Nghiên cứu đặc tính chitinase từ trichoderma

Tr-ờng đại học vinh khoa hóa học === === đồ án tốt nghiệp Đề tài: nghiên cứu đặc tính chitinase từ Trichoderma GV h-ớng dẫn : ThS đào thị xu©n SV thùc hiƯn : ngun ngäc trung Líp : 48K - C«ng nghƯ thùc phÈm M· sè SV : 0752048590 VINH - 12/2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM ĐỘC LẬP - TỰ DO - HẠNH PHÚC - NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Nguyễn Ngọc Trung Khóa: 48K Số hiệu sinh viên: 0752048590 Ngành: Công nghệ thực phẩm Tên đề tài: Nghiên cứu đặc tính enzyme chitinase từ Trichoderma Nội dung nghiên cứu, thiết kế tốt nghiệp: Họ tên cán hướng dẫn: ThS Đào Thị Thanh Xuân Ngày giao nhiệm vụ đồ án: Ngày 01 tháng 07 năm 2011 Ngày hoàn thành đồ án: Ngày 20 tháng 12 năm 2011 Ngày Chủ nhiệm môn (Ký, ghi rõ họ, tên) tháng năm 2011 Cán hướng dẫn (Ký, ghi rõ họ, tên) Sinh viên hoàn thành nộp đồ án tốt nghiệp ngày tháng năm Người duyệt (Ký, ghi rõ họ, tên) BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM ĐỘC LẬP - TỰ DO - HẠNH PHÚC - BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Nguyễn Ngọc Trung Khóa: 48K Cán hướng dẫn: Cán duyệt: Số hiệu sinh viên: 0752048590 Ngành: Công nghệ thực phẩm ThS Đào Thị Thanh Xuân ThS Trần Thị Phương Chi Nội dung nghiên cứu, thiết kế: ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………… Nhận xét cán hướng dẫn: ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… …………………………………… Ngày tháng năm 2011 Cán hướng dẫn (Ký, ghi rõ họ, tên) TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH ĐỘC LẬP - TỰ DO - HẠNH PHÚC - BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Nguyễn Ngọc Trung Khóa: 48K Cán hướng dẫn: Cán duyệt: Số hiệu sinh viên: 0752048590 Ngành: Công nghệ thực phẩm ThS Đào Thị Thanh Xuân ThS Trần Thị Phương Chi Nội dung nghiên cứu, thiết kế: ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………… Nhận xét cán duyệt: ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… …………………………………… Ngày tháng năm 2011 Cán hướng dẫn (Ký, ghi rõ họ, tên) LỜI CẢM ƠN Đầu tiên xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới Cơ ThS Đào Thị Thanh Xuân, giảng viên khoa Hoa học, Trường Đại học Vinh tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức chuyên môn, quan tâm tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành tốt luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tới thầy cơ, cán hướng dẫn thí nghiệm phịng hóa Thực Phẩm, Phịng hóa Hữu cơ, Trung tâm kiểm định chất lượng thực phẩm Trường Đại học Vinh hỗ trợ tài liệu tham khảo, hóa chất giúp đỡ ý kiến quý báu cho suốt thời gian nghiên cứu đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới bạn Phịng thí nghiệm thực phẩm tạo điều kiện giúp tơi hồn thành đồ án Sau tơi xin gửi lịng biết ơn sâu sắc đến già đình bạn bè quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho suốt thời gian học làm đề tài Đây nguồn động viên vững giúp tơi vượt qua khó khăn để hoàn thành tốt luộn văn Vinh, tháng 12 năm 2011 Sinh Viên Nguyễn Ngọc Trung MỤC LỤC Trang LỜI MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN 1.1 Enzyme chitinase 1.1.1 Cấu trúc 1.1.2 Phân loại 1.1.2.1 Dựa vào phản ứng phân cắt 1.1.2.2 Dựa vào trình tự amoni acid 1.1.3 Cấu trúc hệ enzyme chitinase 1.1.3.1 Cấu trúc enzyme chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 1.1.3.2 Cấu trúc enzyme chitinase thuộc họ Glycohydrolase 19 1.1.4 Các đặc tính enzyme chitinase 1.1.4.1 Trọng lượng phân tử 1.1.4.2 Điểm đẳng điện – Phổ hấp thu – Hằng số Michaelis 1.1.4.3 Ảnh hưởng nhiệt độ 1.1.4.4 Ảnh hưởng pH 1.1.4.5 Chất tăng hoạt – chất ức chế 1.1.4.6 Ổn định hoạt tính [47] 1.1.5 Các phương pháp tinh enzyme 1.1.5.1 Các phương pháp kết tủa để phân đoạn enzyme 1.1.5.2 Phương pháp sắc ký 11 1.2 Các loại chất enzyme chitinase 13 1.2.1 Chitin 13 1.2.2 Tính chất chitin 14 1.2.3 Các dẫn xuất chitin 15 1.3 Cơ chế tác dụng hệ enzyme chitinase 15 1.4 Các nguồn thu nhận enzyme chitinase 17 1.4.1 Chitinase vi khuẩn 17 1.4.2 Chitin nấm 18 1.4.3 Chitinase thực vật 18 1.4.4 Chitinase động vật 18 1.5 Thu nhận chitinase từ Trichoderma 19 1.5.1 Giới thiệu Trichoderma 19 1.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp chitinase 21 1.5.2.1 Thành phần môi trường nuôi cấy nấm trichoderma sinh chitinase 21 1.5.2.2 Yếu tố môi trường bên đến khả sinh enzyme chitinase nấm sợi 22 1.6 Ứng dụng enzyme chitinase nông nghiệp y dược 23 1.6.1 Ứng dụng enzyme chitinase nông nghiệp 23 1.6.2 Ứng dụng enzyme chitinase y dược 25 1.7 Sơ lược nghiên cứu chitinase 27 1.7.1 Trên giới 27 1.7.2 Trong nước 28 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 30 2.1 Vật liệu 30 2.1.1 Nguồn nguyên liệu thu nhận enzyme chitinase 30 2.1.2 Các chủng vi sinh vật dùng thực nghiệm 30 2.2 Môi trường 31 2.2.1 Môi trường giữ giống vi sinh vật 31 2.2.2 Môi trường tuyển chọn 31 2.3 Hóa chất, thiết bị 31 2.3.1 Hóa chất 31 2.3.2 Dụng cụ, thiết bị 32 2.4 Phương pháp 33 2.4.1 Phương pháp tách chiết chitin từ vỏ tôm 33 2.4.2 Phương pháp nuôi cấy Trichoderma để thu nhận enzyme chitinase 34 2.4.3 Kỹ thuật cấy chuyền giữ giống 35 2.4.4 Phương pháp xác định hàm lượng glucosamin theo Elson – Morgan 35 2.4.5 Phương Pháp hoạt tính enzyme chitinase 37 2.4.6 Khảo sát thời gian thu nhận ảnh hưởng môi trường nuôi cấy 38 2.4.7 Tinh chế chitinase 38 2.4.8 Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme 39 2.4.8.1 Khảo sát ảnh hưởng T0 tới hoạt độ enzyme 39 2.4.8.2 Khảo sát ảnh hưởng pH tới hoạt độ enzyme 40 2.4.8.3 Khảo sát ảnh hưởng ion kim loại chất hữu lên hoạt tính enzyme chitinase 40 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 3.1 Dựng đường chuẩn glucosamin 41 3.2 Tuyển chọn chủng Trichoderma có khả sinh tổng hợp chitinase 41 3.4 Nghiên cứu thời gian thu nhận chitinase từ Trichoderma 095(2)TH 44 3.3 Tinh chế làm chitinase 45 3.3.1 Tinh sach chitinase từ Trichoderma 095(2)TH dung môi hữu 45 3.3.1.1 Tinh chitinase từ Trichoderma 095(2)TH ethanol 45 3.3.1.2 Tinh chitinase từ Trichoderma 095(2)TH acetone 47 3.4.1 Tinh chitinase từ Trichoerma 095(2)TH muối trung tính (NH4)2SO4 48 3.5 Nghiên cứu đặc tính chitinase từ Trichoserma 095(2)TH 49 3.5.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ chitinase từ Trichoserma 095(2)TH 49 3.5.2 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ enzyme chitinase từ Trichoderma 095(2)TH 51 3.5.3 Khảo sát ảnh hưởng ion kim loại lên hoạt tính enzyme chitinase từ Trichoderma 095(2)TH 52 3.5.4 Khảo sát ảnh hưởng số chất hữu lên hoạt tính enzyme chitinase từ Trichoderma 095(2)TH 54 Chương KẾT LUẬN 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Cách pha dung dich glucosamin chuẩn có nồng độ 10- 250 μg/ml 36 Bảng 3.1 Khả sinh tổng hợp chủng vi nấm Trichoderma 42 Bảng 3.2 Hoạt tính chitinase từ Trichoderma 095(2)TH 44 Bảng 3.3 Tinh chitinase từ Trichoderma 095(2)TH dung môi ethanol 45 Bảng 3.4 Tinh chitinase từ Trichoderma 095(2)TH dung môi acetone 47 Bảng 3.5 Tinh chitinase từ Trichoderma 095(2)TH muối trung tính (NH4)2SO4 48 Bảng 3.6 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ chitinase từ Trichoderma 095(2)TH 50 Bảng 3.7 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính Chitinase từ Trichoderma 095(2)TH 51 Bảng 3.8 Ảnh hưởng ion kim loại lên hoạt tính enzyme chitinase 53 Bảng 3.9 Hoạt tính enzyme chitinase từ Trichoderma 095(2)TH thu nhận tác nhân tủa dung môi hữu 55 49 Hoạt độ chitinase (đvht/ml) 140 120 100 80 Series1 60 40 20 TL 1:1 TL 1:2 TL 1:3 TL 1:4 TL 1:5 TL 1:6 TL 1:7 TL 1:0 Tye lệ (Ve/Vm d) Hình 3.6 Hoạt độ chitinase với tỷ Vm/Vdm muối trung tính (NH4)2SO4 từ Trichoderma 095(2)TH Từ kết ta thấy: Enzyme chitinase tủa tác nhân NH4(SO4)2 bão hịa có hoạt tính cao tỷ lê 1: hoạt tính enzym cao đạt 115.97% Ở tỷ lệ khác hoạt tính chitinase cao Từ kết này, chũng thấy enzyme chitinase với tỷ lệ 1: cho kết cao nhất, lựa chọn cho nghiên cứu 3.5 Nghiên cứu đặc tính chitinase từ Trichoserma 095(2)TH Sử dụng muối trung tính (NH4)2SO4 làm tác nhân tủa enzyme chitinase từ chủng 095(2)TH, tìm hiểu yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chất lượng chế phẩm như: pH dịch chiết, nhiệt độ kết tủa, ảnh hưởng ion kim loại số chất hữu lên hoạt tính enzym chitinase từ chủng 095(2)TH 3.5.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ chitinase từ Trichoserma 095(2)TH Tiến hành lọc tủa chitinase dich nuôi (NH4)2SO4 với tỷ lệ 1:3 (VE/VDM) ly tâm tách tủa 40c với vận tốc 6000v/phút 15 phút 50 Kết tủa hòa tan nước cất với thể tích thể tích dịch ni cấy ban đầu, ủ nhiệt độ 200C, 250C đến 600C 24h Kết khảo sát thể (bảng 3.6) Bảng 3.6 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ chitinase từ Trichoderma 095(2)TH Nhiệt độ (0C) ΔOD Trung bình Hàm lượng Glucosamin (μg/ml) Hoạt tính chung (đvht/ml) 200C 0.086 37.94 3.79 250C 0.095 43.56 4.357 300C 0.115 56.06 5.606 350C 0.140 71.69 7.169 400C 0.199 108.56 10.87 450C 0.261 147.31 14.73 500C 0.180 96.69 9.669 0.137 69.81 6.98 60 C Hoạt tính chitinase (đvht/ml) 16 14 12 10 0 20 40 60 80 Nhiệt độ Nhiệt độ Hình 3.7 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính chitinase Từ kết ta thấy: Chitinase từ Trichoderma 095(2)TH tối ưu nhiệt độ 450C, chitinase từ Trichoderma 095(2)TH enzyme chịu nhiệt tốt, nhiệt độ 200C đến 350C 51 emzyme hoạt động yếu, tăng nhiệt độ lên 40 0C hoạt độ tăng lên đáng kể tối ưu nhiệt độ 450C, tăng nhiệt độ lên 600C hoạt độ lại 50% so với hoạt độ cực đại Vậy nên nhiệt độ 45 0C hoạt độ enzyme chitinase cao 3.5.2 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ enzyme chitinase từ Trichoderma 095(2)TH Để nghiên cứu ảnh hưởng pH lên hoạt độ chitinase, tiến hành nuôi chủng môi trường tuyển chọn Sau ngày lấy dịch nuôi cấy kết tủa chitinase dịch nuôi (NH4)2SO4 với tỷ lệ 1:3 (Vm/Vdm), ly tâm tách tủa 40C với vận tốc 6000v/phút 15 phút Kết tủa hòa tan trở lại dãy đệm acetat có pH= 3; 3,5 ; 4; 4,5; 5; 5,5; Để làm pH mơi trường xảy phản ứng với thể tích thể tích dịch ni ban đầu, ủ nhiệt độ 450C từ Trichoderma 095(2)TH Kết khảo sát thể (bảng 3.7) Bảng 3.7 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính Chitinase từ Trichoderma 095(2)TH ΔOD Hàm lượng Glucosamin Hoạt độ chung Trung bình (μg/ml) (đvht/ml) 0.130 65.43 6.54 3.5 0.218 120.44 12.043 0.300 171.69 17.169 4.5 0.350 202.94 20.294 0.318 182.94 18.294 5.5 0.236 131.69 13.169 0.186 100.44 10.044 6.5 0.152 79.19 7.92 pH 52 Hoạt độ chitianse (đvht/ml) 25 20 095(2)TH 15 10 0 Giá trị pH Hình 3.8 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính chitinase Từ kết qua ta thấy: pH ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme, có thay đổi pH làm cho hoạt tính xúc tác enzyme thay đổi pH mà trạng thái ion hóa enzyme chất thể cách tốt gọi pH thích hợp pH thích hợp enzyme chitinase từ Trichoderma 095(2)TH nhiệt độ 450C 4.4 đến tối ưu pH=4.5 Như dựa vào cách phân loại chitinase theo pH hoạt độ chitinase từ Trichoderma 095(2)TH thuộc chitinase axit 3.5.3 Khảo sát ảnh hưởng ion kim loại lên hoạt tính enzyme chitinase từ Trichoderma 095(2)TH Để nghiên cứu ảnh hưởng kim loại chế phẩm enzyme chitinase ion kim loại cho vào ống nghiệm Ổn định mẫu nhiệt độ tối ưu 450C 24 Xác định hoạt tính enzyme chitinase theo phương pháp Morgan – Elson Hệ số pha loảng d= 1.5 Sau tiến hành thí nghiệm chúng tơi thu kết sau: 53 Bảng 3.8 Ảnh hưởng ion kim loại lên hoạt tính enzyme chitinase Hàm lượng Hoạt độ Tỷ lệ (%) Glucosamin chung tăng (giảm (μg/ml (đvht/ml) hoạt tính) 0.263 148.56 14.86 100 Ca2+ 0.303 173.56 17.37 (+)16.9 Mg2+ 0.401 234.81 23.48 (+)58 Zn2+ 0.364 211.69 21.17 (+)42.5 Cu2+ 0.389 227.31 22.73 (+)53 Fe3+ 0.206 112.94 11.29 (-) Mn2+ 0.224 124.19 12.42 (-) Ion ΔOD kim loại Trung bình Đối chứng (+) : Kích thích (tăng hoạt tính enzyme) (-) : Kìm hãm (Giảm hoạt tính enzym) Biểu đồ biểu diễn thay đổi hoạt tính enzyme chitinase tác động ion kim loại Hoạt tính chitinase (đvht/ml) 25 20 15 095(2)TH 10 ĐC Ca2+ Mg2+ Zn2+ Cu2+ Fe3+ Mn2+ ion kim loại (1m M/m l) Hình 3.9 Sự thay đổi hoạt tính enzyme chitinase tác động ion kim loại 54 Dựa tác động ion kim loại hoạt tính enzyme chitinase, chúng tơi chia thành nhóm + Nhóm kích thích (Ca2+, Mg2+, Zn2+, Cu2+): Đa số thuộc nhóm cation hóa trị 2, kích thích tăng hoạt tính enzyme chitinase cách rõ rệt từ 16,9% đến 42.5 % so với đối chứng, chí tăng 58% (đối với Mg 2+) Các cation kim loại có ảnh hưởng đến tính chất phân tử enzyme, thường liên kết tương đối chặt chẽ với bề mặt phân tử enzyme, có vai trị quan trọng việc tạo thành giữ ổn định cấu hình khơng gian cần thiết phân tử enzyme chitinase để đảm bảo thực phản ứng thủy giải chitin + Nhóm khơng tác động (Fe3+, Mn2+): Các cation khơng ảnh hưởng rõ rệt đến hoạt tính enzyme chitinase (tỷ lệ tăng giảm hoạt tính