Tinh sạch enzym chitinase từ nấm trichoderma

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập -Tự -Hạnh phúc 664 NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên Khóa MSV Ngành : Quách Kiều Chinh : 50K - Hóa Thực Phẩm : 0952040380 : Công nghệ thực phẩm 1.Tên đề tài : Tinh enzyme chitinase từ Trichoderma Nội dung nghiên cứu, thiết kế tốt nghiệp: Cán hƣớng dẫn Ngày giao nhiệm vụ đồ án Ngày hoàn thành đồ án : ThS Đào Thị Thanh Xuân : Ngày tháng năm 2013 : Ngày tháng năm 2014 Chủ nhiệm môn (Ký ghi rõ họ tên) Sinh viên hoàn thành nộp đồ án vào ngày Ngày tháng năm 2014 Cán hƣớng dẫn (Ký, ghi rõ họ tên) tháng năm 2014 Ngƣời duyệt (Ký, ghi rõ họ tên) Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH Độc lập -Tự -Hạnh phúc BẢN NHẬN XẾT TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên Khóa MSSV Ngành Cán hƣớng dẫn Cán duyệt : : : : : : Quách Kiều Chinh 50K - Hóa Thực Phẩm 0952040380 Cơng nghệ thực phẩm ThS Đào Thị Thanh Xuân Nội dung nghiên cứu, thiết kế: Nhận xét cán hƣớng dẫn: Ngày tháng năm 2014 Cán hƣớng dẫn (Ký, ghi rõ họ tên) SVTH: Quách Kiều Chinh Lớp 50K- Công nghệ Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập -Tự -Hạnh phúc BẢN NHẬN XẾT TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên Khóa MSV Ngành Cán hƣớng dẫn Cán duyệt : : : : : : Quách Kiều Chinh 50K - Hóa Thực Phẩm 0952040380 Cơng nghệ thực phẩm ThS Đào Thị Thanh Xuân Nội dung nghiên cứu, thiết kế: Nhận xét cán duyệt: Ngày tháng năm 2014 Cán duyệt (Ký, ghi rõ họ tên) SVTH: Quách Kiều Chinh Lớp 50K- Công nghệ Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn ThS Đào Thị Thanh Xuân, giảng viên Khoa Hóa học, trường Đại học Vinh tận tình hướng dẫn em suốt q trình nghiên cứu hồn thành đồ án tốt nghiệp Em xin cảm ơn thầy cô giáo, cán kỹ thuật viên phịng thí nghiệm Hóa thực phẩm, Phịng Hóa vơ tạo điều kiện giúp đỡ em thời gian nghiên cứu hoàn thành đồ án tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới bạn phịng thí nghiệm thực phẩm, bạn sinh viên khóa 50K Cơng nghệ thực phẩm tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành đồ án tốt nghiệp Cuối cùng, xin bày tỏ long biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, bạn bè động viên, giúp đỡ suốt q trình hồn thành đồ án tốt nghiệp Vinh, tháng 01 năm 2014 Sinh viên Quách Kiều Chinh SVTH: Quách Kiều Chinh Lớp 50K- Công nghệ Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân TÓM TẮT ĐỒ ÁN Tinh Enzyme chitinase từ Trichoderma Nội dung nghiên cứu: - Nghiên cứu dịch Enzym thô đƣợc lấy nuôi cấy mấm Trichoderma môi trƣờng lỏng nhiệt độ 300, lắc 180 vòng/ phút, ngày Và mang dịch enzym thô tinh - Các tác nhân tinh sạch: +) Nghiên cứu khả tinh Enzym dung dịch (NH4)2SO4 bão hòa +) Nghiên cứu khả tinh Enzym (NH4)2SO4 theo tỉ lệ so với % bão hòa +) Nghiên cứu khả tinh Enzym ethanol 99% +) Nghiên cứu khả tinh Enzym sắc kí cột - Khảo sát nhiệt độ tối ƣu pH tối ƣu để enzym đạt đƣợc hoạt tính cao - Xác định hiệu xuất tinh Kết thu đƣợc:  Dung môi lựa chọn để tinh enzyme chitinase chiết tách từ chủng Trichoderma 095(2)TH cho kết cao dung dịch (NH4)2SO4 đạt 70% so với dung dịch bão hòa  Nghiên cứu hoạt tính enzyme chitinase chiết tách từ chủng Trichoderma 095(2)TH.: - Nhiệt độ tối ƣu: 30oC - pH tối ƣu :  Khả tinh sắc kí cột với sephadex G75 với loại đệm khác : - Đệm Natri axetat có pH = 4.5 - ĐệmNatri axetat + Natri Clorua có pH = - Đệm Trí + Natri Clorua có PH = 4.5 SVTH: Quách Kiều Chinh Lớp 50K- Công nghệ Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xn DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1 Cấu trúc bậc enzyme chitinase Hình 1.2 Sơ đồ phân cắt chitin enzyme thuộc nhóm chitinase [38] Hình 1.3 Mơ hình cấu trúc khơng gian enzyme chitinase Serratia marcescens Hình 1.4 Mơ hình cấu trúc không gian chitinase Hodeum vulgare Hình 1.5 Mơ tả trình tự amoni acid Hình 1.6 Cấu trúc hóa học allosamidin dẫn xuất allosamidin [40] 10 Hình 1.7 Cấu trúc hóa học chitin [40] 21 Hình 1.8 Các dạng cấu trúc lập thể chitin 15 Hình 1.9 Cơ chế hoạt động hệ enzyme chitinase Trichoderma [24] 18 Hình 1.10 Sự phát triển nấm Trichoderma đĩa thạch (a) hình dạng sợi nấm Trichoderma (b) 22 Hình 1.11 Cấu trúc vách tế bào nấm sợi [44] 29 Hình 2.1 Chitin 36 Hình 2.2 Chitin huyền phù 1% Hình 2.3 Cƣờng độ màu nồng độ khác SVTH: Quách Kiều Chinh Lớp 50K- Công nghệ Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Nồng độ D-glucosamine xây dựng đƣờng chuẩn Bảng 3.1 Sự biến thiên hoạt độ chitinase tác nhân ethanol Bảng 3.2 Sự biến thiên hoạt độ chitinase bị ảnh hƣởng tác nhân (NH4)2SO4 so với nồng độ bão hòa Bảng 3.3 Sự biến thiên hoạt tính chitinase bị ảnh hƣởng tác nhân (NH4)2SO4 bão hòa Bảng 3.4.1 Kết sắc kí cột với đệm natri acetat có pH = 4.5 Bảng 3.4.2 Kết làm sắc khí cột với dung mơi Natri axetat + natri clorua 1%, với pH = 4.5 Bảng 3.4.3 Kết làm sắc kí cột với dung đệm Tris- HCl + Natri Clorua có pH = 4.5 Bảng Bảng so sánh độ tinh enzymer chitinase tác nhân làm Bảng 3.6.1 Khảo sát nhiệt độ tối ƣu (0C) : với dãy nhiệt độ từ 20 – 80 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Đồ thị 3.6.1 Biểu kết khảo sát nhiệt độ tối ƣu Đồ thị 3.5 Biểu kết khảo sát pH tối ƣu Đồ thị 3.1 Biểu diễn hoạt tính hàm lƣợng protein enzymer đƣợc tủa cồn lạnh SVTH: Quách Kiều Chinh Lớp 50K- Công nghệ Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân MỤC LỤC MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Nhiệm vụ nghiên cứu Vật liệu, phạm vi nội dung nghiên cứu 3.1 Vật liệu Ý nghĩa khoa học đề tài PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Enzyme chitinase 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Phân loại 1.1.2.1 Dựa vào phản ứng phân cắt 1.1.2.2 Dựa vào cấu trúc phân tử 1.1.2.3 Dựa vào trình tự amoni acid 1.1.3 Các đặc tính hệ enzyme chitinase 1.1.3.1 Trọng lƣợng phân tử 1.1.3.2 Điểm đẳng điện, số Michaelis 1.1.3.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ 1.1.3.4 Ảnh hƣởng pH 1.1.3.5 Chất tăng hoạt – chất ức chế 1.1.3.6 Ổn định hoạt tính 1.2 Chitin chất enzyme chitinase 1.3 Thu nhận enzyme chitinase từ nấm sợi Trichoderma 1.3.1 Giới thiệu Nấm sợi Trichoderma 1.3.1.1 Phân loại đặc điểm hình thái Trichoderma 1.3.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 1.3.1.3 Dinh dƣỡng đƣờng trao đổi chất Trichoderma 1.3.1.4 Ảnh hƣởng yếu tố bên lên sƣ phát triển nấm Trichoderma - Nƣớc 1.3.2 Tình hình nghiên cứu thu nhận chitinase từ Trichoderma 1.5.2.1 Thế giới SVTH: Quách Kiều Chinh Lớp 50K- Công nghệ Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân 1.3.2.2 Trong nƣớc 1.4 Ứng dụng chitinase nông nghiệp y học 1.4.1 Một số ứng dụng hệ enzyme chitinase nông nghiệp 1.4.1.1 Sử dụng enzyme chitinase kiểm soát nấm gây bệnh thực vật 1.4.1.2 Sử dụng enzyme chitinase kiểm sốt trùng 1.4.2 Một số ứng dụng Y học 1.5 Các phƣơng pháp tách tinh enzymer PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.2 Các môi trƣờng nuôi cấy 2.2.1 Môi trƣờng giữ giống PGA (Potato Glucose Agar): 2.2.2 Môi trƣờng tuyển chọn 2.3 Hóa chất thiết bị 2.3.1 Hóa chất 2.3.2 Thiết bị, dụng cụ 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1 Điều kiện nuôi cấy 2.4.2 Kỹ thuật cấy chuyền giữ giống 2.4.3 Phƣơng pháp tách chiết chitin từ vỏ tôm 2.4.4 Xác định hoạt độ chitinase ( phƣơng pháp Elson – Morgan) 2.4.4.1 Phƣơng pháp xác định 2.4.4.2 Xây dựng đƣờng chuẩn glucosamine 2.4.4.3 Cách tính kết 2.5 Định lƣợng protein phƣơng pháp LOWRY 2.5.1 Nguyên tắc: 2.5.2 Dụng cụ hóa chất 2.5.3 Thực hành 2.6 Cách xác định hoạt tính riêng Enzym Chitinase 2.7 Tinh chế chitinase 2.7.2 Tinh chế Enzym chitinase phƣơng pháp sắc kí cột 2.7.2.1 Nguyên tắc 2.7.2.2 Dụng cụ hóa chất 2.7.2.3 Cách chuẩn bị cột SVTH: Quách Kiều Chinh Lớp 50K- Công nghệ Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân 2.7.2.4 Chuẩn bị mẫu 2.7.2.5 Thu xác định mẫu tách 2.7.3 Nghiên cứu yếu tốnhiệt độ pH tối ƣu ảnh hƣởng đến hoạt tính chitinase 2.7.3.1 Khảo sát nhiệt độ tối ƣu cho hoạt tính cao chitinase 2.7.3.2 Khảo sát pH tối ƣu cho hoạt tính cao chitinase 2.8 Xác định độ tinh enzymer 3.1 Đƣờng chuẩn glucosamin dùng để xác định hoạt tính 3.2 Đƣờng chuẩn albumin dùng để xác định hàm lƣợng protein tổng số 3.3 Tinh chitinase tác nhân hóa học 3.3.1 Tinh Enzym chitinase tác nhân ethanol 3.3.2 Tinh Emzym tác nhân (NH4)2SO4 có hàm lƣợng phần trăm so với bão hòa 3.4 Tinh enzym sử dụng sắc kí cột 3.4.2 Tinh sắc kí cột với dung dịch đệm Natri axetat + Natri Clorua 1% có pH = 4.5 3.4.3 Tinh sắc kí cột với dung dịch đệm Tris + NaCl 3.5 So sánh độ tinh enzymer tác nhân tinh 3.6 Nghiên cứu số dắc tính ảnh hƣởngtới hoạt tính enzym chitinase 3.6.1 Nghiên cứu nhiệt độ tối ƣu ảnh hƣởng tới hoạt tính Enzyme chitinase PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận 4.2 Kiến nghị TÀI LIỆU THAM KHẢO MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Enzyme chất xúc tác sinh học, có chất protein, có cấu trúc phân tử phức tạp tinh vi, hoạt lực xúc tác cao nhiều so với chất xúc tác thông thƣờng, có tính đặc hiệu cao SVTH: Qch Kiều Chinh Lớp 50K- Công nghệ Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân Bảng 3.3 Sự biến thiên hoạt tính chitinase bị ảnh hƣởng tác nhân (NH4)2SO4 bão hòa Tỉ lệ Ve/Vtn Hoạt tính ( UI ) Protein tổng số (mg) Hoạt tính riêng ( UI/mg ) Độ tinh 1:0 35.87 0.65 55.18 1:1 27.35 0.39 70.13 1.27 1:2 29.09 0.40 72.73 1.32 1:3 34.28 0.203 168.87 3.06 1:4 28.91 0.39 74.13 1.34 1:5 27.80 0.42 66.19 1.20 40 0.7 35 0.6 Hoạt tính 30 0.5 25 0.4 20 0.3 15 0.2 10 0.1 0 1:00 1:01 1:02 1:03 1:04 Hàm lượng protein Làm enzymer với tác nhân muối amoni sunfat bão hịa Hoạt tính Protein tổng số 1:05 tỉ lệ thể tích enzymer: muối amoni sunfat bão hịa Đồ thị 3.3 Biểu diễn hoạt tính hàm lƣợng protein enzymer đƣợc tủa (NH4)2SO4 bão hòa Nhìn vào đồ thị ta thấy tỉ lệ 1:3 đạt tỉ lệ tủa protein cao ta thu đƣợc hoạt tính cao Khi nồng độ muối (NH4)2SO4 bão hịa cao lƣợng protein cao mà hoạt tính enzymer giảm Khi có lẫn nhiều loại protein khác mà khả tủa chọn lọc dần độ tinh giảm Độ tinh enzymer đạt kết cao tỉ lệ 1: 3.06 SVTH: Quách Kiều Chinh 66 Lớp 50K- Công nghệ Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân 3.4 Tinh enzym sử dụng sắc kí cột Ta tiến hành làm enzymer kĩ thuật sắc kí cột với hệ đệm khác nhƣ : Natri axetat, natri axetat + natri clorua, tris – HCl + NaCl Từ khảo sát đƣợc phân đoạn chitinase với hoạt tính cao nhât 3.4.1 Tinh enzym sắc kí cột với dung dịch đệm Natri axetat có pH = 4.5 Ta thực đƣa vào 12 ml dịch enzyme thơ vào cột sắc kí cột với thông số sau : - Gel : sephadex G 75 - Cột : 60*1.5 cm - Phân đoạn : 3ml / phân đoạn Chia phân đoạn thu mẫu - Sử dụng dòng chảy tự với tốc độ 8ml/giờ - Sau chất tiến hành mang xác định hoạt tính hàm lƣợng protein Từ khảo sát khả tinh enzymer đệm natri acetat bắng sắc kí cột Từ ta có bảng số liệu sau: Protein tổng số (mg) 0.65 Hoạt tính riêng (UI/mg) 55.18 Độ tinh Mt Hoạt tính (UI) 35.87 Pk1 29.68 0.24 123.67 2.24 Pk2 30.27 0.38 79.66 1.44 Pk3 30.26 0.35 86.46 1.57 Pk4 28.61 0.295 96.98 1.76 TT Bảng 3.4.1 Kết sắc kí cột với đệm natri acetat có pH = 4.5 SVTH: Quách Kiều Chinh 67 Lớp 50K- Công nghệ Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân 40 0.7 35 0.6 Hoạt tính 30 0.5 25 0.4 20 0.3 15 0.2 10 0.1 0 TT mt pk1 pk2 pk3 Hàm lượng protein Dùng hệ đệm Natri acetat pk4 Các phân đoạn chất Đồ thị 3.4 Biểu diễn hoạt tính hàm lƣợng protein enzymer đƣợc làm đệm Natri aceat Dựa vào đồ thị ta thấy phân đoạn đƣa peak giống phân đoạn Nhƣng độ tinh enzymer phân đoạn cao phân đoạn sau thấp Nhƣng khoảng cách tinh khơng có chênh lệch lớn nên ta nói khả tách làm đệm khơng cao 3.4.2 Tinh sắc kí cột với dung dịch đệm Natri axetat + Natri Clorua 1% có pH = 4.5 Ta thực đƣa vào 12 ml dịch enzyme thơ vào cột sắc kí cột với thông số sau : - Gel : sephadex G 75 - Cột : 60*1.5 cm - Phân đoạn : 3ml / phân đoạn Chia phân đoạn thu mẫu - Sử dụng dòng chảy tự với tốc độ 8ml/giờ - Sau chất tiến hành mang xác định hoạt tính hàm lƣợng protein Từ khảo sát khả tinh enzymer đệm natri acetat + natri clorua 1% bắng sắc kí cột SVTH: Quách Kiều Chinh 68 Lớp 50K- Công nghệ Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân Từ ta có bảng số liệu sau: Hoạt tính Protein tổng số Hoạt tính riêng (UI) (mg) (UI/mg) Mt 35.87 0.65 55.18 Pk1 23.00 0.21 109.52 1.98 Pk2 28.96 0.198 146.26 2.65 Pk3 32.57 0.158 206.14 3.73 Pk4 24.17 0.153 159.97 2.90 Pk5 20.09 0.168 119.58 2.16 TT Độ tinh Bảng 3.4.2 Kết làm sắc khí cột với dung mơi Natri axetat + natri clorua 1%, với pH = 4.5 40 0.7 35 30 0.6 0.5 25 20 0.4 15 10 0.2 0.3 0.1 Hàm lượng protein Hoạt tính Dùng hệ đệm Natri acetat + Natri Clorua Hoạt tính (UI) Protein tổng số (mg) Mt Pk1 Pk2 Pk3 Pk4 Pk5 Phân đoạn chất Đồ thị 3.5 Biểu diễn hoạt tính hàm lƣợng protein enzymer đƣợc làm đệm Natri aceat + Natri Clorua 1% Dựa vào liệu đồ thị ta thấy đƣa thêm tác nhân NaCl vào với đệm CH3COOH có tác dụng làm tăng độ phân cực khả làm SVTH: Quách Kiều Chinh 69 Lớp 50K- Công nghệ Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân enzymer tăng lên Chất cho hoạt tính độ tinh cao phân đoạn thứ với độ làm lên tới 3.73 3.4.3 Tinh sắc kí cột với dung dịch đệm Tris - HCl + NaCl Ta thực đƣa vào 12 ml dịch enzyme thơ vào cột sắc kí cột với thông số sau : - Gel : sephadex G 75 - Cột : 60*1.5 cm - Phân đoạn : 3ml / phân đoạn Chia phân đoạn thu mẫu - Sử dụng dòng chảy tự với tốc độ 8ml/giờ - Sau chất tiến hành mang sác định hoạt tính hàm lƣợng protein Từ khảo sát khả tinh enzymer đệm Tris – HCl + natri clorua bắng sắc kí cột Từ ta có bảng số liệu sau: Hoạt tính Protein tổng số Hoạt tính riêng (UI) (mg) (UI/mg) Mt 35.87 0.65 55.18 Pk1 23.76 0.072 330.00 5.98 Pk2 29.15 0.065 448.46 8.13 Pk3 31.90 0.053 601.89 10.91 Pk4 27.20 0.069 394.20 7.14 Pk5 22.16 0.073 303.56 5.50 TT Độ tinh Bảng 3.4.3 Kết làm sắc kí cột với dung đệm Tris- HCl + Natri Clorua có pH = 4.5 SVTH: Quách Kiều Chinh 70 Lớp 50K- Công nghệ Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân 40 0.7 35 30 0.6 0.5 25 20 0.4 15 10 0.2 0.3 0.1 Hàm lượng protein Hoạt tính Dung hệ đệm Tris-HCl + Nari Clorua Hoạt tính (UI) Protein tổng số (mg) Mt Pk1 Pk2 Pk3 Pk4 Pk5 Phân đoạn chất Đồ thị 3.5 Biểu diễn hoạt tính hàm lƣợng protein enzymer đƣợc làm đệm Tris- HCl + Natri Clorua Dựa vào đồ thị cho ta thấy khả tách chất đệm cho độ tinh cao Tại phân đoạn thứ ta nhận thấy làm tốt với độ tinh 10.91 Vậy đệm có khả tách enzyme tốt 3.5 So sánh độ tinh enzymer tác nhân tinh Từ bảng số liệu mục ta suy bảng để so sánh khả tinh enzymer chitinase phƣơng pháp khác Ta sử dụng phân đoạn thu đƣợc độ tinh cao phƣơng pháp Và ta khảo sát kết kảo sát với 1ml enzymer SVTH: Quách Kiều Chinh 71 Lớp 50K- Công nghệ Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân Tổng hàm Tác nhân tinh lƣợng protein (mg) Tổng hoạt tính (UI) Tổng hoạt tính riêng (UI/mg) Độ tinh Enzymer chƣa tinh 0.65 35.87 55.18 Enzymer đƣợc làm 0.42 23.35 58.38 1.06 0.203 34.28 168.87 3.06 0.209 33.05 158.13 2.87 0.158 32.57 206.14 3.73 0.053 31.90 601.89 10.91 0.24 29.68 123.67 2.24 cồn lạnh Tác nhân muối amoni sunfat bão hòa Tác nhân muối amoni sunfat khan Sắc kí với đệm Natri acetat +NaCl 1% Sắc kí với đệm Tris-HCl + NaCl Sắc kí với đệm Natri acetate Bảng 3.5 Bảng so sánh độ tinh enzymer chitinase tác nhân làm Từ bảng số liệu ta nhận thấy nhƣ sau: - Tổng hàm lƣợng protein: +) Cao enzymer thô chƣa tinh 0.65 +) Hàm lƣợng protein sử dụng tinh phƣơng pháp kết tủa tác nhân hóa học cho hàm lƣợng protein cao phƣơng pháp kết tủa với cồn 0.42 +) Hàm lƣợng protein thu đƣợc phƣơng pháp sắc kí cột cao với đệm Natri acetate 0.24 SVTH: Quách Kiều Chinh 72 Lớp 50K- Công nghệ Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân - Tổng hoạt tính : Sau làm song ta nhận thấy hoạt tính enzymer cao làm tác nhân muối amoni sunfat bão hòa 34.28 - Hoạt tính riêng enzymer chitinase phụ thuộc vào đại lƣợng hoạt tính hàm lƣợng protein Do ta thấy hoạt tính riêng cao đƣợc làm phƣơng pháp sắc kí cột dung dung dịch đệm tris-HCl + NaCl - Từ bảng số liệu ta nhận thấy độ tinh cao sử dụng phƣơng pháp sắc kí cột với dung dịch đệm tris- HCl + NaCl 10.91 Và độ tinh cao làm với tác nhân hóa học tủa với dung dich muối (NH4)2SO4 bão hòa - Khi sử dụng kĩ thuật sắc kí cột ta nhận thấy chất có hoạt tính cao khoảng cách không chênh lệch lớn phân đoạn kề Vậy nói chitinase bao gồm nhiều enzymer có hoạt tính phân giải liên kết 1,4glucosamin 3.6 Nghiên cứu số đặc tính ảnh hƣởngtới hoạt tính enzym chitinase 3.6.1 Nghiên cứu nhiệt độ tối ƣu ảnh hƣởng tới hoạt tính Enzyme chitinase - Enzymer sau tinh đƣợc hút xác ml vào ống nghiệm - Đánh số thứ tự mang khảo sát nhiệt độ khác dải nhiệt độ từ 20 – 800C - Sau đƣa xác định hoạt độ chitinase theo phƣơng pháp Elson – Morgan Kết thu đƣợc bảng dƣới : Bảng 3.6.1 Khảo sát nhiệt độ tối ƣu (0C) : với dãy nhiệt độ từ 20 – 80 Nhiệt độ 0C 200C 300C 400C 500C 600C 700C 800C Mật độ quang (OD) 0.235 0.3262 0.276 0.248 0.183 0.108 0.006 Hoạt tính chitinase 30.87 28.69 27.48 24.65 21.39 16.96 26.91 SVTH: Quách Kiều Chinh 73 Lớp 50K- Công nghệ Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân Đồ thị 3.6.1: Biểu kết khảo sát nhiệt độ tối ƣu Dựa vào kết nhận thấy rằng: hoạt tính enzyme chitinase cao nhiệt độ 30oC, vƣợt nhiệt độ 30oC hoạt độ chitinase giảm dần Nhƣ vậy, nhiệt độ tối ƣu enzyme chitinase 30 oC Bởi nhiệt độ tăng lên vận tốc phản ứng tăng tới ngƣỡng tới hạn Khi vƣợt qua ngƣỡng tốc độ phản ứng giảm 3.6.2 Nghiên cứu nồng độ pH ảnh hƣởng tới hoạt tính enzyme chitinase - Enzym sau tinh đƣợc hút xác ml hịa tan vào 1ml dung dịch đệm pH khác - Sử dụng dung dịch đệm có pH từ - 10 với thể tích thể tích enzym - Ủ nhiệt độ 300C 16 giờ, sau đƣa xác định hoạt độ chitinase theo phƣơng pháp Elson – Morgan Kết thu đƣợc bảng SVTH: Quách Kiều Chinh 74 Lớp 50K- Công nghệ Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp pH GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân Mật độ 10 0.2158 0.296 0.241 0.193 0.1662 0.152 0.1386 26.08 29.57 27.17 25.09 23.92 23.30 22.72 quang (OD) Hoạt tính Đồ thị 3.5: Biểu kết khảo sát pH tối ƣu Dựa vào kết cho thấy rằng: Hoạt độ chitinase cao pH = vƣợt q pH = hoạt độ chitinase có xu hƣớng giảm xuống pH môi trƣờng ảnh hƣởng tới độ ion hóa chất độ bền chất nên có tác động mạnh pH thi hoạt tính enzym giảm SVTH: Quách Kiều Chinh 75 Lớp 50K- Công nghệ Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Đã nghiên cứu tinh sạc enzym tác nhân hóa học nhƣ : ethanol, dung dịch muối (NH4)2SO4 bão hòa, dung dịch (NH4)2SO4 nồng độ % so với dung dịch bão hòa… Thu đƣợc tác nhân làm có độ tinh cao dung dịch muối (NH4)2SO4 bão hịa vói tỉ lệ Ve/Vtac nhân = 1:3 độ tinh 3.06 - Đã nghiên cứu làm sắc kí cột với hệ đệm: natr acetat, natri acetat + natri clorua, Tris – HCl + Natri Clorua Ta thấy độ tinh thu đƣợc sử dụng dung dịch đệm Tris – HCl + Natri Clorua cao 10.91 Vậy đệm dùng để tách tốt đệm Tris – HCl + Natri Clorua - Nghiên cứu yếu tố tối ƣu ảnh hƣởng tới hoạt tính chitinase chủng Trichoderma 095TH thu đƣợc kết nhƣ sau:  Nhiệt độ tối ƣu: 30oC  pH tối ƣu: 4.2 Kiến nghị - Tiến hành tủa enzym với tác nhân hóa học khác để tìm tác nhân hóa học tốt - Ứng dụng viếc đƣa enzymer chitinase tinh vào thực tiễn - Tùy theo mục đích sử dụng mà ta nghiên cứu tạo chế phẩm enzymer chitinase dạng dịch dạng bột có cao - Tiến hành khảo sát tìm enzymer chitinase có hoạt tính từ chủng vi sinh vật khác SVTH: Quách Kiều Chinh 76 Lớp 50K- Công nghệ Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyên Lân Dũng, Bùi Xuân Đồng, Lê Đình Lƣơng, 1982: Vi Nấm – NXB KH & KT, Hà Nội Lê Duy Thắng (2000) Phần ‘‘cấu trúc màng tế bào vi sinh” – Vi Sinh – Sinh học phân tử, Khoa Sinh học, ĐH KHTN TP.HCM Bertrand, K.G and Jack, J P 1998 Molecular biotechnology principles and application of recombinant DNA 2nd edition, ASM Press Washington, D.C Carsolio Carolina, Chet Ilan (1998), Role of the Trichoderma harzianum Endochitinase Gene, ech 42, in Mycoparasitism Applied and Environmental Microbiology, Mar 199, pp 929 – 935 Chet, I, G.E Harman, and R.Baker (1981), Trichoderma hamatum; Its hyphal interactions with Rhizoctonia solani & Pythium spp Microb Ecol 7, pp 28 – 29 Denis, C; Webster (1971), J Antagonistic properties of species – groups of Trichoderma production of volatile antibiotics, Trans Br Mycol Soc (84), pp 25 – 39 Dong Z.J, Dunstan.I.D (1997), Endochitinase and beta – 1,3 – glucanase gens are developmentally regulated during somatic embryogenesis in Picea glauca Planta 201, pp 94 – 189 Elad & Y, I.Chet, P.Boyle and Y.Hennis (1983), Parasitism of Trichoderma spp On Rhizoctonia solani & Sclerotium rolfsii scaning electron microscopy and fluorescence microscopy, Phytopathology 73: pp 85 – 88 Elad, Chet I, Henusls Y (1982) Degradation of plant pathogenic fungi by Trichoderma harzianum, J Can J Microbiol, 1982, 28: 719 – 725 10.Elad, Y I Chet and Y.Hennis (1983), Ultrastructural studies of the interaction between Trichoderma spp, and plant fungi SVTH: Quách Kiều Chinh 77 Lớp 50K- Công nghệ Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân 11.Esposito, E and Silva, M D 1998 Systematics and enviromental application of the genus Trichoderma, crical reviews in Microbiology 24 (2): 89 – 98 12.Fridlender, M.; Inbar, J.; Chet, I (1993) Biological control of soiborne plant pathogens by a b-1,3 glucanase producing Pseudomonas cepacia Soil Biol Biochem, 25, 1211-1221 13.Gray W.P (1997), Chitinase – maerial and method Patent WO97/47752 14.Geweky –El, R.M (1993), Biotechnology annual review Vol.2 15.Hamel.F, Boivin.R, Trembley.C, Bellemare.G 1997, Structural and evolutionary relationships among chitinase of flowering plants, J Mol Evol Vol 44, pp 614 – 624 16.Harman E.G, Kubicek P Christian (1998), Trichoderma & Gliocladium Vol pp 73 – 123 17.Harran.S, Oppenheim.A, Chet.I.(1998), Induction of the Trichoderma herzianum chitinolytic system is triggered by the chitin monomer, N – acetylglucosamine Mycological Research 102, pp 1224 – 1226 18.Hirano S, Inui H (1994), Biotechnology and Bioactive Polymers, Vol 2, pp 34 – 35 19.Hutchinson, S.A, and M.E Cowan (1972) Identification and biological effects of volatile metabolites from cultures of Trichoderma harzinum Trans.Br Mycol Soc 59; 71-77 20.Inbar J, Chet.I (1992), Biomimics of fungal cell-cell recognition by use of lectin coated nylon fibers, J bacterial 1992.Feb 174(3), pp 1055 – 1059 21.Jeuniaux.C, Braconnot.H (1971), Structure of chitin and chitosan Ann Chitin, paris, pp – 49 – 1811 22 Jeuniaux Charles (1963), Chitinase – Methods of Enzymology, Vol.4, pp 644- 650 23.Jolles P, Muzzaralli.A.R (1999), Chitin and chitinase Birkhauser verlag, Basel, Switzerland, pp 125 – 133 SVTH: Quách Kiều Chinh 78 Lớp 50K- Công nghệ Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân 24.Lin,A, T.M Lee, and J-C.Rern (1994) Tricholin, a new antifugal agent from Trichoderma viride, and its action in biological conrol of Rhizotonia solani, J Anitbiotics 47: 799 – 805 25.Patil R S, Ghormade.V (2000), Chitinolytic enzymes: an exploration Enzyme and Microbial Technology 26 (2000) pp 473 – 483 26.Roger.L (1998), Diagnosis of fungal infections with a chitinase, Patent W098/02742 27.Schirmbock,M,Lorito, and kubicek (1994), Parallel formation and synergism of hydrolytic enzyme & peptaibol antibiotics, molecular mechanism involved in the antagonistic action of Trichoderma harzianum against phytophathogenic fungi, Applied Enviromental Microbiology (60), pp – 16 28.Vorgias, C.E, Tew, I, Perrakis, A.Wilson, K.S and Oppenheim, B.A (1993) Purification and characterization of the recombinant chitin degrading enzymes chitinase and Chitobiase from Serratia marcescents In chitin Enzymology (Muzzarelli, R A.ed.) pp 417 – 422 29.http://www.Sigmaaldrich.com/ /chitinase chitin.gif 30.http://www.mrc lmb.cam.ac.uk/genomes/date/1ctn.html 31.http://www.reserach.cm.utexas.edu/ /chitin/structure.html 32.http://www.ocean.udel.edu/ /Research/chitin.html 33 http://www.nysaes.cornell.edu/ent/biocontrol/pathogens/Trichoderma.html 34.http://www.weizmann.ac.il/biological chemistry/scientist/Chet/Chet.html 35.http//www.doctorfungus.org/thefngi/Trichoderma Species.html 36.A.M Jackson, J M Whipps and J M Lynch (1991), Effects of temperature, pH and water potential on growth of four fungi with disease biocontrol potential, World Journal of Microbiology and Biotechnology volume (4), pp 494 – 501 SVTH: Quách Kiều Chinh 79 Lớp 50K- Công nghệ Thực Phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân 37.Atsushi Kobayashi, Hideyuki Kuwata, Michinari Kohri, Ryuko Izumi, Takeshi Watanabe, and Shin – ichiro Shoda, A bacterial chitinase acts as catalyst for synthesis of the N – linked oligosaccharide core trisaccharide by employing a sugar oxazoline substrate J Carbohydr Chem, 25(7), (2006), 533 – 541 38.A A Shubakov and P S Kucheryavykh (2004), Chitinolytic Activity of Filamentous Fungi Applied Biochemistry and Microbiology Vol 40 No 5, p.445-447 39.Daizo Koga (2005), Application of Chitinase in Agriculture Journal of Metals, Materials anh Minerals Vol 15 No 1, p.33-36 SVTH: Quách Kiều Chinh 80 Lớp 50K- Công nghệ Thực Phẩm ... Chitin chất enzyme chitinase 1.3 Thu nhận enzyme chitinase từ nấm sợi Trichoderma 1.3.1 Giới thiệu Nấm sợi Trichoderma 1.3.1.1 Phân loại đặc điểm hình thái Trichoderma. .. cho nghiên cứu sâu chitinase từ vi nấm Trichoderma Kết đề tài bổ sung cho nghiên cứu trƣớc vi nấm Trichoderma chitinase, đồng thời làm sở cho nghiên cứu thu nhận chitinase từ trichoderma Kết nghiên... H3PO4…).[45] [46] 1.3 Thu nhận enzyme chitinase từ nấm sợi Trichoderma 1.3.1 Giới thiệu Nấm sợi Trichoderma 1.3.1.1 Phân loại đặc điểm hình thái Trichoderma Phân loại Trichoderma vi nấm gây nhiều khó khăn