QUY TRÌNH SẢN XUẤT LACTOBACILLUS CASEI SHIROTA

Mỗi chai Yakult có chứa hơn 6.5 tỉ khuẩn L.casei Shirota. Không giống như hầu hết những chủng khuẩn bình thường khác trong yogurt, mà khuẩn L.casei Shirota có khả năng sống sót trong dịch vị dạ dày và dịch vị mật, tiến đến ruột vẫn sống, hỗ trợ phục hồi sự cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột. Khi tiêu thụ Yakult hàng ngày, khuẩn L.casei Shirota hỗ trợ cải thiện tiêu hóa, điều hòa hệ miễn dịch và ngăn ngừa các bệnh truyền nhiễm.

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN I.1 Giới thiệu Yakult Yakult sữa uống lên men từ sữa bột gầy, đường, nước chủng khuẩn probiotic Lactobacillus casei Shirota Mỗi chai Yakult có chứa 6.5 tỉ khuẩn L.casei Shirota Khơng giống hầu hết chủng khuẩn bình thường khác yogurt, mà khuẩn L.casei Shirota có khả sống sót dịch vị dày dịch vị mật, tiến đến ruột sống, hỗ trợ phục hồi cân hệ vi sinh vật đường ruột Khi tiêu thụ Yakult hàng ngày, khuẩn L.casei Shirota hỗ trợ cải thiện tiêu hóa, điều hịa hệ miễn dịch ngăn ngừa bệnh truyền nhiễm Hình 1.1 Sản phẩm đặc trưng sữa chua uống Yakult Trong sản phẩm Yakult, chứa chủng khuẩn Lactobacillus casei Shirota, chủng probiotic chứng minh cách khoa học kháng dịch vị tiêu hóa, tiến đến ruột sống chứng minh có tác động có lợi cho sức khỏe I.2 Đặc điểm chủng Lactobacillus casei Shirota Đây chủng vi khuẩn lactic thuộc lồi thơng thường, khác với chủng khác chỗ chúng đề kháng mạnh mẽ với dịch dày (độ acid cao) dịch mật enzyme tiêu hóa khác, đến ruột non phát triển ruột non Chính lợi khuẩn mạnh L casei Shirota khơng có gene kháng kháng sinh hay chuyển gene kháng kháng sinh cho vi sinh vật địa người sử dụng, đặc biệt kháng sinh dùng phổ biến Vancomycin (Khuẩn probiotic phải khơng có gene kháng kháng sinh hay chuyển gene kháng kháng sinh cho vi sinh vật địa khơng, làm rối loạn ảnh hưởng đến trình điều trị bệnh sau này) Khả bám dính khuẩn L casei Shirota vào bề mặt tế bào thành ruột không cao (khuẩn probiotic phải có khả bám dính vào bề mặt tế bào ruột để kích thích hệ miễn dịch chống lại vi sinh vật gây bệnh địa định cư ruột Khuẩn L casei Shirota khơng có khả phân giải niêm mạc dày (gastric mucin) (khuẩn probiotic phải khơng có khả phân giải lớp niêm mạc dày Lớp niêm mạc có vai trị bảo vệ dày khơng bị tác động chính dịch vị acid dày Nếu lớp niêm mạc bị phá vở, dày bị chính dịch vị acid dày tiết phá hủy gây loét, tạo điều kiện cho vi sinh vật địa gây bệnh gây nhiễm trùng đến quan khác) I.3.Đặc điểm sinh lý, sinh hóa Lactobacillus casei: Lên men lactic đồng hình, trực khuẩn nhỏ, Gram (+), thường gặp dạng chuỗi dài ngắn, tích tụ tới 1,5% acid Chúng khơng có khả chuyển động Có khả lên men loại đường glucose, fructose, mannose, galactose, maltose, lactose, salicin Trong trình lên men chúng tạo D-acid lactic Nhiệt độ tối thích cho phát triển 38-40oC, nhờ có hoạt tính protease nên phân hủy protein sữa thành acid amin I.3.1 Khả chịu điều kiện dịch dày nhân tạo Nguyên tắc: Các mẫu cho vào môi trường dày nhân tạo SGJ Theo nghiên cứu Zhou cộng (2009) cho giá trị pH pH xem giới hạn định sàng lọc chủng vi sinh vật có khả sống sót Thời gian xử lý mô theo thời gian lưu thức ăn dày từ đến Tiến hành: Chuẩn bị môi trường MRS dày nhân tạo pH cho vào ống nghiệm đem trùng nhiệt độ 90ºC phút Bổ sung dịch sản phẩm Asau lên men với tỷ lệ cấy giống 10% Tiến hành xác định mật độ vi sinh vật phương pháp cấy trải đĩa petri sau khoảng thời gian: 0; 60; 120 phút I.3.2 Khả chịu muối mật Nguyên tắc: Sản phẩm đạt tiêu chuẩn probiotic phải có vi sinh vật có khả sống phát triển mơi trường có bổ sung muối mật (một thành phần tiết q trình tiêu hóa thức ăn) Chính nhờ khả mà vi khuẩn tồn phát triển thể Tiến hành: Chuẩn bị môi trường MRS bổ sung muối mật để đạt nồng độ cuối 0,3% Cho vào ống nghiệm vô trùng 10 ml môi trường bổ sung ml dịch mẫu Tiến hành xác định mật độ vi sinh vật phương pháp cấy trải đĩa sau khoảng thời gian: 0; 2; I.3.3 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn Khảo sát khả kháng khuẩn vi sinh vật thử nghiệm số vi khuẩn gây hại B subtilis, Salmonella sp theo phương pháp Aslim cộng (2005) Nguyên tắc: Thực theo nguyên tắc khuếch tán đĩa thạch, nguyên tác dựa khả nắng kháng vi sinh vật thị hai sản phẩm Tiến hành: Dịch sữa hai sản phẩm sau lên men tiến hành đem ly tâm 4000 rpm, 10 phút để thu dịch bên Các chủng Salmonella sp B subtilis nuôi cấy 12 cấy trải đĩa môi trường NA (25ml/đĩa) với thể tích 20 µL Sau đó, sử dụng ống thép vô trùng đục lỗ đường kính mm đĩa thạch Dịch mẫu cho vào lỗ thạch với thể tích 35 µL Đọc kết đĩa thạch sau 12 ủ 37°C Khả kháng khuẩn hai sản phẩm xác định dựa vào đường kính vịng vơ khuẩn xuất xung quanh lỗ thạch I.4 Lợi ích sữa Yakult 1.4.1 Giúp điều hòa nhu động ruột, ngăn ngừa tiêu chảy táo bón Trong sống nay, dễ bị tác động nhân tố stress, dùng kháng sinh, lão hóa, nhiễm khuẩn hay hóa chất từ thực phẩm, chế độ ăn nhiều béo đạm ít chất xơ,… gây rối loạn tiêu hóa, ảnh hưởng đến sức khỏe chất lượng sống chúng ta, mà phổ biến gây bệnh đường tiêu hóa tiêu chảy, táo bón, hội chứng ruột kích thích, hội chứng ruột ngắn, viêm dày, chí ung thư ruột… Hiện nay, liệu pháp probiotic dùng phòng điều trị bệnh đường tiêu hóa để tăng cường sức khỏe ngày ứng dụng rộng rãi Chúng dùng dạng thực phẩm sữa lên men, thức uống thuốc Và nói probiotics xem liệu pháp thay hiệu cho liệu pháp dùng kháng sinh điều trị bệnh Trong điều kiện in vitro, chủng khuẩn L.casei Shirota chứng minh kháng dịch vị acid dày dịch vị mật nhân tạo Và thử nghiệm lâm sàng người, kết cho thấy khả kháng dịch vị tiêu hóa chủng L.casei Shirota, sống sót qua hệ tiêu hóa tiết qua phân [M Shirota et al 1966 Touhy et al 2007] Sau vượt qua hàng rào dịch vị tiêu hóa, chủng khuẩn L.casei Shirota tiến đến ruột có tác động hỗ trợ hệ tiêu hóa tăng cường hệ miễn dịch Chúng có tương tác với thành phần hệ vi sinh vật đường ruột, giúp điều hòa trì hệ vi sinh vật đường ruột mức cân bằng cách làm tăng vi khuẩn có lợi thuộc chi Lactobacilli, Bifidobacteria đồng thời ức chế phát triển vi khuẩn gây hại E.coli, Clostridium, Staphylococus,…[Tanaka et al 1994, M Shirota et al 1966], tạo sản phẩm trao đổi chất giúp điều tiết chức ruột Từ giúp cải thiện tình trạng tiêu chảy, táo bón hay bệnh lý khác đường tiêu hóa viêm dày, hội chứng ruột ngắn, hội chứng ruột kích thích, Trong bệnh đường tiêu hóa, tiêu chảy bệnh lý thường gặp phổ biến Nguyên nhân phổ biến nhiễm khuẩn gây hại E.coli, Vibrio, Shigella,… từ thực phẩm không vệ sinh, chúng làm cân hệ vi sinh vật đường ruột, tạo điều kiện cho vi sinh gây hại phát triển tạo độc tố gây tiêu chảy Mục tiêu hàng đầu điều trị bệnh tiêu chảy cân hệ vi sinh vật đường ruột vi khuẩn có lợi probiotics Chủng khuẩn probiotic L.casei Shirota ghi nhận có hiệu điều trị bệnh tiêu chảy Trong điều kiện in vitro, L.casei Shirota cho thấy có hiệu ức chế đáng kể phát triển vi khuẩn gây tiêu chảy E.coli (ETEC-enterotoxigenic E.coli), Salmonella enteritidis, Shigella dysenteriae Vibrio cholerae [Godiosa O et al 1993] ) 1.4.2 Giúp trì cân lượng khuẩn có lợi vi khuẩn gây hại có đường ruột Hệ tiêu hóa chứa hàng trăm tỉ khuẩn, bao gồm khuẩn có lợi khuẩn gây hại Chúng ta dễ bị tác động nhân tố gây rối loạn hệ đường ruột dùng kháng sinh, chế độ ăn khơng cân bằng, lão hóa, stress, nhiễm khuẩn,…Chính nhân tố tạo điều kiện cho vi sinh vật gây hại phát triển chiếm ưu ruột, gây ảnh hưởng đến sức khỏe Yakult có khả trì cân hệ vi sinh vật đường ruột hỗ trợ ngăn ngừa bệnh truyền nhiễm ung thư Yakult probiotic, có chứa 6.5 tỉ khuẩn có lợi Lactobacillus casei Shirota Chủng khuẩn L.casei Shirota kháng dịch vị tiêu hóa, tiến đến ruột phát triển ruột, hỗ trợ cho sức khỏe cách: Làm tăng vi khuẩn có lợi làm giảm vi khuẩn gây hại, giúp cân hệ vi sinh vật đường ruột 1.4.3 Giúp giảm độc tố ruột Ngồi L.casei Shirota cịn giúp đào thải độc tố ruột giúp ngăn ngừa phòng chống ung thư ruột [Miyazaki K and Takeshi Matsuzaki 2009 Ishikawa et al 2005] Các độc tố gây hại p-cresol, indican, phenol, ammonia,…từ thực phẩm hay vi sinh vật gây hại tạo ra, không đào thải ảnh hưởng đến sức khỏe, chí tích lũy lâu ngày gây rối loạn chức gan, thận, dẫn đến ung thư 1.4.4 Giúp tăng cường hệ miễn dịch, phòng chống bệnh truyền nhiễm ngăn ngừa ung thư Tế bào NK (Natural Killer Cell) phát vào khoảng năm 1970 từ quần thể tế bào limpho, cơng nhiều năm sau công nhận Trong thể có loại tế bào limpho, là: tế bào B (chuyên sinh kháng thể, hình thành từ lách); tế bào T (điều khiển tế bào miễn dịch, sinh trưởng) tế bào NK (tế bào miễn dịch tự nhiên, sinh trưởng tủy sống) loại tế bào limpho có loại người biết rõ chiếm gần 90% tổng số tế bào limpho Tỷ lệ tế bào NK không lớn chiếm 10%- 15% loại vũ khí sắc bén tế bào tự nhiên nhằm loại bỏ “phần tử phiến loạn” tế bào NK hoạt động mạnh mắc khối u giảm, điều đông đảo giới khoa học kiểm chứng Nhiều nơi giới triển khai điều trị khối u “Liệu pháp tế bào NK” Phương pháp rút máu từ thể bệnh nhân tiến hành biện pháp kích thích tế bào NK máu sau bơm trở lại thể “Liệu pháp tế bào NK” ngăn chặn phát triển khối u cách hữu hiệu, chứng minh tăng cường tế bào NK hồn tồn điều trị khối u Có nghiên cứu liên quan chứng minh tế bào NK ngã xuống tiêu diệt 27 tế bào ung thư Năm 1990, phát chế nhận biết tế bào ung thư tế bào NK thông qua việc phát tế bào khơng có phân tử MHC Vì lý giải tế bào NK lại gọi sát thủ tự nhiên Khi phát phân tử MHC thấp tiến hành biện pháp để tiêu diệt tế bào ung thư đợi đến tiếp xúc với tế bào ung thư phát giác chúng Nhiều nghiên cứu tần suất mắc khối u có mối quan hệ tỷ lệ nghịch với số lượng tế bào NK Do nâng cao số lượng tế bào NK thể phịng bệnh ung thư Hoạt tính tế bào NK có thay đổi sử dụng Yakult, hoạt tính tăng dần sử dụng ngừng sử dụng hệ miễn dịch giảm lại ban đầu, tiếp tục bổ sung lợi khuẩn để trì sức khỏe hệ miễn dịch Acrylamide độc tố tạo q trình chế biến thực phẩm nhiệt độ cao (chẳng hạn khoai tây chiên, bánh phồng tôm,…) Theo chuyên gia nghiên cứu ghi nhận việc hấp thụ độc tố Acrylamid qua chế độ ăn uống hàng ngày gia tăng nguy bị ung thư gây hại cho hệ thần kinh Đối với nam giới, tiêu thụ thời gian dài ảnh hưởng đến tuyến sinh sản Tại Việt Nam, Viện Vệ sinh Y tế Công cộng công bố “nếu chiên khoai tây nhiệt độ cao thời gian dài sinh độc tố acrylamide, có nguy gây ung thư” sau phân tích mẫu khoai tây chiên bán cửa hàng thức ăn nhanh cửa hàng bán lẻ địa bàn Tp.HCM Vì thật cần thiết phải có biện pháp mà góp phần làm giảm đào thải độc tố arcylamid từ thực phẩm mà ăn vào Một nghiên cứu gần GS Serrano Nino vừa đăng tạp chí Journal of Food Safety hồi đầu tháng hiệu 14 lợi khuẩn axit lactic có khả giúp đào thải độc tố arcylamide điều kiện in vitro, khuẩn Lactobacillus casei Shirota sữa Yakult có hiệu cao Cho đến chưa có biện pháp hồn tồn loại bỏ acrylamide khỏi thực phẩm Trong thời gian chờ đợi nhà khoa học tìm liệu pháp hữu hiệu việc sử dụng thực phẩm chứa lợi khuẩn acid lactic hàng ngày, chẳng hạn sữa uống lên men Yakult, cần thiết hữu ích, khơng giúp trì đường ruột khỏe mạnh mà cịn góp phần giúp đào thải bớt độc tố acrylamide, giảm nguy gây ung thư gây từ thực phẩm mà ăn vào CHƯƠNG II: VI SINH VẬT TRONG LÊN MEN SỮA CHUA 2.1 Lịch sử hình thành chủng Tên "lactobacillus" đề cập đến khả vi khuẩn lên men đường để tạo axid lactic Tên "casei" tiếng Latin mát, liên quan đến việc sử dụng vi khuẩn trình làm mát Tiến sĩ Nhật Bản Minoru Shirota (1899-1982) có phát minh quan trọng vào năm 1930, ông làm việc Phòng thí nghiệm Vi sinh vật học Trường Đại học Hoàng gia Y khoa Kyoto (nay Đại học Kyoto) Đó việc phân lập ni cấy chủng vi khuẩn thuộc lồi Lactobacillus casei sau mang tên chủng Lactobacillus casei Shirota theo tên tiến sĩ Chủng khoảng 300 chủng vi khuẩn mà Tiến sĩ Minoru Shirota, người sáng lập Yakult, chọn lọc từ nhiều nguồn thực phẩm Các chủng đặt tên Shirota vào năm 1966 thường tham khảo tài liệu khoa học chủng L.casei YIT 9018 Năm 1930, vi khuẩn phân lập bị nhiễm thể thực khuẩn DNA, ảnh hưởng kiểu hình lây nhiễm không sản xuất acid lactic trình lên men Để ổn định trình sản xuất, thực khuẩn loại bỏ dẫn xuaatscuar chủng gốc chọn vào năm 1980, định YIT 9029, kết lắng lên men chọn lọc International Depositary Authority, Cơ quan khoa học Công nghệ Nhật Bản, số đăng ký FERM BP-1366 Chủng YIT 9029, định chủng L.Casei Shirota sử dụng để sản xuất sản phẩm sữa lên men, bao gồm thức uống bán toàn giới tên Yakult 2.2 Phân loại khoa học: Nissen et al (2009) Các tác giả nghiên cứu độ bám dính chủng L casei Shirota 12 chủng lactobacilli khác chủng Enterococcus faecium L casei Shirota Nghiên cứu in vitro sử thể chính xác độ bám dụng tế bào biểu mơ dính trung bình với tế ruột lợn bào biểu mô ruột lợn, với số chủng so sánh cho thấy độ bám dính cao cho thấy độ bám dính yếu 4.2 Khả làm giảm chất nhầy Tác giả Cơng trình nghiên cứu O'Brien et al (1999) lưu ý tất "vi khuẩn axit lactic probiotic đánh giá khơng có khả làm suy giảm niêm mạc dày." Bemardeau et al (2006) báo cáo chủng L paracasei thử nghiệm cho suy giảm chất nhầy, L paracasei Immunitas (giống L casei chủng Shirota coi L casei trước phân loại phân loại gần đây) làm Kết nghiên cứu 4.3 Kháng kháng sinh Tác giả Cơng trình nghiên cứu Kết nghiên cứu Ammor et al (2007) quan sát thấy "lactobacilli thường nhạy cảm với penicillin chất ức chế β-lactamase, có khả chống oxacillin cephalosporin hơn, khả chống thấm tế bào dường chế kháng chính Borriello et al (2003) Nhiều chủng lactobacilli bao gồm chủng L casei Shirota — có tính kháng với vancomycin Mare et al (2007) chủng L casei Shirota khơng có tính kháng cao ECOFF dự kiến thiết lập cho L paracasei → Trong Bảng 5, tính nhạy cảm so sánh với 42 chủng khác L casei Sự so sánh cho thấy rõ ràng chủng L casei Shirota cho thấy khơng có đề kháng hoàn toàn với loại kháng sinh khác ngồi vancomycin CHƯƠNG V: QUY TRÌNH SẢN XUẤT LACTOBACILLUS CASEI SHIROTA 5.1 Phương pháp bảo quản giống chuẩn bị giống gốc Giống gốc sản xuất chính bảo quản khoảng hai năm lần Khi giống gốc bảo quản, cấy vào môi trường nuôi cấy lỏng ủ 37 ° C nuôi cấy đạt đến giai đoạn tĩnh Môi trường nuôi cấy chuyển đến môi trường thạch ủ lại 37 o C nuôi cấy đạt đến pha tĩnh, làm lạnh bảo quản -20 ° C Điều cung cấp nguồn cung cấp dự trữ khoảng năm Môi trường nuôi cấy chất lỏng chứa đủ nitơ, cacbon, muối chất dinh dưỡng khác cho phát triển chủng L casei Shirota Môi trường Agar chứa thành phần tương tự với thạch, nước dùng sữa chứa sữa bột nước cấp thực phẩm Bột đông khô LcS, ống (giống gốc, bảo quản sau năm)→ Nuôi cấy môi trường nuôi cấy chất lỏng→ cấy môi trường agar bảo quản -20 aC (Có hiệu lực năm) → Cấy môi trường nuôi cấy →cấy vào nước dùng sữa, lần →Sử dụng cho sản xuất 5.2 Quy trình sản xuất 5.2.1 Sơ đồ quy trình sản xuất Chuẩn bị môi trường sữa bột gầy, đường glucose, đường cát trắng Khuẩn L.casei Shirota hoạt hóa Lên men Tiệt trùng nhiệt độ 121oC, làm nguội đến 420C Ủ men ngày nhiệt độ 370C, pH=6.5 Đồng hóa Nước đường tiệt trùng sữa bán thành phẩm Phối trộn Nước cất vô trùng Sữa thành phẩm Rót vào chai, dán bao bì sản phẩm đóng gói 5.2.2 Thuyết minh quy trình Chuẩn bị mơi trường: sữa bột gầy, đường glucose đường cát trắng hịa Sản Phẩm tan nước nóng   Tiệt trùng: Môi trường sữa bột, đường glucose đường cát trắng tiệt trùng 121oC 15 phút nhằm tiêu diệt toàn vi sinh vật gây bệnh, tạo mơi trường tốt cho q trình ủ men  Làm nguội: Hịa tan hỗn hợp mơi trường vừa tiệt trùng nước nóng làm nguội đến 42oC trước cấy men vào để đảm bảo nhiệt độ sống phát triển tốt cho vi sinh vật Lên men: Dung dịch sữa sau tiệt trùng làm nguội cấy men  Yakult vào bồn lên men (Khuẩn L.casei Shirota hoạt hóa ni cấy phòng thí nghiệm cấy vào bồn lên men, ủ lên men tạo men Yakult) Quá trình lên men thực với nhiệt độ pH tự động (Nhiệt độ tối ưu vào khoảng 37 oC, pH tối ưu 6.5) diễn ngày Sau thời gian lên men, bồn lên men có chứa hàng tỉ khuẩn sống lúc sữa bồn đặc sệt Cần lưu ý trình cấy giống Yakult vào bồn lên men cần để cánh khuấy bồn lên men hoạt động nhằm phân bố tế bào vi khuẩn Sau tắt cánh khuấy để q trình lên men diễn Đồng hóa: trình xử lí học, tác động lên cấu trúc vật lí sữa nhằm:   - Phân tán đồng chất sản phẩm - Làm bền ổn định hạt nhũ tương, huyền phù, tăng độ đồng cho sản phẩm - Màu sắc đặc trưng hơn, kích thích cảm quan sử dụng Bổ sung nước đường: khuấy hỗn hợp đồng hóa với nước đường để trung hịa độ chua tạo độ cho sản phẩm Đường nguồn dinh dưỡng cung cấp cho khuẩn lạc L.casei Shirota sống thời gian hạn sử dụng  Phối trộn: pha lỗng hỗn hợp với nước vơ trùng để pha lỗng, giảm độ đặc sữa, tạo thành sữa chua uống bán thành phẩm Đồng thời phân bố vi sinh vật đảm bảo trung bình vào chai sản phẩm có khoảng 6.5 tỉ lợi khuẩn  Chai Yakult: làm nhựa polystyrene sản xuất nhà máy máy tạo chai Các hạt nhựa polystyrene đun nóng tạo khn dạng chai Yakult Sau chuyển qua máy in dán hạn sử dụng thơng tin sản phẩm trước rót sữa thành phẩm vào  Đóng gói: sữa thành phẩm rót vào chai chế tạo nhà máy Yakull Sau đóng nắp nhơm mỏng Sản phẩm đóng gói chai thành lốc nhựa polyprolylene Đóng gói tiếp tục 10 lốc thành thùng nhựa polyprolylene  Bảo quản lạnh: sản phẩm sau đóng gói vận chuyển đến kho lạnh, bảo quản nhiệt độ