Nghiên cứu bổ sung thí nghiệm nhằm nâng cao hiệu quả thực hành quan sát nhiếm sắc thể trong chương trình thực hành di truyền học tại khoa sinh học trường đại học vinh

Tr-ờng đại học vinh Khoa sinh học ======== Cao anh Nghiên cứu bổ sung thí nghiệm nhằm nâng cao hiệu thực hành quan sát nhiễm sắc thể ch-ơng trình thực hành di truyền học khoa sinh học - tr-ờng đại học vinh khoá luận tốt nghiệp đại học ngành khoa học sinh học Vinh - 2008 Tr-ờng đại học vinh Khoa sinh học ======== Nghiên cứu bổ sung thí nghiệm nhằm nâng cao hiệu thực hành quan sát nhiễm sắc thể ch-ơng trình thực hành di truyền học khoa sinh học - tr-ờng đại học vinh khoá luận tốt nghiệp đại học ngành khoa học sinh học Giáo viên h-ớng dẫn: ThS Nguyễn Bá Hoành Sinh viên thực hiện: Cao Thế Anh Sinh viên lớp: 44E Vinh - 2008 Lời cảm ơn Đề tài "Nghiên cứu bổ sung thí nghiệm nhằm nâng cao hiệu thực hành quan sát nhiễm sắc thể ch-ơng trình thực hành Di truyền học khoa Sinh học - Tr-ờng Đại học Vinh" đ-ợc thực từ tháng 9/2007 đến tháng 4/2008 Trong suốt trình nghiên cứu đề tài đà nhận đ-ợc nhiều giúp đỡ Thầy Cô giáo, gia đình, ng-ời thân bè bạn Tr-ớc tiên xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo ThS Nguyễn Bá Hoành, ng-ời thầy đà tận tình, h-ớng dẫn, giúp đỡ suốt trình nghiên cứu hoàn thiện đề tài Tôi xin chân trọng cảm ơn Thầy Cô giáo, Cán phụ tá phòng thí nghiệm Di truyền - Ph-ơng pháp giảng dạy - Vi sinh, Cán phụ tá phòng Trung tâm Khoa Sinh Đại học Vinh đà tạo điều kiện thận lợi giúp hoàn thành tốt đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, ng-ời thân bạn bè đà giúp đỡ, động viên tạo điều kiện cho suốt trình học tập nghiên cứu Mặc dù thân đà cố gắng, song đề tài tránh khỏi thiếu sót nội dung hình thức Rất mong nhận đ-ợc góp ý Thầy Cô giáo ng-ời quan tâm để đề tài đ-ợc hoàn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Vinh, tháng năm 2008 Sinh viên Cao Thế Anh Mục lục Trang Mở đầu I Lí chọn đề tài II Mục đích nghiên cứu đề tài III NhiƯm vơ nghiên cứu đề tài IV Thời gian địa điểm nghiên cøu Ch-¬ng Tổng quan vấn đề nghiên cứu 1.1 Nội dung thực hành NST ch-ơng trình Di truyền học đại c-ơng 1.2 Nhiễm sắc thể sinh vật nhân chuÈn 1.2.1 ChÊt nhiễm sắc nhiễm sắc thể 1.2.2 Hình thái NST 1.2.3 Chức phần NST 1.2.4 CÊu tróc hiĨn vi cđa NST 1.2.5 Phân bào nguyên nhiÔm - Mitosis (M) 10 1.3 Thực hành làm tiêu ép quan sát NST 12 1.3.1 Chọn đối t-ợng 12 1.3.2 Chuẩn bị mẫu cố định 13 1.3.3 Xử lý đối t-ợng tr-ớc lúc cố định 13 1.3.4 Cố định mẫu 14 1.3.5 Lµm mđn mÉu vËt 14 1.3.6 Nhuém mÉu vËt 14 1.3.6.1 Ph-ơng pháp nhuộm thông th-ờng 14 1.3.6.2 Ph-ơng pháp nhuộm phân hóa NST 15 1.3.7 ép tiêu 16 1.4 Đột biến NST hiệu gây đột biến ë thùc vËt 16 Ch-¬ng Đối t-ợng ph-ơng pháp nghiên cứu 18 2.1 Đối t-ợng nghiên cứu 18 2.1.1 Cây hành hoa 18 2.1.2 Hµnh ta 19 2.1.3 Tái ta 19 2.2 Thiết bị, dụng cụ hóa chất 19 2.2.1.ThiÕt bÞ, dơng 19 2.2.2 Pha chế chuẩn bị hóa chất 20 2.3 Ph-ơng pháp nghiên cứu NST 20 2.3.1 Ph-¬ng pháp làm tiêu tạm thời nghiên cứu số l-ợng NST 20 2.3.1.1 Chn bÞ mÉu rƠ 20 2.3.1.2 Thu rƠ vµ tiền cố định mẫu 20 2.3.1.3 Cố định rễ 21 2.3.1.4 Làm tiêu quan s¸t 21 2.3.1.5 Cố định tiêu chụp ảnh 21 2.3.2 Thí nghiệm xác định hiệu loại thuốc nhuộm, nồng độ thuốc nhuộm quy trình nhuộm thích hợp 22 2.3.3 Thí nghiệm xác định hiệu nhiệt độ đến khả rễ tần số đột biến NST 23 Ch-ơng Kết nghiên cứu th¶o ln 24 3.1 HiƯu qu¶ thư nghiệm ph-ơng pháp tiền cố định mẫu 24 3.2 Hiệu thử nghiệm loại thuốc nhuộm, nồng độ thuốc nhuộm quy trình nhuộm thích hợp 26 3.3 KÕt qu¶ thư nghiƯm đối t-ợng trồng nghiên cứu số l-ợng NST 29 3.4 Hiệu nghiên cứu ảnh h-ởng nhiệt độ đến khả rễ tần số ®ét biÕn NST ë hµnh hoa 29 kết luận đề nghị 34 I KÕt luËn 34 II Đề nghị 35 tài liệu tham khảo 36 Phơ lơc ¶nh ®ét biÕn cÊu tróc nhiƠm s¾c thĨ 38 Mở đầu I Lí chọn đề tài Ngày nay, với xu hội nhập toàn cầu, bên cạnh phát triển mạnh mẽ kinh tế thị tr-ờng, khoa học kỹ thuật, ngành khoa học nói chung ngành sinh học nói riêng đà đạt đ-ợc thành tựu to lớn, mở triển vọng đầy hứa hẹn kỉ XXI - thÕ kØ cđa C«ng nghƯ Sinh häc Trong xu thÕ ®ã, Khoa häc Sinh häc ViƯt Nam cịng ®· đạt đ-ợc thành tựu đáng tự hào, góp phần đ-a đất n-ớc ta từ n-ớc nông nghiệp lạc hậu, phát triển trở thành n-ớc có tiềm phát triển khu vực Tuy nhiên, nghiệp giáo dục n-ớc nhà, có yếu tố chủ quan nh- khách quan mang lại, chất l-ợng giáo dục đào tạo ch-a cao Chất l-ợng học sinh, sinh viên khoa học thực nghiệm nói chung sinh học nói riêng yếu kiến thức kỹ thực hành so với n-ớc khu vực giới Thực hành không để cố kiến thức lý thuyết mà thông qua thực hành rèn luyện kỹ nghiên cứu sinh học, rèn luyện thao tác thực hành, rèn luyện khả t- duy, khả phân tích, kỹ vận dụng lý thuyết vào thực tế, phát huy óc sáng tạo tìm tòi ng-ời học Vì thời l-ợng thực hành ít, kinh phí dành cho buổi thực hành hạn hẹp; ph-ơng tiện, dụng cụ phục vụ cho thực hành hạn chế hiệu thực hành ch-a cao Điều đòi hỏi khâu chuẩn bị phải thật chu đáo, việc lựa chọn đối t-ợng thích hợp, ph-ơng pháp thí nghiệm đơn giản, hợp lí, hiệu cao có ý nghĩa quan trọng việc nâng cao hiệu thí nghiệm Di truyền học học phần có vị trí vai trò quan trọng việc đào tạo sinh viên ngành sinh học nh- đào tạo giáo viên sinh học THPT Vì vậy, nội dung thực hành quan sát hình thái nhiễm sắc thể (NST), đếm số l-ợng NST, hoạt động NST sinh sản sai hình NST ®ét biÕn sÏ ®ãng vai trß hÕt søc quan träng nội dung thực hành Di truyền học Để nâng cao chất l-ợng buổi thực hành ch-ơng trình Di truyền học, nhiều năm qua Bộ môn Di truyền, khoa Sinh học - Tr-ờng Đại học Vinh đà không ngừng tìm tòi, nghiên cứu đổi ph-ơng pháp thí nghiệm Trong ch-ơng trình thực hành Di truyền học khoa Sinh học - Tr-ờng Đại học Vinh có bài, có quan sát NST Bài 1: Làm tiêu quan sát phân bào nguyên nhiễm rễ hành ta Bài 2: Làm tiêu quan sát phân bào giảm nhiễm động vật thực vật Bài 3: Quan s¸t NST khỉng lå ë tun n-íc bät cđa ấu trùng ruồi giấm Trong đó, quan sát phân bào giảm nhiễm động vật thực vật chủ yếu quan sát giai đoạn hình thành tiểu bào tử hạt phấn nhị hoa Còn hình thái NST qua giai đoạn phân bào giảm nhiễm đ-ợc quan sát qua ảnh chụp Vì việc nghiên cứu để tìm ph-ơng pháp bổ sung vào ch-ơng trình thực hành Di truyền học công việc thực cần thiết Xuất phát từ lý luận thực tiễn đó, nhằm nâng cao hiệu thực hành quan sát NST ch-ơng trình thực hành Di truyền học tr-ờng Đại học Cao đẳng, đồng thời h-ớng tới việc nâng cao trình độ giáo viên THPT, tiến hành đề tài: Nghiên cứu bổ sung thí nghiệm nhằm nâng cao hiệu thực hành quan sát nhiễm sắc thể ch-ơng trình thực hành Di truyền học khoa Sinh học - Trường Đại học Vinh II Mục đích nghiên cứu đề tài - Nghiên cứu lựa chọn đối t-ợng thích hợp cho thí nghiệm - Nghiên cứu cải tiến ph-ơng pháp thí nghiệm quan sát nhiễm sắc thể phù hợp với điều kiện thực hành để bổ sung cho ch-ơng trình thực hành Di truyền học III Nhiệm vụ nghiên cứu đề tài - Thực nghiệm đối t-ợng trồng, cải tiến ph-ơng pháp quan sát số l-ợng nhiễm sắc thể - Thực nghiệm điều kiện rễ, thời gian xử lý đột biến, xác định tần số đột biến từ đ-a ph-ơng pháp tối -u thích hợp với điều kiện thực hành IV Thời gian địa điểm nghiên cứu Thời gian nghiên cứu: Đề tài đ-ợc tiến hành thời gian từ tháng 9/2007 đến tháng 4/2008 Địa điểm nghiên cứu: Hành, tỏi hạt hành hoa đ-ợc xử lý, trồng gieo lấy rễ, làm tiêu quan sát NST phòng thí nghiệm Di truyền - Ph-ơng pháp Chụp ảnh tiêu đ-ợc tiến hành phòng thí nghiệm Trung tâm khoa Sinh học - Tr-ờng Đại học Vinh Ch-ơng Tổng quan vấn đề nghiên cứu 1.1 Nội dung vị trí thực hành quan sát NST ch-ơng trình thực hành Di truyền học Nh- đà trình bày trên, ch-ơng trình thực hành Di truyền học khoa Sinh học - Tr-ờng Đại học Vinh có bài, có quan sát nhiễm sắc thể: Bài : Làm tiêu quan sát phân bào nguyên nhiễm rễ hành ta Bài : Làm tiêu quan sát phân bào giảm nhiễm đối t-ợng động vật, thực vật Bài : Quan s¸t NST khỉng lå ë tun n-íc bät cđa ấu trùng ruồi giấm Những thực hành quan trọng, cố hoàn thiện mặt lý thuyết mà hình thành kiến thức, thao tác kỹ thực hành cho sinh viên Điều giúp sinh viên sau tốt nghiệp, công tác tr-ờng THPT có đ-ợc chuẩn bị mặt kiến thức nh- kỹ thực hành Nhờ chủ động hoàn thành tốt giảng phần thực hành Sinh học nói chung thực hành Di truyền học nói riêng Tuy nhiên với nội dung thực hành này, sinh viên quan sát đ-ợc hình thái NST qua kỳ phân bào nguyên nhiễm ch-a đáp ứng đ-ợc nội dung phần lý thuyết Vì việc bổ sung thí nghiệm vào ch-ơng trình thực hành thực cần thiết 1.2 Nhiễm sắc thể sinh vật nhân chuẩn 1.2.1 Chất nhiễm sắc nhiễm sắc thể Chất nhiễm sắc (Chromatine) chất chứa nhân tế bào có khả bắt màu đặc tr-ng, sợi, hạt búi làm thành mạng Trong tế bào sinh vật nhân chuẩn, chất nhiễm sắc bao gồm ADN phân tử protein histon phi histon hình thành phức hợp nucleoproteit [8] Các protein phi histon có tính acid, đ-ợc tìm thấy vùng liên kết lỏng lẻo với ADN Các protein histon cã tÝnh kiỊm gåm lo¹i: H1, H2A, H2B, H3 H4 Khi NST đ-ợc thành lập, ADN quấn quanh phân tử histon: H2A, H2B, H3 H4 (mỗi loại gồm phân tử) tạo nên cấu trúc gọi thể nhân (nucleosome) với tham gia histon H1, thể nhân liên kết chặt chẽ với nhau, cuộn xoắn thành sợi có đ-ờng kính 30nm, sợi tiếp tục xoắn tạo thành sợi dày (đ-ờng kính 300nm), sợi tiếp tục xoắn, NST đ-ợc tạo thành NST cấu trúc hiển vi nằm nhân tế bào có khả tự nhân đôi, bắt màu giữ màu basic, quan sát hình dạng NST qua kính hiển vi quang học trình tế bào phân chia Hình thái số l-ợng NST nhân tế bào biểu rõ kỳ trình phân bào nguyên phân Tại kỳ giữa, NST co xoắn cực đại, biểu trạng thái đặc tr-ng, bắt màu đậm, dễ quan sát d-ới kính hiển vi Chính vậy, ng-ời ta th-ờng sử dụng tế bào phân chia kỳ để xác định số l-ợng NST, quan sát hình dạng, kích th-ớc, đặc điểm tổng NST để thiết lập công thức kiểu nhân Bộ NST đặc tr-ng cho loài mặt số l-ợng, hình thái cấu trúc, kết trình tiến hoá lâu dài loài Trong tế bào l-ỡng bội (2n) sinh vật nhân chuẩn, NST tồn thành cặp gọi cặp NST t-ơng đồng Các NST cặp t-ơng đồng giống hình dạng, kích th-ớc cấu trúc đặc tr-ng gọi cặp NST t-ơng ®ång (homologous pair), ®ã mét NST cã nguån gèc tõ bè, mét NST cã nguån gèc tõ mÑ Trong tế bào giao tử (tinh trùng noÃn), cặp NST t-ơng đồng lại chiếc, số l-ợng NST giao tử đơn bội (n) Mặc dù số l-ợng NST loài khác biệt lớn, chẳng hạn ruồi giấm 2n = 8, ë ng-êi 2n = 46,…nh-ng c¸c c¸ thể bình th-ờng loài luôn có số l-ợng 1.2.2 Hình thái NST Vào kỳ trình phân bào nguyên phân, d-ới kính hiển vi quang học thông th-ờng nhìn thấy cấu trúc hình dạng đặc tr-ng NST: NST trạng thái kép gồm chromatit dính tâm động Mỗi chromatit gồm sợi nhiễm sắc cã cÊu tróc xo¾n nhiỊu bËc, chÊt nỊn tÝch tơ đầy đủ Lúc các NST, NST kèm NST tế bào phân tách cách xa tiêu bản, nhờ đếm đ-ợc số l-ợng cách xác dễ dàng (ảnh 3.2) ảnh 3.2 NST tế bào đỉnh rễ hành ta (tiền cố định lạnh) So với ph-ơng pháp tiền cố định - hidroxyquinoline có phòng thí nghiệm thấy xử lý lạnh có hiệu hơn, an toàn, tiến hành đơn giản, không tốn thời chờ đợi Tiền cố định lạnh ph-ơng pháp đơn giản, dễ làm, không độc hại Trên đối t-ợng hành ta, tỏi ta, hành hoa, ph-ơng pháp cho hiệu làm co ngắn NST cách rõ rệt, dễ dàng quan sát Ngoài tác dụng làm co ngắn NST việc xử lý lạnh có ảnh h-ởng đến độ nhớt tế bào chất tạo thuận lợi cho NST tung xa trình làm tiêu Thời gian xư lý 24h cho kÕt qu¶ tèt, nh-ng cã thĨ thời gian t-ơng đối dài Theo số tài liệu, khoảng thời gian xử lý lạnh 12h - 24h tuỳ theo đối t-ợng Vì thế, T vµo thêi gian tiÕn hµnh bµi thÝ nghiƯm mµ ta cã thĨ rót ng¾n thêi gian xư lý nh-ng vÉn cho hiƯu qu¶ cao 3.2 HiƯu qu¶ thư nghiƯm loại thuốc nhuộm, nồng độ thuốc nhuộm quy trình nhuộm thích hợp D-ới kính hiển vi quang học, tế bào th-ờng suốt t-ơng đối đồng Do đó, để quan sát đ-ợc NST tế bào, ng-ời ta phải nhuộm tế bào thuốc nhuộm khác với mục đích quan sát rõ hình thái NST Tuỳ theo mục đích nghiên cứu mà lựa chọn loại thuốc nhuộm ph-ơng pháp thích hợp Có thể tiến hành nhuộm không đặc hiệu (nhuộm toàn tế bào cấu trúc) nhuộm đặc hiệu (nhuộm phân hoá - banding techniques) Nhuộm toàn NST cho phép quan sát mô tả hình thái NST, đếm số l-ợng NST đặc tr-ng cho loài, phân tích kiểu nhân (karyotype) Hiệu nhuộm NST tuỳ thuộc loại thuốc nhuộm, nồng độ thuốc nhuộm thích hợp cho đối t-ợng Thuốc nhuộm carmin axetic th-ờng đ-ợc sử dụng phổ biến thực hành quan sát NST với nồng độ 5% [5] Mặc dầu nhuộm NST nhanh, nh-ng NST bị nhuộm màu đậm gây khó khăn cho quan sát nh- chuẩn bị tiêu bản, hiệu kinh tế lại không cao, thời gian sử dụng rễ đà nhuộm không dài Các thí nghiệm cải tiến ph-ơng pháp nhuộm nồng độ thuốc nhuộm quy trình nhuộm đà đ-ợc tiến hành nhằm phát nồng độ thuốc nhuộm thích hợp quy trình nhuộm đơn giản, dễ thu nhận kết Hiệu nồng độ thuốc nhuộm đ-ợc đánh giá tiêu NST Nồng độ thuốc nhuộm thích hợp đ-ợc xác định dựa mức độ nhuộm màu đậm hay nhạt NST nhân độ suốt tế bào chất Kết tổng hợp từ thí nghiệm xác định nồng độ quy trình nhuộm đ-ợc trình bày bảng 3.1 Sử dụng thuốc nhuộm carmin axetic nång ®é tõ - 2% ®Ịu cã thĨ quan sát NST nhân tế bào với thời gian nhuộm 15 - 20 phút So với tr-ớc phòng thÝ nghiƯm vÉn sư dơng carmin axetic 5% th× sư dơng carmin axetic - 2% cho hiƯu qu¶ cao hơn, NST nhuộm màu đậm dễ quan sát Đồng thêi, nhuém b»ng carmin axetic - 2% sÏ tiÕt kiệm đ-ợc hoá chất tận dụng đ-ợc nguồn rễ thời gian thí nghiệm cần tiến hành dài Sư dơng thc nhm fuchsine 1% (c«ng thøc C3) khoảng thời gian 10 phút, 15 - 20 phút 30 phút làm cho tế bào chất sáng nh-ng NST mờ, khó phát Trong đó, ng©m rƠ thc nhm fuchssine 1% víi thêi gian làm cho NST bị phân huỷ Sử dơng c«ng thøc nhm C4 thêi gian 10 tế bào chất nh-ng NST lại nhuộm màu nhạt Trong nhuộm khoảng thời gian 15 - 20 phút 30 phút NST nhuộm màu tốt, dễ quan sát tế bào chất Tuy nhiên thời gian nhuộm kéo dài (hơn 1h) NST bắt đầu bị phá huỷ, nguyên nhân dung dịch fuchsine 1% có l-ợng lớn axit HCl 1N Bảng 3.1 Hiệu nhuộm màu NST nồng độ thuốc nhuộm quy trình nhuộm khác Hiệu nhuộm màu Công thức thí nghiệm NST C1 Màu đậm, hình thái rõ Màu đậm, C2 Màu đậm, hình thái rõ Màu đậm, Màu nhạt, hình thái không rõ Màu nhạt, sáng 10 phút 15 - 20 phút Màu nhạt, hình thái không rõ C3 Tế bµo chÊt 30 1h 10 15 - 20 phút C4 30 phút 1h Màu nhạt, hình thái không rõ NST bị phá huỷ, hình thái không rõ Màu nhạt, hình thái đặc tr-ng ch-a rõ Màu đậm, hình thái đặc tr-ng, rõ nét Màu đậm, hình thái đặc tr-ng, rõ nét NST bị phá huỷ, hình thái không rõ Màu nhạt, sáng Màu nhạt, sáng Màu nhạt, sáng Màu nhạt, sáng Màu nhạt, sáng Màu nhạt, sáng Màu nhạt, sáng Theo quy trình cũ, nhuộm carmin axetic, NST nhuộm màu đậm nhanh tế bào chất nhuộm màu đậm, khó phân biệt đ-ợc hình thái NST Nếu thời gian nhm kÐo dµi cịng sÏ lµm tÕ bµo chÊt nhm màu đậm, làm giảm khả quan sát NST, chí phân biệt đ-ợc NST, khó đếm đ-ợc số l-ợng NST Tiến hành thí nghiệm theo quy trình dùng công thức nhm C cã thĨ gi¶m bít mét sè b-íc thực hành Sinh viên học sinh dành nhiều thời gian để rèn luyện kỹ làm tiêu bản, quan sát hình thái, số l-ợng NST giải thích kết Với công thức nhuộm C thêi gian 15 - 20 cịng nh- 30 phút cho kết tốt Nh-ng với thời l-ợng thực hành nhuộm thời gian ngắn 15 - 20 phút thích hợp 3.3 Kết thử nghiệm đối t-ợng trồng nghiên cứu số l-ợng NST Khi tiến hành thí nghiệm, thấy hành ta, tỏi ta, hành hoa cho hiệu tốt, NST quan sát rõ nét Tuy nhiên để có đ-ợc nguồn rễ hành hoa cho thực hành nhiều thời gian nảy mầm hạt hành hoa phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ môi tr-ờng (thời gian thích hợp từ tháng đến tháng âm lịch) Rễ hành tỏi làm tiêu quan sát NST có hành hoa chút nh-ng quan sát NST rõ nét, đếm dễ dàng Hành, tỏi lại dễ trồng, có khả rƠ nhanh, ngn rƠ nhiỊu, cã thĨ dïng cho nhiều thí nghiệm Chính phạm vi thực hành quan sát số l-ợng NST việc sử dụng hành ta tỏi để cung cấp rễ cho thí nghiệm có khả thành công cao (ảnh 3.2) 3.4 Hiệu nghiên cứu ảnh h-ởng nhiệt độ đến khả rễ tần số đột biến NST hành hoa Thời gian ngâm hạt (tr-ớc xử lý nhiệt) thích hợp đ-ợc đánh giá tỉ lệ hạt nảy mầm lô thí nghiệm Hiệu gây đột biến xử lý nhiệt đ-ợc đánh giá xuất dạng đột biến NST nh- đột biến dạng cầu, dạng đoạn NST di chuyển chậm nh- tần số tế bào có đột biến tổng số tế bào có phân chia Trên lô thí nghiệm đợt tiến hành lấy ngẫu nhiên 10 rễ làm tiêu quan sát tính tần số Kết thu đ-ợc thể bảng 3.2, bảng 3.3 Bảng 3.2 Tỉ lệ nảy mầm hạt hành sau xử lý sốc nhiệt 600C Thời gian Thời gian ngâm hạt xử lý nhiệt 6h 12h 18h Tỉ lệ nảy mầm (%) Trung Đợt Đợt Đợt bình (11/2007) (12/2007) (2/2008) đợt 1h 80,00 70,00 65,00 71,67 2h 78,00 68,00 64,00 70,00 3h 74,00 65,00 61,00 66,67 4h 66,00 63,00 59,00 62,67 5h 63,00 61,00 57,00 60,33 Trung b×nh 72,20 65,40 61,20 65,93 1h 70,00 64,00 60,00 64,67 2h 63,00 64,00 58,00 61,67 3h 62,00 61,00 57,00 60,00 4h 61,00 59,00 54,00 58,00 5h 60,00 58,00 53,00 57,00 Trung b×nh 63,20 61,20 56,40 60,27 1h 56,00 52,00 50,00 52,67 2h 55,00 51,00 49,00 51,67 3h 52,00 47,00 47,00 48,67 4h 51,00 45,00 43,00 46,33 5h 50,00 43,00 41,00 44,67 Trung bình 52,80 47,60 46,00 48,80 Kết bảng 3.2 cho thấy: tỉ lệ nảy mầm hạt sau xử lý nhiệt t-ơng đối, tỉ lệ cao 71,67% hạt ngâm n-ớc 6h xử lý nhiƯt kÐo dµi 1h ë 600C Víi thêi gian ngâm hạt 6h, hạt hút đủ n-ớc b-ớc vào giai đoạn nảy mầm Tuy nhiên, hạt có thời gian ngâm n-ớc 12h 18h số hạt có sức nảy mầm tốt đà nảy mầm Những hạt đem xử lý nhiệt độ cao đà làm cho mầm bị héo, sau xử lý nhiệt hạt nh- không khả mọc mầm lại Điều làm giảm tỉ lệ nảy mầm sau xử lý nhiệt Tỉ lệ nảy mầm giảm dần thời gian xử lý nhiệt kéo dài Nguyên nhân nhiệt độ cao đà làm cho tế bào chế cân bằng, xảy rối loạn máy di truyền, dẫn tới rối loạn hoạt động bình th-ờng Thời gian xử lý dài khả phục hồi giảm Trong đợt tiến hành thí nghiệm tiến hành vào thời điểm thời tiết có nhiệt độ thấp, đợt có tỉ lệ cao nhiệt độ thấp nh-ng cao hai đợt lại Đợt có tỉ lệ thấp thí nghiệm đ-ợc tiến hành vào thời điểm thời tiết rét đậm nên hạt khó nảy mầm Bảng 3.3 Tần số tế bào có ®ét biÕn NST ë rƠ hµnh hoa xư lý sèc nhiệt 600C Tỉ lệ số tế bào có đột biến tổng số tế bào phân chia Thời kỳ kỳ sau gian Đợt (11/2007) Đợt (12/2007) xư lý Sè Sè Sè Sè nhiƯt TB TB TB TB kéo có có có có dài phân đột phân đột chia biến Tần số đột biến chia biến Tần số đột biến Đợt (2/2008) Số Số TB TB có có phân đột chia biến Tần số Tần trung số bình đột biến 1h 170 35 0,21 125 27 0,22 140 31 0,22 0,22 2h 158 39 0,25 120 29 0,24 131 34 0,26 0,25 3h 140 37 0,26 101 28 0,28 115 35 0,30 0,28 4h 120 40 0,33 80 30 0,38 99 37 0,37 0,36 5h 100 34 0,34 70 27 0,39 81 30 0,37 0,37 Qua bảng 3.3 ta thấy: Tần số đột biến đợt tiến hành thí nghiệm xấp xỉ t-ơng ứng theo thời gian xử lý Điều chứng tỏ khả gây đột biến nhiệt độ cao hạt hành nghiên cứu ổn định Nh-ng tần số đột biến lại thay ®ỉi theo thêi gian xư lý nhiƯt Trong ®ã xư lý nhiƯt víi thêi gian giê cho kÕt qu¶ tần số đột biến cao (0,37) Nhvậy, thời gian xử lí nhiệt có ảnh h-ởng lớn đến tần số đột biến Qua bảng 3.3 cho thấy rằng: Khi xư lý nhiƯt víi thêi gian ®Õn giờ, đà xuất đột biến nh-ng tần số ch-a cao Tần số đột biến xử lý với thời gian không cao hẳn so với giê (0,37 so víi 0,36) Nh- vËy, ®èi víi mét thí nghiệm quan sát đột biến NST cã thĨ lùa chän thêi gian xư lý nhiƯt thích hợp Thời gian chuẩn bị không dài nh-ng cho kết tần số đột biến lại cao Các dạng đột biến th-ờng gặp tế bào có đột biến đột biến dạng cầu NST (cầu đơn, cầu kép), đột biến dạng đoạn NST NST di chuyển chậm, có tế bào gặp đột biến dạng cầu đoạn NST (ảnh 3.3, 3.4 3.5) ảnh 3.3 Đột biến dạng cầu ảnh 3.4 Đột biến dạng đoạn ảnh 3.5 Đột biến dạng có dạng cầu đoạn Dạng đột biến cầu NST quan sát thấy d-ới tác động nhiệt độ, NST bị đứt đoạn cuối làm trình tự telomere (là trình tự có chức ngăn cản NST gắn lại với nhau) Các NST bị đứt có tâm động nối với tạo thành NST có hai tâm động, kỳ sau tâm động cực tế bào đà hành thành nên cầu nhiễm sắc Các đoạn NST tâm động nằm lại mặt phẳng xích đạo tạo nên dạng đột biến đoạn NST hay NST di chuyển chậm Để quan sát dạng đột biến cấu trúc NST, ng-ời ta th-ờng xử lý đối t-ợng chiếu xạ (Gamma Co60) Trung tâm chiếu xạ Việc sử dụng ph-ơng pháp thu nhận tần số đột biến cao, quan sát đ-ợc đột biến dạng cầu, đột biến dạng đoạn Tuy nhiên vËt liƯu chiÕu x¹ th-êng mäc rƠ rÊt kÐm số rễ thu đ-ợc ít, kinh phí chiếu xạ lại cao, thiếu chủ động tiến độ thực hành phải phụ thuộc vào kế hoạch Trung tâm chiếu xạ Bởi vậy, xử lý đột biến sốc nhiệt nhiệt độ cao ph-ơng pháp khả thi, phù hợp với nội dung phạm vi thực hành thí nghiệm quan sát đột biến NST tr-ờng đại học, cao đẳng Kết luận đề nghị I Kết luận Qua kết nghiên cứu thảo luận, rút mét sè kÕt ln nh- sau: Xư lý tiỊn cố định mẫu rễ n-ớc đá lạnh nhiệt ®é - 80C (nhiƯt ®é cã thĨ xng thÊp hơn) thời gian 24h cho kết tốt so với tiền cố định - hidroxyquinoline có: NST co ngắn, nhuộm màu đậm hơn, tế bào chất trong, NST phân tán xa nhau, quan sát rõ hình thái đếm số l-ợng NST cách xác Tiến hành nhuộm rễ thuốc nhuộm fuchsine 1% víi thêi gian 15 - 20 vµ nhuém phô b»ng carmin axetic 1% thêi gian phút (công thức C4) cho kết tốt Có thể sử dụng để nhuộm tế bào đỉnh rễ hành ta, tái ta, hµnh hoa bµi thùc hµnh quan sát NST Sử dụng đối t-ợng hành ta (A ascalonium L.) tỏi ta (A sativum L.) thực hành quan sát số l-ợng NST phù hợp cho kết tốt: NST tách ra, nhuộm màu tốt, dễ đếm Bên cạnh đó, hành ta tỏi ta đối t-ợng rẻ tiền, phổ biến, dễ tìm, dễ trồng, có khả rƠ nhanh, ngn rƠ nhiỊu, cã thĨ dïng cho nhiỊu thí nghiệm Vì mà bổ sung thêm thực hành ch-ơng trình thực hành Di truyền học khoa Sinh học - Tr-ờng Đại học Vinh Các dạng đột biến cấu trúc NST nh- dạng cầu, dạng đoạn NST chậm đ-ợc quan sát với tần số cao tiến hành xử lý hạt hành hoa đà ngâm n-ớc nhiệt độ 600C khoảng thời gian từ Đây sở để bổ sung bi thực hnh Làm tiêu quan sát dạng đột biến cấu trúc NST chương trình thực hnh Di truyền học khoa Sinh học - Tr-ờng Đại học Vinh, với quy trình nh- sau: + Thời gian chuẩn bị: Ngâm hạt hành hoa n-íc cÊt giê, xư lý ë nhiƯt ®é 600C thời gian giờ, cho hạt nảy mầm giấy thấm n-ớc đặt đĩa petri + Thời gian thực hành: Thu rễ đạt chiều dài khoảng 1,5 - 2cm (nảy mầm khoảng 60 giờ), cố định dung dịch carnoy - 10 phút, nhm rƠ dung dÞch thc nhm fuchsine 1% víi thêi gian 15 - 20 phót, nhm phơ b»ng carmin axetic 1% thời gian phút Làm tiêu ép quan sát dạng đột biến cấu trúc NST II Đề nghị Từ thực tế tiến hành thí nghiệm kết đà đạt đ-ợc, có số đề nghị nh- sau: Cần thử nghiệm lại trình tiền cố định hoá chất - hidroxyquinoline để thu đ-ợc kết cao hơn, bổ sung cho thí nghiệm quan sát số l-ợng NST Tiếp tục thử nghiệm thêm đối t-ợng trồng khác thực hành quan sát số l-ợng NST để lựa chọn đ-ợc đối t-ợng tối -u Tiếp tục nghiên cứu ảnh h-ởng nhiệt độ cao đến tần số phổ ®ét biÕn NST ë hµnh hoa Cã thĨ tiÕn hµnh thử nghiệm hiệu gây đột biến nhiệt độ số đối t-ợng trồng khác Tài liệu tham khảo Tài liệu tiếng việt [1] Phan Văn Duyệt (1998) Ph-ơng pháp vật lý lý sinh phóng xạ nông nghiệp y học Nxb Khoa học Kỹ thuật Hà Nội [2] Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Đức Thành, Nguyễn Xuân Viết (2004 2007) Tài liệu bồi d-ỡng th-ờng xuyên giáo viên trung học phổ thông chu kì III Nxb Đại học s- phạm [3] Nguyễn Bá Hoành (2005) B-ớc đầu nghiên cứu đa dạng di truyền giông khoai môn sọ (Colocasia esculenta (L.) Schott) Nghệ An Thanh Hoá Luận văn Thạc sĩ khoa học sinh học, tr-ờng Đại học Sphạm Hà Nội, tr 25 - 26 [4] Trần Hợp (2000) Cây cảnh hoa Việt Nam Nxb Nông nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh, tr 321 - 322 [5] Đặng Hữu Lanh, Nguyễn Minh Công, Lê Đình Trung (1984) Thực hành Di truyền học sở chọn giống Nxb Giáo dục [6] Lê Đình L-ơng, Phan Cự Nhân (1997) Cơ sở Di truyền học Nxb Giáo dục [7] Ngô Trực Nhà (2001) Số l-ợng nhiễm sắc thể loài thuộc chi Hành tỏi (Allium) phổ biến Nghệ An Hà Tĩnh Tạp chí Sinh học, tập 23 - sè 3C1, tr 166 - 169 [8] Phan Cù Nhân, Đặng Hữu Lanh, Nguyễn Minh Công (1999) Di truyền học tập I, II Nxb Giáo dục [9] L-ơng Ngọc Toản, Phan Nguyên Hồng, Hoàng Thị Sản, Võ Văn Chi Phân loại Thực vật, Tập III [10] Nguyễn Xuân Viết (2004) Phân tích di truyền tế bào di truyền tế bào phân tử để xác định nguồn gốc thể nhiễm sắc lai tự nhiên loài chi khoai môn Colocasia Tạp chí Sinh học 26 (3), tr 43 - 47 Tµi liƯu tiÕng n-íc ngoµi [11] Dragan, A I and S N Khrapunow (1992) Study of cytogeneticeffect of laser radiation in Allium fistulosum Tsitologiya genetika 26 (3): 32 36 Kiev State Univ, Kiev, Ukrainae [12] Dragan, A I and S N Khrapunow (1993) Mechanism of cytogeneticsaction of laser radiation Tsitologiya genetika 27 (6): 20 - 24 Kiev State Univ, Kiev, Ukrainae [13] Sharma, A K and A Sharma (1994) Chromosome techniques Amanual Harwood Academic Publishers, India Japan Malaysia Russia Singapore, USA, page - 32 Mét sè trang web [14] www.botanik.uni-karlsruhe.de/ /fotos-hassler/ [15] www.uni-graz.at/~katzer/engl/Alli_cep.html [16] www.uttrakhand.com/ww/herbalstate/four.htm [17] www.rolv.no/ /medisinplanter/alli_sat.htm [18].Vietsciences.free.fr/giaokhoa/biology/sinhhocdaicuong/chuong21nhiems acthevaphancattebao.htm Phơ lơc ¶nh đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể A Đột biến dạng cầu B Đột biến dạng đoạn C Đột biến dạng cầu đoạn ...Tr-ờng đại học vinh Khoa sinh học ======== Nghiên cứu bổ sung thí nghiệm nhằm nâng cao hiệu thực hành quan sát nhiễm sắc thể ch-ơng trình thực hành di truyền học khoa sinh học - tr-ờng đại học vinh. .. việc nâng cao trình độ giáo viên THPT, tiến hành đề tài: Nghiên cứu bổ sung thí nghiệm nhằm nâng cao hiệu thực hành quan sát nhiễm sắc thể ch-ơng trình thực hành Di truyền học khoa Sinh học - Trường. .. trí thực hành quan sát NST ch-ơng trình thực hành Di truyền học Nh- đà trình bày trên, ch-ơng trình thực hành Di truyền học khoa Sinh học - Tr-ờng Đại học Vinh có bài, có quan sát nhiễm sắc thể: