều trị suy nhược; giảm nguy hình thành khối u tuyến tiền liệt (có thể dẫn đến đau tim đột quỵ); làm chậm tốc độ tăng trưởng mảng xơ vữa động mạch; cải thiện chức nội mô; hạ huyết áp (nhẹ) giảm phản ứng viêm Chính đặc điểm mà axít béo ω - ngày ứng dụng thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho người Do vậy, đặc điểm axít béo ω - trình bày khái quát 1.1.1 Giới thiệu chung axit béo Axít béo có cơng thức tổng quát: CH3-(CH2)n-COOH PUFAs axít béo mạch dài (18 - 22 nguyên tử cacbon) có chứa hai nhiều liên kết đơi Mạch hydrocarbon có đầu: đầu nhóm methyl đầu nhóm cacboxyl Chúng phân loại theo vị trí liên kết đơi tính từ gốc methyl hay gốc cacboxyl Để vị trí nối đơi mạch cacbon tính từ đầu methyl người ta sử dụng ký hiệu “n” “ω” Các liên kết đơi PUFAs tính từ gốc carboxyl ký hiệu “Δ” Những nhóm ω-3, ω-6 hay ω-9 PUFAs có liên kết đơi tương ứng vị trí cacbon số 3, hay tính từ gốc methyl [1] Mạch cacbon axít béo no thường có dạng zíc zắc, kéo thành chuỗi dài khơng cong Các axít béo khơng no, có liên kết đơi dạng cis mạch cacbon bị uốn cong 30°, có nhiều liên kết đơi, mạch cacbon bị uốn cong nhiều Có giả thiết cho mạch cacbon axít béo khơng no dạng cis có ý nghĩa quan trọng màng sinh học Theo nghiên cứu Kelter cộng (1999) [2] cho thấy phân tử chuyển từ dạng cis- sang dạng trans- ngược lại trường hợp bình thường Kiểu đồng phân cis- trans- nguyên nhân dẫn đến tính chất khác axít béo Vị trí nối đơi chuỗi cacbon PUFAs tạo nên khác biệt lớn việc thể người chuyển hóa chúng Các tế bào thể người tạo nối đơi C = C tổng hợp axít béo kể từ cacbon thứ trở Điều có nghĩa người khơng thể tự tổng hợp axít béo ω - ω - Do hai loại axít béo lấy qua chế độ ăn uống hàng ngày [3] Hoạt tính sinh học axít béo phụ thuộc vào dạng cấu trúc hóa học đặc trưng chúng Axít béo có số dạng cấu trúc ethyl este (EE), axít béo tự (free fatty acid - FFA) triacylglycerols (TAGs) Một số nghiên cứu chứng minh axít béo dạng EE có hoạt tính sinh học thấp so với dạng FFA TAG [4] Sự hấp thụ EPA dạng triglycerid 90% dạng ethyl ester 60% [5] Có hai nhóm axít béo khơng thay quan trọng ω - ω - Các axít béo ω - quan trọng là: ALA (C18:3), EPA, DHA, DPA Các axít béo ω - là: axit linoleic (LA; C18:2 ω-6), gama linoleic (GLA - C18:3), eicosadienoic, dihomo-gamma-linoleic (DGLA), ARA (C20:4), DPA [6] 1.1.1.1 Axít docosahexaenoic (DHA) DHA có cơng thức phân tử C22H32O2, axít béo ω - khơng bão hịa đa nối đơi Nó có 22 ngun tử cacbon chuỗi hydrocarbon, có liên kết đơi vị trí cacbon số 4, 7, 10, 13, 16 19, có cơng thức tổng qt là: CH3(CH2CH = CH)6(CH2)2COOH kí hiệu C22:6 ω-3 [7] DHA chuyển thành docosanoids Các liên kết đơi (- C = C -) có cấu hình cis (- C/C = C\C -) để hoạt động sinh lý Cấu trúc khơng bão hịa đa nối đơi (= CH - CH2 - CH =) xoay quanh liên kết đơn (C - C) liền kề Do đó, làm tăng khả liên kết so với phân tử khơng có liên kết đơi Điều làm tăng tính linh hoạt phân tử nhiều [8] Trọng lượng phân tử DHA 328,6 g/mol Ở điều kiện chuẩn, DHA tồn dạng lỏng, không tan nước, tan dung môi không phân cực Cấu trúc hóa học cấu trúc khơng gian DHA trình bày Hình 1.1 [7] A B Hình 1.1 Cấu trúc hóa học (A) cấu trúc khơng gian (B) DHA [7] 1.1.1.2 Axít eicosapentaenoic (EPA) EPA có cơng thức phân tử C20H30O2, axít béo ω-3 khơng bão hịa đa nối đơi Nó có 20 ngun tử cacbon chuỗi hydrocarbon, có liên kết đơi vị trí cacbon số 5, 8, 11, 14 17, có cơng thức tổng qt là: CH3(CH=CH=CH)5 (CH2)3COOH ký hiệu C20:5 ω-3 Trọng lượng phân tử EPA 302,451 g/mol EPA tồn dạng lỏng điều kiện chuẩn, bay 439oC, khối lượng riêng 0,943g/cm3 Cấu trúc hóa học cấu trúc khơng gian EPA trình bày Hình 1.2 [9] A B Hình 1.2 Cấu trúc hóa học (A) cấu trúc không gian (B) EPA [9] 1.1.1.3 Axít docosapentaenoic (DPA) DPA có cơng thức phân tử C22H34O2 Trọng lượng phân tử DPA 330,5 g/mol DPA axít béo khơng bão hịa đa nối đơi Nó có 22 nguyên tử cacbon chuỗi hydrocarbon, có liên kết đơi DPA có hai dạng đồng phân: all - cis 4,7,10,13,16 - docosapentaenoic axít all - cis - 7,10,13,16,19 - docosapentaenoic axít (Hình 1.3) Chúng thường gọi ω-6 DPA ω-3 DPA, tương ứng; vị trí liên kết đơi nguyên tử cacbon gần với cacbon đầu methyl phân tử Động vật có vú, kể người, khơng thể tổng hợp hai axít béo phải thu nhận qua đường thức ăn để trì sức khỏe bình thường Cấu trúc hóa học ω - DPA ω - DPA trình bày Hình 1.3 A B 1.1.2 Vai trò ứng dụng PUFAs Hiện nay, PUFAs ALA, EPA DHA quan tâm nghiên cứu nhiều chúng có ảnh hưởng tích cực đến sức khỏe người động vật Đặc biệt DHA đa dạng chức chứng minh Hashimoto cộng (2017) [11] 1.1.2.1 Vai trò PUFAs sức khoẻ người PUFAs có số vai trò sinh học chủ yếu: PUFAs tham gia vào điều hịa q trình trao đổi lipit, vận chuyển hướng tới mơ Ví dụ, hoạt động bao gồm ức chế trình sinh tổng hợp triacylglycerol (TAG) gan  - PUFAs Bên cạnh đó, PUFAs cịn tham gia vào thành phần cấu trúc nên thành tế bào Sự có mặt chúng thành phần phospholipit góp phần tạo nên tính linh động màng Điều góp phần quan trọng việc điều chỉnh hoạt động protein màng PUFAs thành phần quan trọng cấu tạo nên tế bào não, đặc biệt trẻ nhỏ từ - tuổi Axít béo có ảnh hưởng quan trọng theo hướng tích cực đến hoạt động hệ thống thần kinh trung ương, cần thiết cho phát triển chức não thị giác trẻ nhỏ, não khơng thể trì hoạt động khơng có axít béo quan trọng [12] Để trì màng tế bào, chức não truyền xung thần kinh, axít béo ω - tham gia vào việc chuyển oxy trình tổng hợp hemoglobin phân chia tế bào [13] PUFAs góp phần cải thiện hiệu bệnh tim mạch: giảm nguy loạn nhịp tim; có hiệu rõ rệt điều trị suy nhược; giảm nguy hình thành khối u tuyến tiền liệt; làm chậm tốc độ tăng trưởng mảng xơ vữa động mạch; cải thiện chức nội mô; hạ huyết áp (nhẹ) giảm phản ứng viêm [12] So với quan khác hàm lượng DHA não mắt cao DHA đặc biệt tập trung vào chất xám não võng mạc Trong não, DHA có liên quan đến tín hiệu thần kinh, mắt có liên quan đến chất lượng thị lực DHA tích lũy não mắt vào giai đoạn phôi thai sớm cuối thai kỳ Hàm lượng DHA thấp làm giảm phát triển nhận thức chức thị giác [7] Axít béo ω - điều tra tính hiệu nhiều nghiên cứu sức khỏe người bao gồm loại ung thư khác như: đại tràng, vú, tuyến tiền liệt Nhiều kết nghiên cứu công bố cho thấy việc sử dụng axít béo ω - để cải thiện tình trạng bệnh tiểu đường thai kỳ, có lợi việc điều hịa chức trao đổi chất mẹ thai nhi [14] Trong chế độ ăn chứa LA (ω - 6) ALA (ω - 3) đóng vai trị quan trọng việc trì hàm lượng PUFAs ω - tế bào nội mô Việc chuyển ALA thành EPA DHA phụ thuộc vào số yếu tố di truyền, chế độ ăn uống (tỷ lệ LA ALA), giới tính enzyme desaturase elongases [15] Các axit béo ω - linoleic DPA có tác dụng chống viêm dây thần kinh thể người mơ hình bệnh Alzheimer Trong đó, axit linoleic ω - có phần ăn làm tăng chất chuyển hóa DPA ω - não có tác dụng thúc đẩy q trình chống viêm dây thần kinh dẫn đến làm giảm bệnh Alzheimer [16] Ngoài ra, DPA ω - chứng minh có tác dụng chống viêm, giảm phù nề tăng cường tác dụng kết hợp với DHA [17], giảm co thắt mạch máu kết tụ tiểu cầu [15] 1.1.2.2 Vai trị PUFAs ni trồng thủy sản (NTTS) PUFAs axít EPA, ARA DHA thành phần quan trọng cần thiết cho phát triển biến thái ấu trùng Tuy nhiên, cần ý tỷ lệ DHA, EPA ARA cịn quan trọng nhiều so với hàm lượng chúng Các loài vi tảo có hàm lượng dinh dưỡng cao, đặc biệt axít béo [18] Trong số nghiên cứu làm giàu luân trùng Brachionus plicatilis ấu trùng Artemia salina trại sản xuất giống thủy sản Ai Cập cho thấy sử dụng tảo Tetraselmis chuii có PUFAs với hàm lượng ARA đạt 5,5%; EPA - 4,8% DHA - 5,0% so với TFA làm tăng tốc độ sinh trưởng khả sống sót, tăng khả chống chịu với điều kiện bất lợi ngoại cảnh, nâng cao giá trị dinh dưỡng luân trùng Artemia Do làm tăng khả sống sót giúp cho ấu trùng nuôi phát triển tốt [19] Hàm lượng axit béo ARA, ALA, DHA EPA thịt cá tăng lên đáng kể sau bổ sung Aurantiochytrium sp vào thức ăn ARA tăng từ 0,97 đến 1,24%, ALA tăng từ 0,59 đến 0,81%, DHA tăng từ 14,63 lên 14,82% EPA tăng từ 4,58 - 5,19% [20] Thiếu DHA EPA gây tỷ lệ chết cao, tốc độ sinh trưởng chậm ấu trùng giai đoạn non cá, tôm [21] Theo báo cáo Sprague cộng (2016) [22], việc sản xuất nguồn thức ăn từ tảo dị dưỡng đơn bào Crypthecodinium sp., Schizochytrium sp giàu PUFAs (DHA, EPA, DPA) cho NTTS để làm tăng mức n-6 DPA thịt cá Vì vậy, thức ăn thay lên đến 60% sinh khối vi tảo giàu PUFAs Wang cộng (2017) [23] nghiên cứu khả bổ sung sinh khối Schizochytrium sp để làm thức ăn cho tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương Litopenaeus van namei Kết Schizochytrium sp dùng làm thức ăn bổ sung thay dầu cá hay dầu thực vật chúng có chất lượng đáp ứng yêu cầu, làm tăng đáng kể chức miễn dịch, trọng lượng thề chất lượng cá 1.1.2.3 Ứng dụng làm thức ăn cho gia súc, gia cầm Trong trứng gà ni ngồi tự nhiên có tỷ lệ axít béo ω-6/ω-3 10:1 Chất lượng trứng bị ảnh hưởng tỷ lệ ω-6/ω-3 thức ăn thức ăn có bổ sung axít béo làm giảm độ dày vỏ trứng [24] Theo Nyberg (2017) [25] gà ăn axít béo ω-3 dầu tảo làm tăng axít béo ω-3 EPA DHA trng Kt qu tng t c Kỹỗỹkersan v cộng (2010) [26] bổ sung 3% dầu đậu nành (rất giàu LA) làm PL - 34 PL - 35 PL - 36 PL - 37 PL - 38 PL - 39 PL - 40 PL - 41 PL - 42 PL - 43 PL - 44 PL - 45 PL - 46 PL - 47 PL - 48 ... ? ?Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega - từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Vi? ??t Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho người? ?? với mục đích lựa chọn chủng tiềm... giàu axit béo omega - từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Vi? ??t Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho người? ?? Mục tiêu nghiên cứu luận án Sàng lọc chủng/ loài VTBDD tối ưu... axít béo ω - nhằm cung cấp nguyên liệu đảm bảo chất lượng ứng dụng làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho người; Sản xuất vi? ?n nang Algae oil omega - (AOO -3- 6) từ dầu sinh học giàu axít béo ω - đảm bảo