Một lượng lớn collagen tái tổ hợp đã được tinh chế từ nguyên liệu thực vật. Dữ liệu cho thấy cây trồng là một sự thay thế có giá trị cho việc sản xuất collagen tái tổ hợp cho các mục đích y khoa và khoa học khác nhau.
QUY TRÌNH SẢN XUẤT VÀ ỨNG DỤNG COLLAGEN TỪ THỰC VẬT Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH LỜI MỞ ĐẦU Collagen dạng protein cấu trúc sợi dài hầu hết chức khác với dạng protein phổ biến enzyme (cấu trúc collagen) Những bó collagen hay gọi sợi collagen thành phần thể màng tế bào cấu tạo nên hầu hết cá mơ cấu trúc bên ngồi tế bào, collagen tìm thấy tế bào collagen có cường độ kéo đứt lớn thành phần gân, sụn, xương, dây chằng, da Collagen tạo đàn hồi da thối hóa gây nếp nhăn tuổi già Trong q trình trích ly collagen có cơng đoạn thủy phân Quá trình tạo collagen thủ phân, gọi collagen hydrolysate Tùy theo mức độ thủy phân mà collagen có ứng dụng khác Collagen hydrolysate ứng dụng phổ biến công nghệ thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm công nghiệp nhiếp ảnh Chúng sử dụng chất đông, chất gây lắng thực phẩm Chúng dùng chất thay cao su, keo dán, xi măng, mực in nhân tạo, chất tạo kết dính diêm quẹt, lọc sáng đèn thủy ngân,… Hiện collagen coi loại dược liệu quý để kéo dài tuổi xuân cho người Việc nghiên cứu sản xuất collagen có nhiều ý nghĩa ngành sản xuất thực phẩm, dược phẩm mỹ phẩm, … Trong ngành thực phẩm: collagen ứng dụng để làm vỏ bao xúc xích, kẹo, ứng dụng dạng gelatin Trong y học: collagen ứng dụng việc chế tạo da nhân tạo để điều trị vết bỏng, ứng dụng phẫu thuật chỉnh hình, làm vỏ bọc thuốc, … Trong mỹ phẩm: collagen có vai trị chống nhăn, giữ cho da mềm sáng, collagen nguyên liệu để sản xuất sản phẩm như: mặt nạ, kem dưỡng da, dầu gội, … Nhận thấy nhu cầu lớn collagen Thế Giới Việt Nam năm gần đây, việc sử dụng thuốc hệ thống biểu SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH cho sản xuất collagen I tương đồng người trình bày báo cáo Các cấu trúc thiết kế từ cDNA mã hóa chuỗi proα1 (I) người để tạo thuốc biến đổi gen biểu collagen I Các chuỗi proα1 (I) tái tổ hợp biểu dạng trimers có liên kết disulfide cho gấp lại thành vòng xoắn ba kết hợp ổn định Hơn nữa, procollagen tái tổ hợp sau xử lý để collagen xảy động vật Một lượng lớn collagen tái tổ hợp tinh chế từ nguyên liệu thực vật Dữ liệu cho thấy trồng thay có giá trị cho việc sản xuất collagen tái tổ hợp cho mục đích y khoa khoa học khác SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH MỤC LỤC CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ COLLAGEN CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 18 2.2 Qui trình tách chiết collagen 20 2.4 Phương pháp phân tích kính hiển vi điện tử .21 2.5 Lưỡng sắc tròn 22 Tài Liệu Tham Khảo SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ COLLAGEN 1.1 Giới thiệu sơ lược Collagen Collagen loại protein cấu trúc yếu, chiếm khoảng 30% tổng lượng protein thể động vật có xương sống Collagen có nhiều gân, da, xương, hệ thống mạch máu động vật có mặt lớp màng liên kết bao quanh Khoảng 10% protein động vật có vú collagen; protein ngoại bào (hơn 90% gân, xương khoảng 50% da) có chứa collagen Nó có tác dụng giống chất keo liên kết tế bào lại với để hình thành mơ quan tảng thể Collagen cung cấp cho mơ liên kết đặc tính trội nhờ vào diện rộng khắp xếp mang tính cấu trúc Nó phân bố khắp nơi thể, từ chỗ gân nối bắp chân với gót chân giác mạc Trong gân dây chằng, collagen có tác dụng truyền lực từ sang xương tích trữ lượng đàn hồi Sự di chuyển nhịp nhàng, uyển chuyển thực thiếu tính chất Collagen cịn chất hữu có xương men giúp chúng chống lại rạn nứt Nó thành phần da, mạch máu, Collagen khơng có chức học, chẳng hạn giác mạc, trật tự cấu trúc sợi collagen tạo nên suốt Collagen xem vật liệu mang tính xây dựng Sự linh hoạt nhờ vào cấu trúc cấp bậc phức tạp, tạo nên đa dạng tính chất nhằm phục vụ chức định SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH 1.2 Cấu trúc collagen 1.2.1 Cấu trúc phân tử collagen Phân tử collagen (hay cịn gọi tropocollagen) protein hình trụ, dài khoảng 300 nm, đường kính khoảng 1,5 nm Hình 1.1 Cấu trúc phân tử collagen (triple helix) Nó bao gồm chuỗi polypeptide (gọi chuỗi α) cuộn lại với Mỗi chuỗi α cuộn thành đường xoắn ốc theo hướng từ phải sang trái với gốc vòng xoắn Ba chuỗi xoắn lại với theo hướng từ trái sang phải tạo thành đường ba xoắn ốc SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH Hình 1.2 Sự hình thành chuỗi xoắn ốc nội phân tử chuỗi polypeptide Mỗi chuỗi polypeptide có khối lượng phân tử khoảng 100 kDa, tạo nên tổng khối lượng phân tử collagen khoảng 300 kDa Chuỗi α cấu tạo khoảng 1000 amino acid Các chuỗi α khác (α1, α2 α3) thành phần amino acid Sự phân bố chuỗi α1, α2 α3 phân tử collagen khác tùy thuộc vào khác gene Collagen khơng có chứa tryptophan, giàu thành phần glycine, proline hydroxyproline, số protein có chứa hydroxylysine Nó chứa khoảng 33% glycine, 12% proline 11% hydroxyproline Các amino acid xếp chuỗi xoắn ốc theo dãy với phân bố sau: Bảng 1.1 Sự phân bố amino acid chuỗi polypeptide 1.2.2 Triplet Gly – X – X Tỉ lệ 0,44 Gly – X – I 0,2 Gly – I – X 0,27 Gly – I – I 0,09 Cấu trúc sợi collagen Phần lớn collagen mạng lưới ngoại bào tìm thấy dạng sợi, bao gồm sợi mảnh, nhỏ Thơng qua q trình tạo sợi, phân tử collagen tổ hợp với hình thành nên vi sợi (microfibril) bao gồm từ ÷ phân tử collagen SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH với số lượng nhiều tạo thành sợi (fibril) Những sợi có đường kính từ 10 ÷ 500 nm tùy thuộc vào loại mô giai đoạn phát triển Các sợi collagen thiết lập nên sợi lớn (fiber) cao bó sợi (fiber bundle) Hình 1.3 Cấu trúc sợi collage SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH Hình 1.4 Quá trình tổ hợp tạo sợi phân tử collagen Các chuỗi collagen xếp song song theo chiều dọc tạo thành sợi với tính chu kỳ định Chúng xếp so le khoảng 67 nm có khoảng trống khoảng 40 nm phân tử liền kề Nhờ vào cấu trúc có thứ bậc, độ bền vốn có chuỗi xoắn ốc chuyển sang sợi collagen, cung cấp cho mơ độ cứng, độ đàn hồi đặc tính học riêng biệt Hình 1.5 Hình ảnh bó sợi (a) sợi (b) collagen Sợi collagen tổ hợp có cấu trúc bán kết tinh phân tử collagen Các vi sợi kết hợp tạo nên sợi lớn Các sợi collagen xếp với cách thức kết hợp mức độ tập trung khác mô khác để cung cấp đặc tính khác mơ 1.3 Phân loại collagen Tính đến thời điểm tại, có 42 loại chuỗi polypeptide nhận dạng Chúng mã hóa 41 loại gene khác nhau, tạo thành 27 loại collagen Họ collagen phân loại thành phân họ khác dựa vào tổ hợp siêu phân tử Hiện tại, có khoảng 13 loại collagen trích chiết Chúng khác SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH chiều dài chuỗi xoắn ốc chất kích cỡ phần không xoắn ốc Bảng 1.2 Kết cấu chuỗi phân bố loại collagen thể người Loại collagen Kết cấu chuỗi Phân bố (α1(I))2α2(I), trimer Da, gân, xương, giác mạc, men răng, II (α1(I))3 (α1(II))3 III (α1(III))3 sụn, mạch máu Sụn, xương Mạch máu, van tim, hạ bì, ruột, nướu IV (α1(IV))2α2(IV) α1(V) α2(V) α3(V) V (α1(V))2α2(V) VI VII VIII IX X XI XII XIII (α1(V))3 α1(VI) α2(VI) α3(VI) (α1(VII))3 Chưa biết α1(IX) α2(IX) α3(IX) (α1(X))3 α1(XI) α2(XI) α3(XI) (α1(XII))3 Chưa biết I răng, thành tử cung Màng nhầy Giác mạc, xương, mạch máu, sụn, nướu Da, tim Da, phổi, sụn, giác mạc, Tạo từ tế bào màng Sụn Sụn Sụn, đĩa đệm cột sống, dịch thủy tinh Gân, dây chằng Da, xương Hơn 90% collagen thể collagen loại I, II, III IV Những bệnh tật liên quan đến collagen khuyết tật gene ảnh hưởng đến sinh tổng hợp, xếp trình khác sản sinh collagen cách bình thường SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH thủy phân, 3,3 g whey protein thủy phân Khối lượng sản phẩm cuối 113,4 g chứa g protein Ket quả, cà phê giữ lại màu tối khơng phát mùi lưu huỳnh hương vị khác lạ Tuy nhiên, hầu hết người thử cho sản phẩm có khác biệt mẫu đối chứng mẫu bổ sung protein Cà phê đối chứng có mùi cà phê hương vị mạnh Khi thêm lượng 0,5 g hương cà phê tự nhiên tất người thử đồng ý cà phê có bổ sung protein gần với hương vị mùi cà phê đối chứng Do đó, việc bổ sung lượng collagen thủy phân whey protein thủy phân số lượng nhỏ hương cà phê tự nhiên, cung cấp loại sản phẩm cà phê bổ sung protein, với giá trị dinh dưỡng protein nâng cao, mà giữ lại tất thuộc tính cà phê mong muốn người tiêu dung Tóm lại, phát minh này, loại th ức uống cà phê bổ sung protein bao gồm collagen thủy phân, whey protein thủy phân Ngoài ra, lượng nhỏ hương cà phê tự nhiên bổ sung để tăng mùi vị thức uống Loại sản phẩm bổ sung thêm khoảng 2%(w/w) collagen thủy phân, 3%(w/w) whey protein thủy phân, Vi %(w/w) hương cà phê tự nhiên Phương pháp bổ sung protein áp dụng cho sản phẩm trà 3.2 Ứng dụng collagen làm sản phẩm thửc uống có cồn Đồ uống có cồn khơng chưng cất từ nho, táo, lê, mạch nha, hoa bia, vật liệu lên men khác gây đục sau lên men Thành phần gây đục hạt nhỏ đường kính 1,0 |jm đến 0,001 |jm Chúng thường bã nho , nấm men, peptide, pectins, dextrans, tannin, nhựa hop, polyphenol loại tương tự Để có sản phẩm ngon miệng, suốt, cần thiết phải loại bỏ vật liệu gây đục trình gọi làm Theo quy định Hoa Kỳ nước khác, yêu cầu tác nhân làm rượu khơng làm thay đổi tính cách rượu vang, trường hợp đồ uống có cồn khơng chưng cất, nhiều nước yêu cầu không giữ lại tác nhân làm trong sản phâm cuối Thông thường, việc làm thực cách tạo phức tác nhân làm với tác nhân gây đục lọc bỏ phức chất tạo thành Các tác nhân làm tiêu biểu 26 SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH bentonit, carbon, gelatin, casein, polyvinylpyrrolidone thạch (từ bóng cá, chất collagen ) Phức chất sử dụng có nghĩa đề cập đến kết hợp hóa học kết hợp vật lý Trong q trình làm thông thường, tác nhân làm bổ sung đồ uống có cồn lên men ủ đạt độ theo yêu cầu Quá trình thực nhiều ngày trường hợp bia khoảng năm ngày Các phức hợp tác nhân làm tác nhân gây đục thường có kích thước hạt nhỏ, có xu hướng gây tắc nghẽn lọc yêu cầu thay phương tiện lọc thường xuyên Một tác nhân thường áp dụ ng tủa hầu hết tác nhân gây đục rượu bia thạch Tuy nhiên, thạch đ tiền Thạch dạng tương đối tinh khiết collagen, có nguồn gốc từ bong bóng cá lớn, ví dụ Beluga Sturgeon loài tương tự Theo sáng chế năm 1984 Cioca cộng sự, phương pháp làm sản phẩm đồ uống có cồn nghiên cứu Phương pháp bao gồm việc phối trộn hạt collagen tự nhiên với loại thức uống có cồn đem ủ Hỗn hợp ủ khoảng thời gian đủ để hạt collagen tạo phức chất với thành phần gây đục sản phẩm, sau phức chất tạo thành tách cách lọc phương pháp tương tự để sản xuất sản phẩm loại đồ uống có cồn đạt độ yêu cầu Sáng chế cung cấp tác nhân làm ln sẵn có hiệu cho sản phẩm đồ uống lên men có cồn Hơn theo phát minh này, phức chất tạo thành tác nhân làm vật gây đục cho sản phẩm dễ dàng loại bỏ cách lọc kích thước vật liệu lọc lớn; đồng thời phức chất khóa hịa tan trở lại sản phẩm nên việc tách loại dễ dàng Đó collagen Collagen tự nhiên đư ợc sử dụng muốn nói đến collagen tinh khiết trích chiết từ 1ớp chân bì da qua tách béo Các collagen sử dụng tốt từ động vật già để cung cấp số lượng đáng kể liên kết ngang cấu trúc dạng sợi Collagen tồn chuỗi xoắn ba với chu kỳ liên tục chuỗi ba Các chuồi xoắn ba collagen tự nhiên gọi sợi nhỏ sợi kết với chu kỳ trục khoảng 640Ẳ 27 SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH Collagen sử dụng dạng hạt, kích thước hạt cần nhỏ mm tốt nhỏ 0,5 mm Kích thước hạt collagen quan trọng, kích thước hạt nhỏ diện tích bề mặt tiếp xúc để tạo phức lớn Hàm lượng collagen với kích thước nhỏ 0,5mm thêm vào sản phẩm khoảng ppm Khơng có giới hạn hàm lượng tối đa collagen thêm vào đồ uống có cồn, nhiên, thường khơng q l00 ppm collagen sử dụng, khơng cần thiết làm cho trình lọc thêm phức tạp Mặc dù collagen tự nhiên thêm trực tiếp vào đồ uống có cồn lên men dạng bột mịn, cần phải phân tán collagen nước trước cho vào sản phẩm Hệ phân tán tạo thành chứa đến 5%(w/w) collagen Thơng thường, người ta sử dụng khoảng l%(w/w) collagen thấp Sau collagen bột thêm vào đồ uống có cồn, hỗn hợp đem ủ Người ta thấy rằng, trường hợp bia, sau khoảng bốn giờ, trình tạo phứ c hoàn tất phức chất lắng xuống đáy thiết bị Đây lợi trội so với vật liệu làm khác vật liệu mà thời gian tạo phức dài nhiều Collagen tạo phức với tác nhân gây đục hầu hết sản phẩm thức uống có cồn vịng 24 Tiếp theo q trình ủ, phức chất tạo thành vật liệu làm tác nhân gây đục tách cách lọc Theo phát minh này, phức chất tạo thành collagen dễ lọc, khơng có xu hướng làm tắc nghẽn màng lọc Do đó, vận tốc lọc nhanh hơn, thiết bị lọc hoạt động lâu thời gian thay đổi màng lọc kéo dài Kết từ phát minh cho thấy, collagen tự nhiên 1à loại vật liệu làm hiệu quả, có khả loại bỏ hoàn toàn tác nhân gây đục sản phẩm Nhờ đó, sản phẩm sản xuất đảm bảo độ theo yêu cầu Trong phát minh này, collagen tinh phân tán vào nước nồng độ 0,5% tính theo trọng lượng Một phần trăm (theo khối lượng dịch cần làm ) huyền phù collagen 0,5% cho vào bia lên men trộn Sau ủ, hầu hết collagen tạo phức với tác nhân gây đục bia lắng xuống đáy thiết bị Sau đó, hỗn họp lọc, loại bỏ phần rắn, ta thu phần bia đạt độ theo yêu cầu Các hạt, sợi collagen thường trích chiết t da động vật lớn tuổi để đạt m ức độ liên kết ngang cao, để có 28 SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH khả tạo phức nhanh lọc dễ dàng Collagen sản xuất theo số quy trình, miễn chúng đạt độ liên kết ngang theo yêu cầu tạch chất béo Mặc dù phát minh mô tả nguyên liệu cụ thể quy trình cụ thể, sáng chế giới hạn chừng mực đặt khẳng định kèm Các khẳng định bao gồm : Phương pháp làm đồ uống có cồn, bao gồm: ■ Phối trộn đáng collagen tự nhiên V ới thức uống có cồn để ủ, hàm lượng collagen sử dụng khoảng 10 ppm hay tốt 50ppm ; ■ Ủ hỗn hợp thời gian đủ collagen tạo phức chất với thành phần gây đục đồ uống; ■ Tách phức chất tạo thành để thu đồ uống có cồn đạt độ theo yêu cầu Collagen sử dụng có kích thước hạt nhỏ g hay tốt nhở 0,5 g Collagen sử dụng cần hòa th ành huyền phù nước trước cho vào dịch sản phẩm để làm Nồng độ huyền phù collagen lên đến %(w/w), thường nhỏ l%(w/w) Phức chất tạo thành tách khỏi sản phẩm phương pháp lọc Sản phẩm nghiên cứu phát minh bia Ngoài áp dụng cho rượu vang 3.3 Ứng dụng collagen chế biến sản phẩm từ sữa Trong sáng chế Ogasawara cộng năm 2008, sản phẩm thức uống sữa lên men (sữa chua - acidic milk - AM), đặc biệt sản phẩm AM bổ sung collagen peptide trọng lượng phân tử thấp (collagen thủy phân) để ổn định chất lượng cho AM quan tâm nghiên cứu Collagen nột thành phần protein chủ yếu hình thành mơ liên kết động vật Collagen thông thường sử dụng sản phẩm khác tới mục tiêu cung cấp cho da căng thẳng độ đàn hồi Gần hơn, thu hút ý nhiều nhà nghiên cứu, collagen nguyên liệu ngành thực phẩm 29 SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH phát nhiều hiệu ứng sinh lý thúc đẩy hấp thụ canxi xương, kích hoạt noron thần kinh, Nhiều loại đồ uống khác bổ sung collagen hặc sản phẩm thu nhận từ collagen như: gelatin, collagen peptide (sản phẩm thủy phân collagen mức độ cao ) kết hợp với mục tiêu tăng cuờng tính thương nại collagen, có sản phẩm sữa chua (AM) Sữa uống lên men thu nhận cách acid hóa sữa nhờ lên men với vi khuẩn lactic, vi khuẩn nhóm Bifidobacterium, nấm men; cách trực tiếp axit hóa sữa với tác nhân tạo tính acid tạo hương vị đặc trưng cho sữa Tuy nhiên, đồ uống lưu trữ thời gian dài , casein sữa thành phần đông tụ kết tủa, làm hỏng cẩu t rúc hương vị sản phẩm Protein sữa ổn định cách cho thêm chất ổn định pectin carboxymethylcellulose , propylene glycol alginate , polysaccharide đậu tương tan nước, Nhiều đồ uống sữa chua có chứa chất ổn định thương mại hóa Tuy nhiên, hợp chất collagen bổ sung vào thức uống sữa lên men (sau gọi chung acidic milk drink - AMD), ổn định cách cho thêm chất ổn định Kết là, ổn định lưu trữ không đủ lâu dài Mặc dù giảm độ ổn định cải thiện mức độ định cách thêm vào lượng lớn chất ổn định, việc bổ sung số lượng lớn chất ổn định làm cho hương vị sản phẩm khơng tốt Ngồi ra, thức uống trở nên nhớt khó uống Sự ổn định lưu trữ lâu dài cải thiện cách giảm lượng collagen thêm vào AMD Tuy nhiên, lượng collagen nhỏ cho AMD nên thực phương án Do đó, mong muốn phát triển sản ph ẩm AMD bổ sung collagen mà không làm suy yếu ổn định protein sữa đặt Các nhà phát minh sáng chế tiến hành nghiên cứu sâu rộng để giải vấn đề nêu Họ tìm thấy collagen peptide với trọng lượng phân tử nhỏ khoảng 1000 - 8700 sử dụng kết hợp với chất ổn định, collagen thêm vào AMD mà không làm suy yếu tác dụng chất ổn định, sản phẩm không tốt sự ổn định cấu trúc hương vị, mà cịn có khả hạn chế tính chất không mong 30 SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH muốn collagen gây Mục đích sáng chế cung cấp thức uống AMD ổn định chứa peptide collagen có phân tử lượng thấp sản xuất cách thủy phân collagen thành phân tử có phân tử 1ượng thấp (trung bình từ 1000 đến 8700) ổn định Đồng thời sáng chế cung cấp chất phụ gia có tác dụng làm bền AMD sử dung với chất ổn định khác Đó collgen peptide Có số báo cáo peptide collagen trọng lượng phân tó thấp collagen sản xuất cách thủy phân với kiềm enzyme Ví dụ, sáng chế ứng dụng Nhật Bản Laid -open so 111600/1977 cho biết thành phần mỹ phẩm chất cải thiện thực phẩm có chứa peptide collagen có trọng lượng phân tơ thấp; sáng chế ứng dụng Nhật Bản Laid -open so 12937/1977 cho biết phương pháp cải thiện thực phẩm thêm thêm nột peptide collagen có trọng lượng phân tử thấp (1000 -10 000) Tuy nhiên, vệc bổ sung peptide collagen vào thức uốn g, đặc biệt AMD chưa biết nhiều Phương pháp thủy phân enzyme phương pháp thích hợp để thủy phân collagen Thủy phân cách sử dụng axit kiềm tạo muối axit kiềm trung hoà, dẫn đến hương vị khơng tốt Ngồi ra, việc kiểm soát trọng lượng phân tử quan trọng cho ổn định AMD, thủy phân cách sử dụng loại enzyme thủy phân protein (protease) papain, bromelain, pepsine ưa chuộng Để đạt mục đích sáng chế này, peptide collagen đạt cách nên có trọng lượng phân tử trung bình khoảng 1000-8700, tốt 1000-5500, đặc biệt tốt 1000-3500 Nếu trọng lượng phân tử trung bình nhỏ 1000, hương vị đậm có nguồn gốc tị peptide collagen trọng lượng phân tơ thấp cảm nhận, trọng lượng phân tử cao 8700, việc cải thiện ổn định không đạt yêu cầu Các chất ổn định bổ sung vào AMD sáng chế hợp chất có khả ổn định protein có khả đông hay kết tủa vùng pH axit Pectin, carboxymethylcellulose (CMC), propylene glycol alginate, polysaccharides đậu tương tan nước, Xanthan gum, gellan gum 31 SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH Các loại chất ổn định sử dụng AMD cần lựa chọn phù hợp theo đặc tính sản phẩm Ví dụ, ổn định hương vị tốt thu cách sử dụng pectin cho sữa lên men có nồng độ chất khơ cao, pH khoảng 3,8-4,6 Việc sử dụng nhiều hợp chất lựa chọn (pectin, carboxymethylcellulose, propylene glycol alginate, polysaccharideậuđtương tan nước, ) chất ổn định với collagen peptide trọng lượng phân tô thấp đặc biệt ưa chuộng , hiệu ứng cao việc cải thiện giảm ổn định AMD Đặc biệt, pectin cải thiện hương vị AMD sử dụng với collagen peptide trọng lượng phân tử thấp tốt Mặc dù khơng có giới hạn cụ thể lượng peptide collagen thêm vào AMD sáng chế này, thường dùng khoảng 0,01-5,0% khối lượng sản phẩm cuối tốt 0,1 -2,0% Nếu 0,01%, tác dụng mặt sinh lý collagen không đáng kể Nếu nhiều 5,0%, hương vị phân tử peptide collagen tốt hơn, làm cho sản phẩm khơng thể có hương vị tốt Ở đây, sảm phẩm AMD thức uống với pH nhỏ điểm đẳng điện protein sữa (pH 4,4-5,2) bao gồm loại sữa lên men, sản phẩm lên men lactic từ sữa, kefirs, AMD sáng chế sản xuất theo phương pháp thông thường ngoại trừ việc bổ sung peptide collagen trọng lượng phân tử thấp chất ổn định bước trình sản xuất sản phẩm Ví dụ, sữa lên men sản xuất sau Vi khuẩn lactic acid nhóm vi khuẩn Bifidobacterium cấy lên men môi trường sữa tiệt trùng Sản phẩm sau lên men đồng hóa để thu nhận sữa lên men Tiếp theo, phần syrup chuẩn bị trước có chứa collagen peptide trọng lượng phân tử thấp chất ổn định thêm vào hỗn hợp đồng hóa b ang thiết bị đồng hóa, việc bổ sung hương vị để có sản phẩm cuối Ngoài ra, việc bổ sung collagen chat ổn định thực đồng thời riêng rẽ, bổ sung vào trước sau lên men Một điều cần phải làm rõ collagen can thiệp hiệu ổn định chất 32 SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH ổn định Điều liên quan đến điện tích dương collagen pH tương đương thấp điểm đẳng điện (pH 4,5-9,5) sựu tích điện âm chất ổn định sử dụng cho AMD Các tương tác điện chất ổn định collagen làm cho chúng kết hợp cản trở chất ổn định khỏi việc làm giảm độ ổn định protein sữa Việc sử dụng phân tô collagen peptide có trọng lượng phân tử trung bình nhỏ làm suy )ếu phản ứng với chất ổn định Điều cho làm giảm tác động peptide collagen đến việc ức chế khả ổn định chất ổn định Có thể thay đổi cách thích họp điều kiện thủy phân collagen để thay đổi điểm đẳng điện collagen Tuy nhiên, ảnh hưởng thay đổi điểm đẳng điện không hiệu giảm trọng lượng phân tơ Lấy thí nghiệm sáng chế minh họa Sản phẩm AMD chuẩn bị cách thêm collagen peptide pectin (một chất ổn định ) đánh giá ổn định hương vị sản phẩm theo thời gian bảo quản Sản phẩm AMD chuẩn bị sau : sữa bột tách kem phối trộn với nước (tỉ lệ sữa : nước 1:4 theo khối lượng) Sau tiệt trùng giâyở 120°c làm nguội, vi khuẩn lactic cấy lên men 24 giờ, sau ta thu sữa lên men Lấy sữa lên men thu đồng hóa 15Mpa Sản phẩm đồng hóa trộn với syrup để có sản phẩm cuối (tỉ lệ sữa lên men : syrup 2:3 theo khối lượng) Syrup sử dụng chuẩn bị cách trộn hòa tan maltitol (5% sản phẩm cuối cùng), peptide collagen (0,3%), pectin (0,3%), aspartame (0,01%), tiệt trùng giây 120°c Đánh giá tính ổn định bảo quản: Sản phẩm AMD chuẩn bị theo phương pháp cho phép bảo quản 21 ngày 10 °c Xác định tính chất sản phẩm vào ngày 14 ngày 21 Kết thể bảng bên 33 SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH Bảng 3.1 - Kết đánh giá tính tính ổn định bảo quản sản phẩm thí nghiệm Mầu Trọng lượng phân pH tử collagen 14 Độ 21 (mPa.s) 14 21 nhớt Sự kết tủa* 14 peptide c Không bô sung ngày 4,46 ngày 4,46 ngày 26 25 TI 762 4,46 4,46 27 27 T2 1210 4,46 4,46 29 30 T3 1838 4,46 4,46 31 31 T4 2500 4,46 4,46 27 27 T5 3608 4,46 4,46 25 24 T6 5418 4,46 4,46 21 22 T7 5589 4,46 4,46 23 21 T8 6913 4,46 4,46 27 26 T9 8754 4,46 4,46 24 21 T10 9523 4,46 4,46 21 20 *Sự kết tủa đánh giá theo tiêu chuẩn sau Điểm Mô tả Khơng có kết tủa Kết tủa Ket tủa Ket tủa nhiều Tách whey 21 (mm) 14 21 ngày 0 0 1 2 2 ngày 2 2 2 2 ngày 2 2 4 Các kết cho thấy lượng kết tủa tách whey nhỏ khơng có vấn đề thực tiễn collagen peptide có trọng lượng phân tử nhỏ 8700, đặc biệt 5500 nhỏ hơn, sử dụng Đặc biệt, peptide collagen với trọng lượng phân tử 3500 nhỏ bổ sung, sản phẩm ổn định mẫu không chứa peptide collagen Đánh giá Hương vị: Các thức uống sữa chua (mẫu c, T1-T10) đánh giá cảm quan Các kết thể bảng bên 34 SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH Bảng 3.2 - Kết đánh giá hương yị sản phẩm thí nghiệm Mẩu Điểm số* c TI T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 3 3 2 2 *Điểm Mô tả Hương vị xấu Hương vị xấu Hương vị công Hương vị tốt Kết hương vị cấu trúc tốt collagen peptide có trọng lượng phân tử trung bình l000 đến 8700 sử dụng Collagen peptide có trọng lượng phân tử trung bình 1000 đến 5500 dùng thức uống, đặc biệt sản xuất AMD cho hương vị cảm quan tốt Các sản phẩm AMD sáng chế chuẩn bị phương pháp mô tả đạt ổn định có tính chất cảm quan tốt hỗ trợ bang collagen, nhờ collagen giúp ổn định protein sữa không ức chế khả khả làm bền chất ổn định Việc bổ sung thêm collagen peptide cho AMD khơng có tác động sinh lý tốt 35 SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH cung cấp cho da căng thẳng độ đàn hồi cao , thúc đẩy hấp thụ canxi xương, kích hcạt thần kinh, mà cịn làm giảm hương vị không mong muốn chai làm bền cấu trúc sữa khác gây nên sản phẩm , giúp sản phẩm đạt giá trị cảm quan tốt Tóm lại, sáng chế này, sản phẩm AMD bao gồm: sữa lên men, collagen peptide có trọng lượng phân tử trung bình 1000-8700 (có thể sản xuất cách thủy phân collagen), chất ổn định chọn từ nhóm gồm pectin, carboxymethylcellulose, propylene glycol alginate, polysaccharides ậấ tương tan nước Trong đó, sữa lên men vi khuẩn lactic (.Bifidobacterium, ), nấm men, bổ sung tác nhân làm acid hóa sữa Hàm lượng peptide co llagen bổ sung khoảng 0,1-2,0% khối lượng sản phẩm c hất ổn định bổ sung 0,1 -1,0% khối lượng sản phẩm Trong sáng chế khác Kano cộng năm 2008, nhà nghiên cứu cung cấp thành phần với sữa lên men có nguồn gốc từ sản phẩm tự nhiên , an tồn, có tác dụng sinh lý tốt /hoặc điều trị hiệu cho da Theo sáng chế cho biết, sử dụng Streptococcus thermophilus ƠLS3059 cải thi ện và/hoặc điều trị da Một thành phần để cải thiện và/ điều trị da bao gồm Streptococcus thermophilus ƠLS3059 và/hoặc canh trường lên men chúng; thực phẩm đồ uống chứa thành phần này; sữa lên men để cải thiện và/hoặc điều trị da chuẩn bị cách sử dụng Lactobacillus buỉgaricus delbrueckii Streptococcus thermophilus OLS3059; sữa lên men để cải thiện điều trị da chứa peptide collagen 36 SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH TÀI LIỆU THAM KHẢO B R Rao D Schalk, R Gielissen and R L Henrickson (1981) Bovine Hide Collagen as a Protein Extender in Bolognan, Oklahoma Agricultural Experiment Station, Vol., 254-262 Bae Inwoo, Kiyoshi Osatomi, Asami Yoshida, Kazufumi Osako, Atsuko Yamaguchi, and Kenji Hara (2008) Biochemical properties of acid-soluble collagens extracted from the skins of underutilised fishes, Food Chemistry, Vol 108, 49-54 Bolboacă Sorana D., and Jantschi L (2007) AMINO ACIDS SEQUENCE ANALYSIS ON COLLAGEN, Bulletin USAMV-CN, Vol 63-64, 311-316 Cioca Gheorghe (Belleville, NJ) (1984), Method of fining alcoholic beverages, (4489100) Connolly Philip (Lake Arrowhead, CA, US), Ernster, James (Lakewood, CA, US) (2010), Protein supplemented coffee beverage, (20100021616) Cornelissen, B.J., Hooft van Huijsduijnen, R.A and Bol, J.F (l986) Nature 32l, 53l–532 Crevasse Gary A (Rochester Hills, MI), Gammon, David L (Rochester, MI), Sullivan, Michael J (Rochester Hills, MI) (1988), Method and apparatus for forming netted meat products wrapped in an edible collagen film, (4716713) Dierryck, W., Pagnier, J., Poyart, C., Marden, M.C., Gruber, V., Bournat, P., Baudino, S and Merot, B (l997) Nature 386, 29– 30 Eastoe J E The amino acid composition of fish collagen and gelatin, Biochemcal Journal, Vol 65, (2), 363-368 10 Elefteriou, F., Exposito, J.-Y., Garrone, R and Lethias, C (l997) J Biol Chem 272, 22866–22874 11 F Ruggiero (2000) Triple helix assembly and processing of human collagen produced in transgenic tobacco plants, 132-136 12 Friess Wolfgang (1998) Collagen - biomaterial for drug delivery, European 37 SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, Vol 45 113-136 13 G.A PRABHU D.R DOERSCIIER, AND D.H HULL (2004) Utilization of Pork Collagen Protein in Emulsified and Whole Muscle Meat Products, Journal of Food Science, Vol 69, (5), C388-C392 14 G.c ARGANOSA R.L HENRICKSON and B.R RAO (1986) COLLAGEN AS A LEAN OR FAT REPLACEMENT IN PORK SAUSAGE, Journal of Food Quality, Vol 10, 319-333 15 Hiatt, A., CaRerkey, R and Bowdish, k (l989) Nature 342, 76– 78 16 Horsch, R.B., Fry, J.E., Hofmann, N.L., Eicholtz, D., Rogers, S.G and Fraley, R.T (l985) Science 227, l229–l23l 17 Institute of medicine (U.S.), (Ed.) (2004) Food chemical index, 5th ed., National Academies Press, Washington, 352-353 18 J c LEWIS N S SNELL, D J HIRSCHMANN, AND HEINZ FRAENKEL- CONRAT (1950) AMINO ACID COMPOSITION OF EGG PROTEINS, Journal of Biological Chemistry, Vol 186, (1), 23-25 19 John, D.C.A., Watson, R., kind, A.J., Scott, A.R., kadler, k.E and Bulleid, N.J (l999) Nat Biotechnol l7, 385–389 20 KANO HIROSHI (Japan); ITO HIROYUKI(Japan); NOMA TERUYUKI (Japan); IKEGAMI SHUJI (Japan); ISAWA KAKUHEI (Japan) (2009), Fermented milk for improving and/or treating skin and method for producing the same, (EP2095820 (Al)) 21 Katarzyna Waszkowiak Wiodzimierz Dolata (2008) THE APPLICATION OF CONNECTIVE TISSUE PROTEINS AS ANTIOXIDANT CARRIERS IN FOOD PRODUCTION, Electronic Journal of Environmental Agricultural Food Chemistry, Vol 7,(8), 3331-3334 22 Katarzyna Waszkowiak Wlodzimierz Dolata (2007) The application of collagen preparations as carriers of rosemary extract in the production of processed meat, Meat Science, Vol 75, 178-183 23 Kurth L.B (1983) The scope for products from collagen, The Australian Meat 38 SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH Industry Research Conference, Vol., (3B), 1-3 24 Moeller Patrick w (Brentwood, TN) (2003), Method for covering a food product with collagen, (6541053) 25 Nagai T., Araki, Y., & Suzuki, N (2002) Collagen of skin of ocellate puffer fish (Takifugu rubripes), Food Chemistry, Vol 78, 173-177 26 Nagai T., Suzuki, N (2000) Isolation of collagen from fish waste material-skin, bone and fins, Food Chemistry, Vol 68, 277-281 27 Nhan Hong Thi Le Anh Thy Bui (2009) Isolation of collagen from the skin of basa fish (Pangasius Bocourti), Journal of Science and Technology, Vol 47, (5 A), 32139 28 Ogasawara Nobuhiro (Tokyo, JP), Akahoshi, Ryoichi (Tokyo, JP), Hashimoto, Shinji (Tokyo, JP), Yamashita, Eiichi (Yao, JP), Yamamoto, Keiichi (Yao, JP) (2008), Stable acidic milk drinks, process for producing the same, and additive for acidic milk drinks to be used therein, (7396552) 29 Parenteau-Bareil Rộmi, Robert Gauvin, and Franỗois Berthod (2010) Collagen- Based Biomaterials for Tissue Engineering Applications, Materials, Vol 3, 1863-1887 30 Pati Falguni, Basudam Adhikari, and Santanu Dhara (2010) Isolation and characterization of fish scale collagen of higher thermal stability, Bioresource Technology, Vol 101, 3737-3742 31 Potaros Treesin, Nongnuch Raksakulthai, Jiraporn Runglerdkreangkrai, and Wanchai Worawattanamateekul (2009) Characteristics of Collagen from Nile Tilapia (Oreochromis niloticus) Skin Isolated by Two Different Methods, Kasetsart J (Nat ScL), Vol 43, 584-593 32 Prabjeet Singh a Soottawat Benjakul a, *, Sajid Maqsood a, Hideki Kishimura (2011) Isolation and characterisation of collagen extracted from the skin of striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus), Food Chemistry, Vol 124, 97-105 33 Phanat Kittiphattanabawon a Soottawat Benjakul a, *, Wonnop Visessanguan b„ and Munehiko Tanaka Takashi Nagai c (2005) Characterisation of acid-soluble collagen from skin and bone of bigeye snapper (Priacanthus tayenus), Food Chemistry, 39 SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH Vol 89, 363-372 34 Raines Matthew D Shoulders and Ronald T (2009) Collagen Structure and Stability, Annual Review of Biochemistry, Vol 78, 929-958 35 Salem Samir A.; El-Agamy, Elsayed I.; Salama, Fatma A.; Abo-Soliman, Nagwa H Isolation, Molecular And Biochemical Characterization Of Goat Milk Casein And Its Fractions, Tropical and Subtropical Agroecosystems, Vol 11, (1), 29-35 36 Salmon, V., Legrand, D., Slomianny, M.-C., El Yazidi, I., Spik, G., Gruber, V., Bournat, P., Olagnier, O., Mison, D., Theisen, M and Me´rot, B (l998) Protein Expr Purif l3, l27–l35 37 Stribling Kenneth V (St Charles, IL) (1997), Collagen sausage casing containing encapsulated smoke and method of making, (5599570) 38 Takada Yukihiro (62-22, Kozutsumi, Kawagoe-shi, Saitama, JP), Aoe, Seiichiro (8-9- 406, Shinsayama 2-chome, Sayama-shi, Saitama, JP), Kato, Ken (2-155-205, Ohnari- cho, Ohmiya-shi, Saitama, JP), Toba, Yasuhiro (5-11-3, Arajuko-cho, Kawagoeshi, Saitama, JP), Yamamura, Junichi (29-8-205, Renjaku-cho, Kawagoe-shi, Saitama, JP) (2004), Preparations comprising collagen, vitamin D3 and calcium for strengthening bone, (EP0798001) 39 Villanueva P, A., McNulty, A, K., Beniker, H, D., Kieswetter, K Method for quantitation of collagen tissues, Patent application publication No US 2009/0142799 Al 40 Vuorela, A., Myllyharju, J., Nissi, R., Pihlajaniemi, T and ki- virikko, k.I (l997) EMBO J l6, 6702–67l2 41 Wang Lin, Yufeng Zou, Song Jiang, Junmin Xu, Shenhua Jiang, and Qiuhui Hu Chromatographic separation and physicochemical properties of collagen species in the skin of deep-sea redfish (Sebastes mentella), Food Hydrocolloids, Vol 30, 1-5 42 Winkler Bruno (Weinheim-Oberflockenbach, DE) (1992), Collagen wrapted meat products, (5147671) 43 Zhongkai Zhang Guoying Li And Bi Shi (2006) Physicochemical Properties Of Collagen, Gelatin And Collagen Hydrolysate Derived From Bovine Limed Split Wastes, Journal of the Society of Leather Technologists and Chemists, Vol 90, (1), 23-28 40 ... phẩm collagen ứng dụng cụ thể như: sản xuất sợi collagen làm thực phẩm, sản xuất collagen vi tinh thể, ứng dụng collagen giống gelatin Collagen ứng dụng rộng rãi dạng gelatin: + Thực phẩm ( Gottoffer,... cứu sản xuất collagen có nhiều ý nghĩa ngành sản xuất thực phẩm, dược phẩm mỹ phẩm, … Trong ngành thực phẩm: collagen ứng dụng để làm vỏ bao xúc xích, kẹo, ứng dụng dạng gelatin Trong y học: collagen. .. nữa, procollagen tái tổ hợp sau xử lý để collagen xảy động vật Một lượng lớn collagen tái tổ hợp tinh chế từ nguyên liệu thực vật Dữ liệu cho thấy trồng thay có giá trị cho việc sản xuất collagen