Tận dụng nguồn phế liệu của các nhà máy chế biến thủy hải sản đế sản xuất glucosamin bằng chế phẩm chitinase từ trichoderma

Tr-ờng đại học vinh khoa hóa học === === đồ án tốt nghiệp Đề tài: TN DNG NGUN PH LIỆU CỦA CÁC NHÀ MÁY CHẾ BIẾN THỦY HẢI SẢN ĐỂ SẢN XUẤT GLUCOSAMIN BẰNG CHẾ PHẨM CHITINASE TỪ TRICHODERMA GV h-íng dÉn SV thùc hiƯn Líp : M· sè SV : : Ths Đào Thị Thanh Xuân : ng Thị Thanh Hiên 49K - C«ng nghƯ thùc phÈm 0852045304 NghÖ an - 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH ĐỘC LẬP - TỰ DO - HẠNH PHÚC NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Đặng Thị Thanh Hiên Khóa: 49 Ngành: Cơng Nghệ thực phẩm Số hiệu sinh viên: 0852045304 Tên đề tài: “Tận dụng nguồn phế liệu nhà máy chế biến thủy hải sản để sản xuất chitinase, glucosamin” Nội dung nghiên cứu, thiết kế tốt nghiệp: …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… Họ tên cán hƣớng dẫn: ThS Đào Thị Thanh Xuân Ngày giao nhiệm vụ đồ án: Ngày tháng năm Ngày hoàn thành đồ án: Ngày tháng năm Ngày tháng năm 2012 Chủ nhiệm môn Cán hƣớng dẫn (Ký, ghi rõ họ, tên) (Ký, ghi rõ họ, tên) Sinh viên hoàn thành nộp đồ án tốt nghiệp ngày tháng năm 2012 Ngƣời duyệt (Ký, ghi rõ họ, tên) BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH ĐỘC LẬP - TỰ DO - HẠNH PHÚC BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Đặng Thị Thanh Hiên Số hiệu sinh viên: Khóa: Ngành: Cơng nghệ thực phẩm 49 0852045304 Cán hướng dẫn: ThS Đào Thị Thanh Xuân Cán duyệt: Nội dung nghiên cứu, thiết kế: …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… Nhận xét cán hƣớng dẫn: …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… ……………………………… …………………………………… Ngày tháng năm 2012 Cán hƣớng dẫn (Ký, ghi rõ họ, tên) BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH ĐỘC LẬP - TỰ DO - HẠNH PHÚC BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Đặng Thị Thanh Hiên Số hiệu sinh viên: Khóa: Ngành: Cơng nghệ thực phẩm 49 0852045304 Cán hướng dẫn: ThS Đào Thị Thanh Xuân Cán duyệt: Nội dung nghiên cứu, thiết kế: …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… Nhận xét cán duyệt: …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… ……………………………… …………………………………… Ngày tháng năm 2012 Cán duyệt (Ký, ghi rõ họ, tên) Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án cố gắng thân, em xin chân thành cảm ơn giúp đỡ kiến thức, tinh thần góp ý thầy, mơn cơng nghệ thực phẩm - Khoa Hóa - Trường Đại học Vinh Đặc biệt em xin chân thành gửi lời cảm ơn tới ThS Đào Thị Thanh Xuân, tận tình hướng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ em thời gian thực đồ án Em xin gửi lời cảm ơn đến cán bộ, giảng viên khoa Nông - Lâm - Ngư, Trường Đại học Vinh cung cấp cho em chủng Trichoderma Em xin chân thành cảm ơn cán phịng thí nghiệm khoa Hóa học tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đồ án Cuối em xin tỏ lịng biết ơn tới gia đình bạn bè động viên, giúp đỡ em suốt trình học tập làm đồ án Đây nguồn động viên vững giúp em vượt qua khó khăn để hồn thành tốt đồ án Do hạn chế trình độ kinh nghiệm, nên đồ án cịn nhiều thiếu sót, mong giúp đỡ góp ý thầy, bạn Em xin chân thành cảm ơn ! Vinh, tháng 12 năm 2012 Sinh viên Đặng Thị Thanh Hiên SVTH: Đặng Thị Thanh Hiên i Lớp: 49K - CN Thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân TÓM TẮT ĐỒ ÁN Tận dụng nguồn phế liệu nhà máy chế biến thủy hải sản để sản xuất glucosamin chế phẩm chitinase từ Trichoderma  Nội dung nghiên cứu - Thu nhận enzyme chitinase từ nấm Trichoderma - Nghiên cứu điều kiện hoạt động tối ưu enzyme chitinase - Thủy phân chitin enzyme chitinase thu sản phẩm glucosamin - Nâng cao hiệu suất thủy phân chitin enzyme  Kết thu  Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng tới trình sinh tổng hợp chitinase từ nấm Trichoderma 095(2)TH môi trường lỏng : - Thời gian nuôi cấy : ngày - Nhiệt độ nuôi cấy : 300C - pH nuôi cấy : pH =  Nghiên cứu số đặc tính enzyme chitinase tách chiết từ chủng Trichoderma 095(2)TH : - Nhiệt độ tối ưu : top = 450C - pH tối ưu : pHop = 4.5  Điều chế N-acetyl-D-glucosamin sử dụng chitinase thủy phân chitin điều kiện nhiệt độ 450C , pH = 4.5 Phản ứng thủy phân đạt hiệu suất cao 76.8% : - Nồng độ chitin huyền phù : 2.5% - Theo tỉ lệ E /S : 15 U/g - Thời gian thủy phân : ngày  Nâng cao hiệu suất thủy phần enzyme :Sử dụng phương pháp thêm dần chất mang lại hiệu suất chuyển hóa thành glucosamin cao đến 83.1% SVTH: Đặng Thị Thanh Hiên ii Lớp: 49K - CN Thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ĐỒ ÁN ii DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH VẼ viii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Chitin 1.1.1 Nguồn gốc tồn chitin tự nhiên 1.1.2 Cấu trúc hóa học chitin 1.1.3 Tính chất lý hố chitin 1.2 Enzyme chitinase 1.2.1 Định nghĩa 1.2.2 Phân loại 1.2.2.1 Dựa vào phản ứng phân cắt 1.2.2.2 Dựa vào cấu trúc phân tử 1.2.2.3 Dựa vào trình tự amoni acid 1.2.3 Tính chất enzyme chitinase 1.2.3.1 Trọng lượng phân tử 1.2.3.2 Điểm đẳng điện, số Michaelis 10 1.2.3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ 10 1.2.3.4 Ảnh hưởng pH 10 1.2.3.5 Chất tăng hoạt – chất ức chế 11 1.2.3.6 Ổn định hoạt tính 11 1.2.4 Các phương pháp tinh chế enzyme 11 1.2.4.1 Các phương pháp kết tủa phân đoạn enzyme 12 1.2.4.2 Phương pháp sắc ký 13 1.2.4.3 Phân tách lỏng - lỏng 14 1.2.5 Cơ chế tác dụng hệ enzyme chitinase 15 1.2.6 Các nguồn thu nhận enzyme chitinase 15 SVTH: Đặng Thị Thanh Hiên iii Lớp: 49K - CN Thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân 1.2.6.1 Chitinase vi khuẩn 16 1.2.6.2 Chitinase nấm 16 1.2.6.3 Chitinase thực vật 16 1.2.6.4 Chitinase động vật 16 1.2.7 Các loại chất enzyme chitinase 17 1.2.7.1 Chitin 17 1.2.7.2 Các dẫn xuất chitin 17 1.3 Glucosamin 18 1.3.1 Khái niệm, cấu trúc hóa học tinh chất hóa lý glucosamin 18 1.3.2 Cấu trúc hóa học tính chất số mối Glucosamin 19 1.3.2.1 Glucosamin hydroclorua 19 1.3.2.2 Glucosamin sulfat 19 1.3.2.3 Acetyl glucosamin 20 1.3.3 Tác dụng glucosamin 20 1.3.4 Tình hình nghiên cứu sản xuất glucosamin Việt Nam giới 21 1.3.4.1 Sản xuất Glucosamin phương pháp hóa học 21 1.3.4.2 Sản xuất glucosamin phương pháp enzyme 21 1.3.5 Một số ứng dụng Glucosamin 22 1.3.5.1 Điều trị bệnh khớp từ thiên nhiên 22 1.3.5.2 Glucosamin Chondroitin 23 1.3.5.3 Eutrolac old 23 1.4 Thu nhận enzyme chitinase từ nấm sợi Trichoderma 24 1.4.1 Giới thiệu Nấm sợi Trichoderma 24 1.4.1.1 Phân loại đặc điểm hình thái Trichoderma 24 1.4.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 25 1.4.1.3 Dinh dưỡng đường trao đổi chất Trichoderma 26 1.4.1.4 Tình hình nghiên cứu thu nhận chitinase từ Trichoderma 28 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 30 2.1 Vật liệu, hóa chất môi trường 30 2.1.1 Vật liệu 30 2.1.2 Hóa chất thiết bị 30 SVTH: Đặng Thị Thanh Hiên iv Lớp: 49K - CN Thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân 2.1.2.1 Hóa chất 30 2.1.2.2 Thiết bị, dụng cụ 31 2.1.3 Các môi trường nuôi cấy 31 2.1.3.1 Môi trường giữ giống PGA (Potato Glucose Agar) 31 2.1.3.2 Môi trường tuyển chọn 32 2.2 Phương pháp nghiên cứu 32 2.2.1 Kỹ thuật cấy chuyền giữ giống 32 2.2.2 Phương pháp nuôi cấy Trichoderma môi trường lỏng cho STH chitinase 32 2.2.3 Điều chế chitin từ vỏ tôm 32 2.2.4 Xác định hoạt độ enzyme chitinase ( phương pháp Elson – Morgan) 33 2.2.4.1 Nguyên tắc 33 2.2.4.2 Cách tính kết quả: 35 2.2.5 Xây dựng đường chuẩn glucosamine 35 2.2.6 Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme chitinase 36 2.2.6.1 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sinh tổng hợp enzym chitinase 36 2.2.6.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến sinh tổng hợp enzym chitinase 2.2.6.3 Nghiên cứu ảnh hưởng pH nuôi cấy đến sinh tổng hợp enzym chitinase 37 2.2.7 Nghiên cứu đặc tính enzyme chitinase chiết tách từ chủng nấm Trichoderma 09(2)TH 37 2.2.7.1 Tinh enzyme 37 2.2.7.2 Nghiên cứu nhiệt độ tối ưu enzyme chitinase 38 2.2.7.3 Nghiên cứu pH tối ưu enzyme chitinase 38 2.2.8 Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân chitin enzyme chitinase việc điều chế glucosamin 38 2.2.8.1 Nghiên cứu ảnh hưởng tỉ lệ E/S đến phản ứng thủy phân 39 2.2.8.2 Khảo sát ảnh hưởng thời gian phản ứng thủy phân 39 SVTH: Đặng Thị Thanh Hiên v Lớp: 49K - CN Thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân 2.2.9 Xác định hiệu suất thủy phân 40 2.2.10 Nâng cao hiệu suất thu hồi 40 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 3.1 Nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase từ chủng Trichoderma môi trường lỏng 41 3.1.1 Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp enzyme chitinase 41 3.1.1.1 Ảnh hưởng thời gian đến trình sinh tổng hợp enzyme chitinase 41 3.1.1.2 Ảnh hưởng pH đến trình sinh tổng hợp enzyme chitinase 43 3.2 Nghiên cứu số đặc tính enzyme chitinase chiết tách từ chủng Trichoderma 095(2)TH 45 3.2.1 Nghiên cứu nhiệt độ tối ưu enzyme chitinase 45 3.2.2 Nghiên cứu pH tối ưu enzyme chitinase 46 3.3 Điều chế N-acetyl-D-glucosamin sử dụng chitinase từ Trichoderma thủy phân chitin 47 3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ E/S đến phản ứng thủy phân 47 3.3.2 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian đến phản ứng thủy phân 48 3.4 Xác định hiệu suất thủy phân 49 3.5 Nâng cao hiệu suất thủy phân 50 KẾT LUẬN 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 SVTH: Đặng Thị Thanh Hiên vi Lớp: 49K - CN Thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân 2.2.9 Xác định hiệu suất thủy phân Hiệu suất thủy phân = Trong : m2 x 100% m1 - m1 : lượng chitin đưa vào phản ứng - m2 : lượng glucosamin ngày thủy phân nhiều - Tỉ lệ E/S = 15U/g - Phản ứng môi trường đệm acetate pH = 4,5 - Nhiệt độ thủy phân t = 450C Thời gian thủy phân số ngày mà thu hàm lượng glucosamin cao nghiên cứu phần 2.2.7.2 2.2.10 Nâng cao hiệu suất thủy phân Phương pháp thêm dần chất tiền hành sau:  Làm mẫu đối chứng (M1) - Mấu đối chứng bổ sung chất lần (3ml chitin huyền phù 2.5%) Tiến hành mục 2.2.7.2  Mẫu2 (M2): - Hút ml dịch enzyme chitinase thơ cho vào bình tam giác 50ml - Thêm ¼ tổng lượng chất ban đầu (3ml chitin 2.5%) - Bổ sung 8ml đệm acetat pH =4.5 - Sau thời điểm ngày, ngày, 5.5 ngày trình thủy phân, tiếp tục bổ sung ¼ tổng lượng chất (3ml chitin 2.5%) - Phản ứng tiến hành nhiệt độ 450C Quá trình thủy phân kéo dài đến ngày, sau tiến hành đo hàm lượng Glucosamin SVTH: Đặng Thị Thanh Hiên 40 Lớp: 49K - CN Thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase từ chủng Trichoderma môi trƣờng lỏng Trichoderma 095(2)TH chủng nấm có hoạt lực chitinase cao, phân lập Nghệ An lựa chọn cho trình sinh tổng hợp chitinase Để thu nhận chitinase, tiến hành nuôi chủng Trichoderma 095(2)TH môi trường dinh dưỡng chọn lọc có bổ sung chitin 1% chất kích thích cho q trình sinh tổng hợp Khả sinh tổng hợp chitinase vi sinh vật phụ thuộc thành phần dinh dưỡng môi trường mà chịu ảnh hưởng yếu tố : nhiệt độ, pH, Hoạt độ chitinase xác định phương pháp Elson – Morgan dựa sở định lượng Glucosamin tạo thành dịch nuôi cấy Để định lượng hàm lượng glucosamin tạo thành ta dựa vào đường chuẩn glucosamin xây dựng 0.7 y = 0.0011x + 0.122 R2 = 0.9992 Mật dộ quang (OD) 0.6 0.5 0.4 OD 0.3 Linear (OD) 0.2 0.1 0 100 200 300 400 500 600 Nồng độ glucos am in (m icrogam /m l) Hình 3.1 Đường chuẩn Glucosamin nng 300 ữ500 (àg/ml) 3.1.1 Nghiờn cu mt số yếu tố ảnh hƣởng đến trình sinh tổng hợp enzyme chitinase 3.1.1.1 Ảnh hƣởng thời gian đến trình sinh tổng hợp enzyme chitinase Vi sinh vật sau trải qua giai đoạn sinh trưởng phát triển ta tiến hành thu nhận enzyme Thời gian thích hợp để thu nhận enzyme hoạt độ enzyme đạt cao Chủng nấm Trichoderma 095(2)TH nuôi lắc môi SVTH: Đặng Thị Thanh Hiên 41 Lớp: 49K - CN Thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân trường lỏng 180 vịng/phút 300C Sau lấy mẫu thời điểm 3, 4, 5, 6, ngày để xác định hoạt độ theo phương pháp Elson-Morgan Kết thu sau : Bảng 3.1: Hoạt tính chitinase theo thời gian nuôi cấy môi trƣờng lỏng Thời gian (ngày) Mật độ quang (OD) Hoạt độ chitinase (µmol/ml/phút) 0,466 0,649 0,757 0,579 0,386 0.142 0.217 0.261 0.188 0.109 Hình 3.2 : Ảnh hưởng thời gian ni cấy lên hoạt tính enzyme chitnase thô chiết tách từ nấm Trichoderma 095(2)TH Kết cho thấy hoạt tính chitinase cao ngày ni cấy thứ 5, hoạt tính đạt 0.261(U/ml) Ta thu nhận dịch enzyme chitinase sau ngày nuôi cấy, dịch enzyme dùng để thực nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ, pH 3.1.1.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến trình sinh tổng hợp enzyme chitinase Mỗi enzyme thu từ loài, chủng khác có dải nhiệt độ hoạt động khác Để nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt lên trình sinh tổng hợp enzyme chitinase chúng tơi thực nuôi lắc chủng Trichoderma 095(2)TH môi SVTH: Đặng Thị Thanh Hiên 42 Lớp: 49K - CN Thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân trường chọn lọc tốc độ lắc 180 vòng/phút nhiệt độ khác 20 - 500C Sau tiến hành xác định hoạt độ sau ngày nuôi cấy Từ thực nghiệm ta có kết sau: Bảng 3.2: Hoạt tính chitinase theo nhiệt độ ni cấy môi trƣờng lỏng Nhiệt độ 20 oC 25 oC 30 oC 35 oC 40 oC 45 oC 50 oC Mật độ quang (OD) 0.551 0.694 0.759 0.665 0.571 0.436 0.389 0.176 0.235 0.262 0.223 0.185 0.129 0.109 Hoạt tính enzyme (µmol/ml/phút) Hình 3.3: Ảnh hưởng nhiệt độ mơi trường ni cấy lên hoạt tính chitinase chiết tách từ nấm Trichoderma 095(2)TH Từ kết cho thấy: - Hoạt tính enzyme chitinase tăng dần từ 20 – 30 oC, giảm dần từ 35-50 oC - Nhiệt độ để sinh tổng hợp enzyme chitinase từ chủng Trichoderma 095(2)TH 30oC 3.1.1.2 Ảnh hƣởng pH đến trình sinh tổng hợp enzyme chitinase Để nghiên cứu ảnh hưởng pH lên hoạt độ enzyme chitinase Chúng tiến hành nuôi chủng Trichoderma 095(2)TH môi trường chọn lọc pH khác SVTH: Đặng Thị Thanh Hiên 43 Lớp: 49K - CN Thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân nhiệt độ 300C, tiến hành lấy mẫu ngày nuôi thứ đem xác định hoạt độ Kết thu sau: Bảng 3.3: Hoạt tính chitinase theo pH nuôi cấy môi trƣờng lỏng pH Mật độ quang (OD) Hoạt tính chitinase UI (µmol/ml/phút) 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 0.497 0.694 0.761 0.647 0.549 0.493 0.154 0.236 0.262 0.216 0.176 0.152 Hình 3.4: Ảnh hưởng pH lên hoạt tính chitinase chiết tách từ nấm Trichoderma 095(2)TH Từ biểu đồ ta rút kết luận: PH có ảnh hưởng lớn đến khả sinh tổng hợp chitinase Sự thay đổi pH làm cho hoạt tính enzyme thay đổi Từ kết nghiên cứu cho thấy mơi trường có pH từ - có khả sinh tổng hợp enzyme tùy vào chủng vi nấm dựa vào việc khảo sát ảnh hưởng pH đến khả sinh tổng hợp chitinase từ 095(2)TH ta thấy Trichoderma sinh tổng hợp chitinase tốt PH = Kết luận: Từ nghiên cứu chúng tơi có kết luận chitinase thu nhận từ chủng nấm sợi Trichoderma 095(2)TH môi trường lỏng điều kiện : Nuôi lắc tủ lắc ổn nhiệt với tốc độ 180 vòng/phút, nhiệt độ 300C pH = ngày SVTH: Đặng Thị Thanh Hiên 44 Lớp: 49K - CN Thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân 3.2 Nghiên cứu số đặc tính enzyme chitinase chiết tách từ chủng Trichoderma 095(2)TH Để sử dụng enzyme cho nghiên cứu khác cần phải biết đặc tính Do enzyme thu nhận đem nghiên cứu đặc tính nhiệt độ tối ưu (top), pH tối ưu (pHop) sử dụng cho phản ứng điều chế glucosamin Enzyme thô thu nhận từ chủng nấm Trichoderma 095(2)TH tinh (NH4)2SO4 tỉ lệ 1: để kết tủa tủ lạnh 40C 2h Sau đem kết tủa ly tâm chế độ 7000 vòng 15 phút thu lấy phần cặn, rửa cặn nước cất ống ly tâm thu enzyme tinh 3.2.1 Nghiên cứu nhiệt độ tối ƣu enzyme chitinase Nhiệt độ tối ưu nhiệt độ mà enzyme hoạt động mạnh có nghĩa hoạt tính cao Khi nhiệt độ cao thấp nhiệt độ tối ưu hoạt tính enzyme giảm Chúng ta tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính chitinase để tìm nhiệt độ tối ưu nhất.Từ thực nghiệm ta có kết sau: Bảng 3.4: Hoạt tính chitinase theo nhiệt độ phản ứng T0C OD 20 25 30 35 40 45 50 55 60 0.428 0.647 0.873 1.042 1.205 1.296 1.211 1.106 1.037 Hoạt độ chitinase 0.167 0.287 0.412 0.504 0.593 0.643 0.596 0.539 0.501 (µmol/ml/phút) Hình 3.5 : Hoạt độ chitinase nhiệt độ khác SVTH: Đặng Thị Thanh Hiên 45 Lớp: 49K - CN Thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân Ta thấy nhiệt độ t = 450C enzyme chitinase hoạt động mạnh Ở nhiêt độ thấp nhiệt độ cao 450C hoạt độ giảm Điều nhiệt độ thấp cao 450C enzyme chitinase bị ức chế dẫn đến hoạt động thấp 3.2.2 Nghiên cứu pH tối ƣu enzyme chitinase Mỗi enzyme khác có pH hoạt động tối ưu thay đổi pH hoạt độ chúng khác Tại pH tối ưu hoạt độ chitinase cao Vì tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng pH tới hoạt độ chitinase Kết thu sau: Bảng 3.5: Hoạt tính chitinase theo pH phản ứng pH 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 Mật độ quang 0.432 0.698 1.150 1.316 1.201 0.893 0.169 0.315 0.563 0.654 0.591 0.442 Hoạt độ chitinase (µmol/ml/phút) Hình 3.6 : Hoạt độ chitinase pH khác Nhận xét : Hoạt độ enzyme chitinase tăng mạnh khoảng pH 3,5 – 4,5 giảm dần từ 5,0 – 5,5 Từ biểu đồ ta nhận thấy khoảng pH enzyme có hoạt tính cao 4,0-5,5 Và pH tối ưu enzyme chitinase chiết tách từ chủng Trichoderma 095(2)TH 4,5 Kết luận: Enzyme chitinase thu nhận từ chủng nấm sợi Trichoderma 095(2)TH có nhiệt độ tối ưu top = 450C pH tối ưu pHop = 4.5 sử dụng điều kiện tối ưu điều chế N-acetyl-D-glucosamin SVTH: Đặng Thị Thanh Hiên 46 Lớp: 49K - CN Thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân 3.3 Điều chế N-acetyl-D-glucosamin sử dụng chitinase từ Trichoderma thủy phân chitin Để điều chế N-acetyl-D-glucosamin sử dụng chitinase từ chủng Trichoderma 095(2)TH thủy phân chitin Phản ứng chịu tác động nhiều yếu tố khác Vì để điều chế N-acetyl-D-glucosamin có hiệu suất cao ta phải nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình để tìm điều kiện tối ưu 3.3.1 Khảo sát ảnh hƣởng tỷ lệ E/S đến phản ứng thủy phân Ta biết tỷ lệ E/S định khác hiệu suất thủy phân khác Để xác định tỉ lệ E/S thích hợp để hàm lượng Glucosamin tạo thành lớn Để nghiên cứu ảnh hưởng tỉ lệ E/S ta tiến hành sau: - Chitin huyền phù đưa vào nồng độ 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3% tương ứng với tỉ lệ E/S 30; 25; 20; 15; 10 - Môi trường phản ứng đệm acetate pH = 4.5 - Nhiệt độ thủy phân t = 450C - Thời gian thủy phân 30 phút Kết thúc trình thủy phân, dịch lọc tiến hành đo hàm lượng Glucosamin thu phương pháp Elson – Morgan, kết thu sau: Bảng 3.6: Hàm lƣợng Glucosamin sau thủy phân tỉ lệ E/S khác Tỉ lệ E/S 10 15 20 25 30 Mật độ quang 0.932 1.028 0.867 0.794 0.719 Hàm lượng glucosamin(µg/ml) 736.4 823.6 677.3 610.9 518.2 Hình 3.7: Hàm lượng glucosamin sau thủy phân tỉ lệ E/S SVTH: Đặng Thị Thanh Hiên 47 Lớp: 49K - CN Thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân Qua bảng kết cho thấy tỉ lệ E/S thích hợp cho phản ứng 15U/g ( tương ứng nồng độ chitin huyền phù 2.5%) Điều tỉ lệ 15U/g thích hợp cho phân cắt chitinase Ở tỉ lệ 20U/g, 25U/g 30U/g lượng enzyme khơng đủ để thủy phân hết lượng chất chitin, tỉ lệ 10U/g lượng enzyme lại cao gây ức chế hoạt động thủy phân chitinase, mà hàm lượng Glucosamin giảm 3.3.2 Kết khảo sát ảnh hƣởng thời gian đến phản ứng thủy phân Thời gian thủy phân dài lượng Glucosamin tạo thành nhiều, nhiên điều xảy giới hạn định, lượng chất chitin hết lượng Glucosamin ngừng tăng Để nghiên cứu ảnh hưởng thời gian đến trình thủy phân ta thực phản ứng thủy phân theo tỉ lệ E/S 15U/g điều kiện nhiệt độ 450C, pH = 4.5 Tiến hành đo hàm lượng glucosamin thời điểm 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, theo phương pháp Elson – Morgan Bảng 3.7: Giá trị hàm lƣợng glucosamin thời gian phản ứng khác Hàm lƣợng Glucosamin Thời gian (ngày) ∆OD 2.123 1819.1 2.507 2168.2 2.792 2427.3 3.059 2670 3.477 3050.1 3.937 3468.5 4.348 3842 4.348 3842 4.348 3842 SVTH: Đặng Thị Thanh Hiên (µg/ml) 48 Lớp: 49K - CN Thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân Hình 3.8: Hàm lượng glucosamin sau ngày thủy phân Qua bảng kết ta thấy hàm lượng glucosamin cao sau ngày thủy phân Lúc đầu hàm lượng glucosamin tăng dần, lượng chất chitinase hoạt động mạnh, nhiên đến ngày thứ hàm lượng bắt đầu ngừng tăng enzyme bị giảm hoat tính 3.4 Xác định hiệu suất thủy phân Hiệu suất thủy phân H = m2  100 m1 Trong đó: m1: lượng chitin đưa vào tham gia phản ứng m2: hàm lượng glucosamin thu Phương trình phản ứng: (C8H13O5N)n + nH2O nC8H15O6N + m1 hàm lượng chitin đưa vào tính sau: Ta hút 3ml dịch chitin huyền phù 2.5% để tham gia phản ứng thủy phân Vậy hàm lượng chitin đưa vào để thực trình thủy phân m1 = -3 = x 10 g/ml = mg/ml (Tổng số ml hỗn hợp phản ứng 15 ml) + m2 hàm lượng Glucosamin tạo thành sau ngày thủy phân m2 = = 3841.8 µg/ml = 3.8418 mg/ml Vậy hiệu suất thủy phân là: H = SVTH: Đặng Thị Thanh Hiên m2  100 = m1 49 x 100 = 76.8 % Lớp: 49K - CN Thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân 3.5 Nâng cao hiệu suất thủy phân chitin enzyme Trong q trình thủy phân, enzyme khơng bị mà lượng chất lại giảm dần trình chuyển hóa thành sản phẩm Bên cạnh chất thêm vào lúc với hàm lượng cao ức chế enzyme làm cho phản ứng thủy phân đạt hiệu suất thấp Do để nâng cao hiệu suất thủy phân ta sử dụng phương pháp bổ sung chất làm nhiều lần sau: Cùng lượng chất tiến hành làm song song hai mẫu - Mẫu 1(M1): Bổ sung từ đầu lượng chất theo tỉ lệ E/S 15 U/g - Mẫu 2(M2):Bổ sung làm lần thời điểm ban đầu thời điểm 2; 4; 5.5 ngày Kết đo hàm lượng glucosamin sau ngày thủy phân thu được: Bảng 3.8 Hiệu suất phản ứng thủy phân bổ sung chất vào lần nhiều lần Mẫu thí nghiệm M1 M2 Hàm lượng glucosamin (µg/ml) 3842 4165.3 Hiệu suất (%) 76.8 83.1 Hình 3.9: So sánh hiệu suất chuyển hóa thành glucosamin bổ sung chất vào lần nhiều lần Kết khảo sát thí nghiệm đối chứng cho thấy: Hiệu suất chuyển hóa chitin thành glucosmin cao bổ sung chất phương pháp thêm chất đạt 83.1% hàm lượng glucosamin đạt 4.156 mg/ml cao so với mẫu tiếp chất lần SVTH: Đặng Thị Thanh Hiên 50 Lớp: 49K - CN Thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân KẾT LUẬN Đề tài đạt số kết sau :  Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng tới trình sinh tổng hợp chitinase từ nấm Trichoderma 095(2)TH môi trường lỏng : - Thời gian nuôi cấy : ngày - Nhiệt độ nuôi cấy : 300C - pH nuôi cấy : pH =  Nghiên cứu số đặc tính enzyme chitinase tách chiết từ chủng Trichoderma 095(2)TH : - Nhiệt độ tối ưu : top = 450C - pH tối ưu : pHop = 4.5  Điều chế N-acetyl-D-glucosamin sử dụng chitinase thủy phân chitin điều kiện nhiệt độ 450C , pH = 4.5 Phản ứng thủy phân đạt hiệu suất cao 76.8% : - Nồng độ chitin huyền phù : 2.5% - Theo tỉ lệ E /S : 15 U/g - Thời gian thủy phân : ngày  Nâng cao hiệu suất thuỷ phân chitin enzyme Sử dụng phương pháp thêm dần chất mang lại hiệu suất chuyển hóa thành glucosamin cao đến 83.1 % SVTH: Đặng Thị Thanh Hiên 51 Lớp: 49K - CN Thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Nguyễn Đức Ý (Texas-Hoa Kỳ) “Dinh dưỡng với viêm khớp” Tạp chí sức khỏe đời sống, N0 344, tr 9-10, 2006 Bách khoa toàn thư bệnh học NXB từ điển BKHN, tập 2, tr 68-70 2000 Trần Thị Luyến, Huỳnh Nguyễn Duy Bảo số cộng “Hoàn thiện quy trình sản xuất Chitin-Chitosan chế biến số sản phẩm công nghiệp từ phế liệu vỏ tôm, cua” Báo cáo khoa học, Đề tài cấp Nha Trang.2000 Phạm Lê Dũng, Trịnh Bình, Lại Thu Hiền cộng “Vật liệu sinh học từ chitin” Viện hóa học - Viện cơng nghệ sinh học, Trung tâm khoa học tự nhiên Công nghệ quốc gia Hà Nội.1997 Đào Tố Quyên, Nguyễn Thị Lâm, Hà Thị Anh Đào & cộng “Nghiên cứu thử nghiệm PDP (chitosan) làm chất phụ gia sản xuất giò lụa, bánh cuốn” Viện dinh dưỡng Trung tâm kỹ thuật an toàn vệ sinh thực phẩm Việt Nam Nguyễn Thị Huệ, Bùi Thị Huyền “Nghiên cứu thủy phân chitosan axít hữu cơ” “Nghiên cứu phản ứng chitosan axít Fomic axít Acetic” Hội nghị khoa học cơng nghệ hóa hữu tồn quốc lần thứ III, tr 210-221 2005 Nguyễn Thị Đông, Đỗ Trường Thiện, Nguyễn Văn Hoan “Ứng dụng chitosan khối lượng phân tử thấp để kích thích sinh trưởng lúa” Tuyển tập cơng trình hội nghị khoa học cơng nghệ hóa hữu tồn quốc lần thứ 3, tr 445-449.2005 BS.Huỳnh Bá Lĩnh “Glucosamine, thuốc điều trị bệnh viêm khớp”.Bệnh Viện Việt Đức Hà Nội Tài liệu truy cập mạng internet, theo địa : vietduchospital.edu.vn TS Nguyễn Vĩnh Ngọc “Thuốc điều trị thối hóa khớp” Khoa xương khớp Bệnh Viện Bạch Mai Hà Nội Tạp chí Sức khỏe & đời sống ngày 30/5/2006, số 964 10 Lưu Vǎn Chính, Châu Vǎn Minh, Phạm Hữu Điển, Vũ Mạnh Hùng, Ngô Thị Thuận “Tổng hợp nghiên cứu tác dụng hạ Cholesterol máu N,N,Ntrimethyl chitosan (TMC)” Tạp chí Dược học số 9, mục 5, năm 2000 SVTH: Đặng Thị Thanh Hiên 52 Lớp: 49K - CN Thực phẩm Đồ án tốt nghiệp 11 GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân Vũ Thị Ngọc Thanh, Đoàn Trọng Phụ, Nguyễn Thị Ty “Nghiên cứu tác dụng tăng sinh collagen chitosan điều trị bỏng nhiệt thực nghiệm” Tạp chí Dược học số 9, mục 9, năm 2000 12 Nguyễn Xuân Hoài, Hoàng Kim Huyền “Đánh giá tác dụng phụ thuốc chống viêm không steroid (NSAID) điều trị bệnh xương khớp bệnh viện tuyến trung ương” Tạp chí Dược học số 9, mục10, năm 2000 13 Đặng Văn Luyến, “Chitin/Chitosan” Các giảng báo cáo chuyên đề, tập 2, tr 27-35, 1995 14 Đỗ Đình Rãng, Phạm Đình Cường, “Xác định hàm lượng chitin số loài thủy sản Việt Nam chuyển hóa thành glucosamin” Tạp chí khoa học, N0 4, tr 66- 71, 1990 Tài liệu nƣớc ngoài: 15 Elad & Y, I.Chet, P.Boyle and Y.Hennis (1983), Parasitism of Trichoderma spp On Rhizoctonia solani & Sclerotium rolfsii scaning electron microscopy and fluorescence microscopy, Phytopathology 73: pp 85 – 88 16 Elad, Chet I, Henusls Y (1982) Degradation of plant pathogenic fungi by Trichoderma harzianum, J Can J Microbiol, 1982, 28: 719 – 725 17 Elad, Y I Chet and Y.Hennis (1983), Ultrastructural studies of the interacti on between Trichoderma spp, and plant fungi 18 Esposito, E and Silva, M D 1998 Systematics and enviromental application of the genus Trichoderma, crical reviews in Microbiology 24 (2): 89 – 98 19 Fridlender, M.; Inbar, J.; Chet, I (1993) Biological control of soiborne plant pathogens by a b-1,3 glucanase producing Pseudomonas cepacia Soil Biol Biochem, 25, 1211-1221 20 Gray W.P (1997), Chitinase – maerial and method Patent WO97/47752 21 Geweky –El, R.M (1993), Biotechnology annual review Vol.2 22 Hamel.F, Boivin.R, Trembley.C, Bellemare.G 1997, Structural and evolutionary relationships among chitinase of flowering plants, J Mol Evol Vol 44, pp 614 – 624 23 Harman E.G, Kubicek P Christian (1998), Trichoderma & Gliocladium Vol pp 73 – 123 SVTH: Đặng Thị Thanh Hiên 53 Lớp: 49K - CN Thực phẩm Đồ án tốt nghiệp 24 GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân Harran.S, Oppenheim.A, Chet.I.(1998), Induction of the Trichoderma herzianum chitinolytic system is triggered by the chitin monomer, N – acetylglucosamine Mycological Research 102, pp 1224 – 1226 25 Hirano S, Inui H (1994), Biotechnology and Bioactive Polymers, Vol 2, pp 34 – 35 26 Hutchinson, S.A, and M.E Cowan (1972) Identification and biological effects of volatile metabolites from cultures of Trichoderma harzinum Trans.Br Mycol Soc 59; 71-77 27 Inbar J, Chet.I (1992), Biomimics of fungal cell-cell recognition by use of lectin coated nylon fibers, J bacterial 1992.Feb 174(3), pp 1055 – 1059 28 Jeuniaux.C, Braconnot.H (1971), Structure of chitin and chitosan Ann Chitin, paris, pp – 49 – 1811 29 Jeuniaux Charles (1963), Chitinase – Methods of Enzymology, Vol.4, pp 644- 650 30 Jolles P, Muzzaralli.A.R (1999), Chitin and chitinase Birkhauser verlag, Basel, Switzerland, pp 125 – 133 31 Lin,A, T.M Lee, and J-C.Rern (1994) Tricholin, a new antifugal agent from Trichoderma viride, and its action in biological conrol of Rhizotonia solani, J Anitbiotics 47: 799 – 805 32 Patil R S, Ghormade.V (2000), Chitinolytic enzymes: an exploration Enzyme and Microbial Technology 26 (2000) pp 473 – 483 33 Chet, I, G.E Harman, and R.Baker (1981), Trichoderma hamatum; Its hyphal interactions with Rhizoctonia solani & Pythium spp Microb Ecol 7, pp 28 – 29 SVTH: Đặng Thị Thanh Hiên 54 Lớp: 49K - CN Thực phẩm ... tạo nguồn nguyên liệu sản xuất thuốc chữa bệnh thối hóa khớp ngun liệu để sản xuất sản phẩm có giá trị khác thực đề tài ? ?Tận dụng nguồn phế liệu nhà máy chế biến thủy hải sản để sản xuất glucosamin. .. 49K - CN Thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân TÓM TẮT ĐỒ ÁN Tận dụng nguồn phế liệu nhà máy chế biến thủy hải sản để sản xuất glucosamin chế phẩm chitinase từ Trichoderma ... nghệ, cho ngành thủy sản phải sử dụng hợp lý hiệu lượng phế liệu nhà chế biến thủy sản tạo hàng ngày để oản xuất sản phẩm có giá trị cao chitin, chitosan, chitinase, glucosamin sản phẩm có giá trị