QUY TRÌNH THU NHẬN CAO CHIẾT PHÂN đoạn CHỨA POLYPHENOL từ THỰC vật

Polyphenol là các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên và tồn tại trong thực vật được chứng minh là có khả năng chống oxy hóa vô cùng hiệu quả. Polyphenol có thể bảo vệ cơ thể, giúp cơ thể chống lại nhiều loại bệnh khác nhau do gốc tự do gây ra.

SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh QUY TRÌNH VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐỂ THU NHẬN CAO CHIẾT PHÂN ĐOẠN CHỨA POLYPHENOL TỪ THỰC VẬT Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh MỤC LỤC CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN HỢP CHẤT POLYPHENOL CHƯƠNG 3: ỨNG DỤNG CAO POLYPHENOL TRIẾT XUẤT TỪ LÁ SAKÊ TRONG TRÀ TÚI LỌC 17 SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN HỢP CHẤT POLYPHENOL 1.1 Hợp chất Polyphenol Polyphenol hợp chất có nguồn gốc tự nhiên tồn thực vật chứng minh có khả chống oxy hóa vơ hiệu Polyphenol bảo vệ thể, giúp thể chống lại nhiều loại bệnh khác gốc tự gây Đặc điểm chung chúng phân tử có vịng thơm (vịng benzen) chứa hay hai, ba nhiều nhóm hydroxyl (OH) gắn trực tiếp vào vòng benzen Tùy thuộc vào số lượng vị trí tương hỗ nhóm OH với khung hóa học mà tính chất lý hố học hoạt tính sinh học thay đổi Dựa vào đặc trưng cấu tạo hóa học người ta chia hợp chất polyphenol thành ba nhóm chính: Nhóm hợp chất phenol C6 – C1: Acid Galic Nhóm hợp chất phenol C6 – C3: Acid Cafeic Nhóm hợp chất phenol C6 – C3 – C6 : Catechin, Flavonoid Hình 1: Hợp chất polyphenol Tính chất: Các polyphenol có chứa gốc Pyrocatechic Pyrogalic nên chúng tham gia phản ứng oxy hóa – khử, phản ứng cộng ngưng tụ Phản ứng oxy hóa – khử: Dưới tác dụng enzyme polyphenol oxydase, polyphenol bị oxy hóa tạo thành Quinon SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh Phản ứng cộng: Khi có mặt acid amin Quinon tiến hành phản ứng cộng với acid amin để tạo thành octoquinon tương ứng Phản ứng ngưng tụ: Các octoquinon dễ dàng ngưng tụ với để tạo thành sản phẩm có màu gọi chung Flobafen 1.2 Chức polyphenol Polyphenol ý đến khả chống oxy hóa chúng Chúng có khả chuyển electron chuỗi hơ hấp bình thường định cư ti thể Chúng có khả chúng có khả tạo phức bền với kim loại nặng, làm hoạt tính xúc tác chúng, đồng thời chúng có khả nhận gốc tự tức có khả dập tắt q trình tạo gốc tự Ngồi polyphenol cịn có khả ức chế phát triển vi nấm Nhiều polyphenol có hoạt tính vitamin P, nghĩa có khả làm tăng độ đàn hồi chuẩn hóa tính thẩm thấu vi ti huyết quản Hiện nhiều tài liệu nghiên cứu polyphenol có khả chống ức chế tế bào ung thư hấp thụ tia UV SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh CHƯƠNG 2: QUY TRÌNH VÀ PHƯƠNG PHÁP THU CAO POLYPHENOL TỪ LÁ SAKÊ 2.1 Các yếu tố khảo sát quy trình trích ly thu nhận polyphenol từ thực vật Nghiên cứu tiến hành sở xác định điều kiện tối ưu biến phụ thuộc ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly Polyphenol Các yếu tố khảo sát bao gồm: Nồng độ dung môi (H2O, Cồn 50o, 60o, 70o, 80o, 96o), tỷ lệ dung môi trích ly (1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30), nhiệt độ trích ly (30, 40, 50, 60, 70 ,80 oC), thời gian trích ly (30, 60, 90, 120, 150, 180 phút), điều kiện môi trường (pH) (5.5, 5, 4.5, 4, 3.5, 3), hiệu suất trích ly ( 1, 2, 3, lần) 2.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến quy trình trích ly thu nhận polyphenol từ thực vật a) Khảo sát q trình trích ly Trích ly nhằm mục đích tách polyphenol khỏi thực vật cách sử dụng dung mơi để hồ tan dựa sở chênh lệch nồng độ Phương pháp khảo sát: khảo sát yếu tố (nhiệt độ, thời gian… ) yếu tố cịn lại cố định Yếu tố khảo sát xong cố định giá trị tối ưu để tiếp tục khảo sát đến yếu tố khác Trong q trình trích ly cần khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến quy trình sau: Tiến hành khảo sát ảnh hưởng dung mơi trích ly: • • Khối lượng mẫu cho thí nghiệm 10g Chuẩn bị mẫu thí nghiệm theo nồng độ dung mơi trích ly sau: H 2O, cồn 500, 600, 700, 800, 960 Trích ly H2O Cồn 50o Cồn 60o Cồn 70 o Đo OD Chọn dung môi tối ưu Cồn 80 o Cồn 96o SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh Tiến hành khảo sát tỷ lệ dung mơi trích ly: Chuẩn bị mẫu thí nghiệm theo tỷ lệ khối lượng nguyên liệu: dung môi sau: 1:5; 1:10; 1:15; 1:20; 1:25; 1:30 Trích ly 1:5 1:10 1:15 1:20 1:25 1:30 Đo OD Chọn tỷ lệ dung môi phù hợp Tiến hành khảo sát nhiệt độ trích ly: Chuẩn bị mẫu thí nghiệm theo nhiệt độ sau: 30, 40, 50, 60, 70, 80 (0C) Trích ly o 30 C o 50 C o 40 C o 60 C o 70 C 80 oC Đo OD Chọn nhiệt độ tối ưu Tiến hành khảo sát thời gian trích ly: Chuẩn bị mẫu thí nghiệm theo thời gian sau: 30, 60, 90, 120, 150, 180 (phút) Trích ly 30 60 90 120 150 180 Đo OD Ño OD Chọn thời gian tối ưu Tiến hành khảo sát điều kiện mơi trường (pH) trích ly: Chuẩn bị mẫu thí nghiệm theo pH sau: 5.5, 5, 4.5, 4, 3.5, SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh Trích ly 5.5 4.5 3.5 Đo OD Chọn pH tối ưu Tiến hành xác định hiệu suất trích ly • Tiến hành trích ly mẫu điều kiện tối ưu khảo sát Sau trích ly lần xong tiến hành lọc thu lấy dịch lọc Phần bã tiếp tục sử dụng để trích ly lại • (lần 2, 3, 4) điều kiện tương tự trích ly lần Việc trích ly lặp lại lần mẫu Đo OD dung dịch sau lần trích ly Từ so sánh với hàm lượng ban đầu để tính hiệu suất trích ly Trích ly Lần Lần Lần Lần Đo OD Chọn số lần trích ly b) Khảo sát trình xử lý acid Xử lý acid nhằm mục đích thuỷ phân loại bỏ thành phần protein hợp chất cao phân tử có dịch trích ly dựa vào việc giảm pH dùng tác nhân thủy phân acid HCl Tiến hành khảo sát tỷ lệ cao chiết 1/dung mơi • • Khối lượng cao chiết sử dụng để khảo sát cho thí nghiệm 5g Chuẩn bị mẫu thí nghiệm có tỷ lệ cao chiết 1/ dung môi sau: 1/5; 1/10; 1/15; 1/20 SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh Xử lý acid 1:5 1:10 1:15 1:20 Đo OD Chọn tỷ lệ dung môi phù hợp Tiến hành khảo sát nhiệt độ xử lý acid: Chuẩn bị mẫu thí nghiệm theo nhiệt độ sau: 30, 40, 50, 60, 70, 80 (0C) Xử lý acid 30 oC 50 oC 40 o0C 60 oC 70 oôC 80 oC Đo OD Chọn nhiệt độ tối ưu Tiến hành khảo sát thời gian xử lý acid: Chuẩn bị mẫu thí nghiệm theo thời gian sau: 15, 30, 45, 60, 75 (phút) Xử lý acid 15 30 45 60 75 Đo OD Chọn thời gian tối ưu Tiến hành khảo sát thời gian lắng tủa: Chuẩn bị mẫu thí nghiệm theo thời gian sau: 12, 24, 36, 48 (giờ) SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh Lắng tủa 12 24 36 48 Đánh giá cảm quan (màu sắc, độ trong) Đo OD Chọn thời gian tối ưu c) Khảo sát trình tinh Tinh dung dịch sau lắng tủa nhằm mục đích thu nhận polyphenol tinh khiết, cho dung dịch ethyl acetate vào dung dịch sau xử lý acid hỗn hợp chia thành pha, polyphenol hồ tan vào lớp ethyl acetate Sau kết thúc, cô đặc để đuổi ethyl acetate thu lại sản phẩm cuối cao chiết polyphenol Tiến hành khảo sát tỷ lệ dịch sau xử lý acid/ ethyl acetate: • Sau trình xử lý acid, dung dịch lọc sử dụng 100ml cho lần khảo • sát Chuẩn bị mẫu thí nghiệm có tỷ lệ dịch polyphenol/ ethyl acetate sau: 1/1, 2/1, 3/1, 4/1, 5/1 Tinh 1:1 2:1 3:1 4:1 5:1 Đo OD Chọn tỷ lệ dung môi phù hợp Tiến hành khảo sát thời gian tinh sạch: Chuẩn bị mẫu thí nghiệm khảo sát theo thời gian sau: 30, 45, 60, 75, 90 (phút) SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh Tinh 30 45 60 75 90 Đo OD Chọn thời gian tối ưu Tiến hành xác định hiệu suất tinh sạch: • Tiến hành tinh dịch cao chiết điều kiện tối ưu khảo sát Tinh lần xong tiến hành gạn lọc thu lấy dịch (pha ethyl acetate) Phần dịch cao chiết (pha nước) lại tiếp tục cho ethyl actetate vào để tinh lại (lần 2, 3, • 4, 5) điều kiện tương tự tinh lần Việc tinh lặp lại lần dung dịch cao chiết Đo OD dung dịch ethyl acetate sau lần tinh Từ so sánh với hàm lượng ban đầu để tính hiệu suất tinh 2.3 Xác định hợp chất polyphenol sakê 2.3.1 Tác dụng dược lý sakê Theo cơng trình nghiên cứu giới người ta phát ngồi thành phần khống chất, vitamin số chất vi lượng chúng có hàm lượng cao hợp chất polyphenol Trong sakê có chứa: • hợp chất loại geranyl dihydrochalcone (2, 4, 5, 8, 9) SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh • Hình 2: Các hợp chất geranyl dihydrochalcone loại geranyl flavonoids (1, 3, 6, 7) Hình 3: Các hợp chất geranyl flavonoids Lá sakê từ lâu cư dân vùng tân Guinea số quốc gia Ai Cập, Malaysia, Indonesia sử dụng loại thảo dược dùng để trị bệnh phối hợp với loại thuốc khác để chữa bệnh da, tiêu chảy, bệnh gút, viêm da, ho, viêm gan, giải độc gan… Tuy nhiên nghiên cứu hoạt chất polyphenol sakê có tác dụng trị nhiều loại bệnh khác bệnh đường tim mạch, đái tháo đường, bệnh parkison, bệnh béo phì, bệnh sỏi thận đặc biệt theo tài liệu hoạt chất polyphenol sakê có tác dụng ức chế ngăn ngừa tế bào ung thư SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh người loại SPC-A-1, SW 480,SMMC-7721 (Phytochemistry Số 68-2007); Quercetin, Campherol) Tác dụng ngăn chặn chữa bệnh ung thư polyphenol nghiên cứu mạnh mẽ năm gần Nhiều cơng trình nghiên cứu cho thấy polyphenol có khả tương tác ngăn chặn hạn chế trình khơi mào, hình thành phát triển tế bào ung thư Trong giai đoạn khơi mào polyphenol trung hòa tác nhân kích hoạt cytorchom P450 enzyme, tác nhân có khả tương tác làm thay đổi cấu trúc AND, ngăn chặn tạo thành Nitrosamine nhóm hợp chất phát sinh từ khói thuốc lá, amin dị vịng thịt, cá nấu chín – tác nhân cho gây ung thư Trong giai đoạn bắt đầu tế bào ung thư, polyphenol có khả ức chế AP-1 dẫn xuất truyền khơi mào cho phát triển tế bào ung thư da, thể khả ngăn chặn protein kinase, enzyme kích hoạt tế bào giai đoạn phát triển tế bào ung thư, ức chế hoạt động Telomerase, làm giảm thời gian sống tế bào ung thư Khi trình ung thư diễn ra, polyphenol can thiệp, ức chế hoạt động urokinase, enzyme đóng vai trị quan trọng q trình phát triển biến đổi tế bào ung thư, phá hủy dạng biến đổi đặc thù tế bào gây sdevirus, hay ngăn chặn trình tổng hợp AND tế bào ung thư hepatoma, leukemia, ung thư phổi Ngồi cịn có số cơng bố chưa thức cho polyphenol có khả ngăn chặn số loại ung thư như: ung thư vú, ung thư vịm họng, ung thư đường tiêu hóa, giảm khối u… 2.3.2 • Tác dụng chống oxy hóa polyphenol sakê Q trình oxy hóa ngun nhân gây bệnh cân oxy hóa Theo tài liệu nghiên cứu công bố, bệnh như: ung thư, tim mạch, lão hóa… có liên quan gần với quy luật trình oxy hóa tế bào sống Các q trình oxy hóa diễn tác dụng gốc tự tế bào cần thiết để tạo lượng trình sinh tổng hợp thể Gốc tự hợp chất hoạt động mạnh, tạo thể trình trao đổi chất hay đưa vào từ bên virút, vi khuẩn… Các gốc tự tạo thành gồm gốc có hoạt tính cao Hydroxyl (OH), Ion sắt( Fe2+O) Cu(OH)2 gốc tự có hoạt tính trung bình yếu Peroxyl (ROO), Hydrogen Peroxde H2O2, Singlet Oxy (O1), Nitric oxide (NO), Ankoxyl ( RO)… Gốc tự nguyên tử khơng trọn vẹn, số điện tử vịng ngồi số lẻ nên khơng bền vững, phải kết hợp với nguyên tử khác để có số điện tử chẵn để bền vững Sự bền vững chốc lát, lại tạo ngun tử không trọn vẹn khác tiếp tục kết hợp với nguyên tử khác trở thành nguyên tử không trọn vẹn tiếp tục 10 SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh chu kỳ bất tận Phản ứng hóa học mãnh liệt kéo theo điện tử phân tử khác nó, cho phân tử khác bị hư hại hay bị oxy hóa Một phân tử bị oxy hóa phân tử tự tất chức vốn có nó, tiếp lại tác nhân oxi hóa phân tử chung quanh nó, làm hư hại tế bào phân tử xung quanh Và trình tiếp tục tạo thành tế bào khơng bình thường dẫn tới loại bệnh như: xơ vữa động mạch, ung thư… Thông thường gốc tự tế bào sinh trình sinh dưỡng kiểm sốt chặt chẽ thơng qua q trình kháng oxy hóa nội hợp chất glutathione, vitamin E, vitamin C enzym superoxide dismutase Ngồi thể cịn có tế bào neutrophil, monocyte, B-cell… có khả chống lại yếu tố oxy hóa ngoại lai xâm nhập Tuy nhiên, tế bào xuất hiện tượng gốc tự tạo nhiều cân hoạt động yếu tố bên chất độc, nhiễm vi sinh vật, ozone, xạ, tia UV, nhiễm phóng xạ, thuốc lá, môi trường ô nhiễm… Các gốc tự dư thừa thể thiếu yếu tố bảo vệ để ngăn chặn, có khả tương tác, phá hủy màng lipid khơng bão hịa tế bào, làm giảm khả bảo vệ tế bào dẫn đến xâm nhập tác nhân gây bệnh từ bên ngồi oxy hố nucleotid làm thay đổi cấu trúc AND, dẫn đến trình đột biến, phát sinh khối u, ung thư, làm hỏng cấu trúc protein hoạt hóa enzym q trình trao đổi chất gây bệnh… • Tính kháng oxy hóa nhóm hợp chất polyphenol sakê Trong thể người có sẵn vài enzyme dùng để bảo vệ ngăn ngừa nhiều loại gốc tự làm nguy hại tế bào như: superoxide dismutase phân hóa nhiều tế bào hồng cầu gan Tuy nhiên với số lượng gốc tự nhiều nên thể phải nhờ đến chất chống oxy hóa từ bên ngồi vitamin E, vitamin C… Tuy nhiên người ta đặc biệt tâm tới khả chống oxy hóa hợp chất polyphenol có loại thực phẩm như: dâu tằm, trà xanh, sakê… Cơng thức hóa học geranyl dihydrochalcone (2, 4, 5, 8, 9), geranyl flavonoids (1, 3, 6, 7) có mặt hydrogen phenolic thể khả kháng oxy hóa mạnh Q trình kháng oxy hóa chúng thể cách tác động trực tiếp lên gốc tự sinh thể, chúng tương tác với gốc tự đưa chúng trạng thái chất bền qua làm cho q trình oxy hóa bị loại bỏ thông qua dạng phản ứng sau: RO2* + AH ROOH + A* (1) RO* ROH (2) + AH + A* RO2* + A* ROOA* (3) RO* ROA (4) + A* 11 SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh Các chất A* tạo phản ứng (1) (2) khác với gốc RO 2* , RO* chúng khơng có khả lấy ion H + từ acid béo không no hay hợp chất thể nên không tạo gốc tự để tiếp tục khởi động q trình oxy hóa Các sản phẩm tạo phản ứng (3)(4) sản phẩm bền kết chuỗi phản ứng gốc tự kết thúc sớm 2.3.3 Quy trình trích xuất polyphenol từ sakê Sơ đồ quy trình: Nguyên liệu ä Diệt men Xay nhỏ Trích ly Lọc Bã Thu hồi Ethanol Cơ đặc ë Cao chiết 1 Xử lý acid Lắng, làm Lọc Cặn ë Pha nước Tinh chế Ethyl acetate Cô đặc Thu hồi ethyl acetat Cao Polyphenol Hình 4: Sơ đồ quy trình trích ly thu nhận cao polyphenol 12 SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh Thuyết minh quy trình: • Lựa chọn ngun liệu: Lá sakê dùng làm thí nghiệm sakê chuyển màu vàng Lá lựa chọn kỹ để loại bỏ hư, sâu, già khô, chọn không bị dập nát, lấy tốt nguyên vẹn Sau đem cân lấy 10g/ mẫu Cân theo số lượng • mẫu cần trích sau tiến hành diệt men Diệt men: o Mục đích: Xử lý để làm hoạt tính enzyme polyphenol oxydase, ngăn chặn hoạt động hệ enzyme làm polyphenol bị oxy hóa o Cách thực hiện: Lá sakê diệt men nước nóng 100 0C, thời • gian – giây Vớt để ráo, sau chuyển sang giai đoạn xay Xay nhỏ: o Mục đích: Lá sakê sau diệt men xay nhỏ để thuận tiện cho việc tiếp xúc nguyên liệu với dung môi, làm tăng khả khuyếch tán thẩm thấu chất vào dung môi, làm tăng khả trích ly o Cách thực hiện: Dùng máy xay thơng thường để thực q trình xay nhỏ, sau đem chia khối lượng cho mẫu trích ly Sau diệt men hấp thụ lượng nước nên khối lượng tăng – 10% • Trích ly: Dung mơi dùng để trích ly cồn nước o Mục đích: Trích ly polyphenol sakê nhờ dung môi cồn nước Cồn nước loại dung môi phân cực nên sử dụng để trích ly chất phân cực có sakê, cụ thể polyphenol o Thực thí nghiệm nhiều lần với dung mơi nước, cồn thay đổi nồng độ khác So sánh lượng polyphenol có dịch trích từ chọn loại dung mơi, nồng độ dung mơi thích hợp Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình trích ly, dựa theo tài liệu cơng bố yếu tố ảnh hưởng đến q trình trích ly gồm có: Loại dung mơi, tỉ lệ ngun liệu/ dung mơi, nhiệt độ trích ly, thời gian trích ly, pH • Lọc: Để thu hồi dịch chiết cần phải qua khâu lọc thô để loại cặn lẫn dịch chiết, thu dịch để chuẩn bị trình tinh chế 13 SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh • Cơ đặc: Nhằm thu hồi dung môi ethanol để tái sử dụng Dịch sau cô đặc chuyển sang dung môi khác để loại bỏ tạp chất khác không mong muốn thực q trình Cơ đun cách thủy nhiệt độ 70 – 80 0C, sau tiến hành q trình xử lý acid Xử lý acid HCl o Mục đích: Tạo mơi trường acid thích hợp cho tồn polyphenol • polyphenol bền môi trường acid Đồng thời dùng acid để phá hủy cấu trúc liên kết nhóm phức đường, protein… với polyphenol để giải phóng polyphenol tự o Hướng nghiên cứu xử lý acid, dựa theo tài liệu công bố yếu tố ảnh hưởng q trình xử lý acid gồm có: pH, tỷ lệ dịch cao chiết/ dung môi, nhiệt độ, thời gian… Quá trình tiến hành nhiều mẫu thí nghiệm lặp lại nhiều • lần Lắng làm trong: Dịch trích sau xử lý acid thường có kết tủa vón, nhựa, có protein… Do cần lắng để làm dịch o Cách thực hiện: Dịch sau xử lý acid xong, tiến hành khảo sát thời gian tối ưu • q trình kết lắng để chuẩn bị bước vào trình tinh chế polyphenol Lọc: Nhầm loại kết tủa sáp, nhựa, protein… để làm dịch Sau lắng thời gian, số thành phần bị kết tủa Do cần phải lọc để thu lấy dịch Dịch chứa thành phần tan nước polyphenol, đường, cafein…Quá trình lọc thường lặp lại lần thu dịch • Chiết polyphenol: o Mục đích: Để loại bỏ dần tạp chất, thành phần không mong muốn đường, protein… nhằm làm tăng độ tinh chế phẩm polyphenol o Dùng dung môi ethyl acetate để lơi kéo polyphenol có dung dịch Sau để yên, hỗn hợp phân tách thành lớp, lớp bên dịch ethyl acetate, bên nước Polyphenol nằm ethyl acetate Đem cô đặc để thu hồi dung môi, thu cao dạng paste chứa chủ yếu polyphenol o Các yếu tố ảnh hưởng đến trình gồm: Tỷ lệ dung dịch polyphenol/dung môi, thời gian… o Pha Etyl acetate xử lý nhiệt để thu hồi ethyl acetate cao chứa polyphenol 2.3.4 Định tính, định lượng polyphenol từ sakê a) Phương pháp định tính • Phương pháp ống nghiệm o Phản ứng với amoniac: nhiều flavonoid thay đổi màu gặp NH3 Có thể quan sát biến đổi màu mắt thường ánh sáng tử ngoại 14 SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh o Phản ứng với dung dịch sắt (III) clorid 5%: cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm • vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5%, lắc xuất màu xanh đen Phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM): SKLM kỹ thuật tách chất tiến hành cho pha động di chuyển qua pha tĩnh, ta đặt hỗn hợp chất cần tách b) Định lượng polyphenol hợp chất: • Xác định polyphenol tổng phương pháp so màu (Phương pháp Folin – Denis) Phương pháp Folin – Denis xem phép phân tích polyphenol tổng (A.O.A.C 1990) dựa đường chuẩn acid tannic o Nguyên tắc: Thuốc thử Folin – Denis phức hợp nhiều acid phosphomolybdic phosphotungstic Khi thuốc thử gặp polyphenol chúng giải phóng acid tạo thành phức Mo-W có màu xanh Các polyphenol diện dung dịch kiềm, chất phản ứng sản phẩm tạo thành khơng chất kiềm Do môi trường kiềm nhẹ nồng độ thuốc thử cao phản ứng xảy Chuẩn bị hố chất: Dung dịch Na2CO3 bão hoà o Tiến hành: o Cân 40g Na2CO3 + 150ml nước cất, sau để hồ tan bóng tối 1giờ định mức tới 200ml nước cất Thuốc thử Folin – Denis hỗn hợp bao gồm: 10g sodium tungstate + 2g phosphomolybdic acid + 5ml phosphoric acid + 75ml nước cất đun hồn lưu 2giờ Sau làm nguội định mức đến 100ml nước cất • Cách tiến hành xác định polyphenol tổng Hút 1ml dịch cần phân tích cho vào ống nghiệm + 0.5ml thuốc thử Folin – Denis để khoảng 3phút Sau cho tiếp vào 2.5ml dung dịch Na 2CO3 bão hoà, lắc nhẹ cho để bóng tối 35phút Đem đo độ hấp thu (OD) dung dịch bước sóng 760nm Từ kết đo OD, dựa phương trình đường chuẩn acid Tannic suy nồng độ polyphenol có dịch cần phân tích 15 SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh 16 SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh CHƯƠNG 3: ỨNG DỤNG CAO POLYPHENOL TRIẾT XUẤT TỪ LÁ SAKÊ TRONG TRÀ TÚI LỌC 3.1 Sơ đồ quy trình: Ngun liệu Làm héo Vị Ủ Sấy sơ Cao Polyphenol Pha loãng Nghiền Phun Sấy Phối trộn Cam thảo Định lượng Bao gói Sản phẩm 3.2 Thuyết minh quy trình: • Ngun liệu: Sử dụng sakê tươi, sạch, không bị hư tổn, sâu bệnh… Loại sử dụng sakê vàng có hàm lượng polyphenol cao số thành phần khống chất có • lợi sức khỏe Làm héo: Chủ yếu phương pháp tự nhiên Điều kiện trình là: độ ẩm mơi trường từ 70 – 75%, nhiệt độ bình thường thời gian làm héo từ – 6giờ Quá trình làm thay đổi sinh lý sinh hóa ngun liệu, q trình có liên quan đến độ ẩm nhiệt độ môi trường Yêu cầu trình làm héo giảm 17 SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh hàm lượng nước lại 60 – 62%, trở nên mềm dai, thể tích giảm Vật chất tăng lên thủy phân chất Tuy nhiên có số chất tạo thành Ở giai đoạn tanin bị giảm đi, chất màu tạo thành, hương thơm hình thành (do polyphenol bị oxy hóa kết hợp với số thành phần khác) Protein biến đổi để tạo thành acid amin hòa tan Một số chất khác vitamin C, • diệp lục, tinh bột giảm Vò: Làm dập cấu trúc tế bào sakê để tạo điều kiện thuận lợi cho dịch tế bào tiếp xúc với oxy để thực tốt q trình oxy hóa, đồng thời giải phóng số thành phần kích hoạt enzyme polyphenol oxydase thực việc oxy hóa Ở • giai đoạn oxy hóa tăng lên nhiều so với trình làm héo Ủ: Đây giai đoạn thực trình lên men Sự lên men hình thành từ vị đến kết thúc trình (khoảng – 4giờ) Các trình xảy giai đoạn là: trình lên men, q trình tự oxy hóa, tác động vi sinh vật, nhiệt độ Qua giai đoạn này, giá trị sản phẩm như: mùi, vị, màu sắc nước pha • tăng lên nhiều Sấy: Dùng nhiệt độ1050C sấy khoảng thời gian 30 phút để đình trình lên men, tiêu diệt hệ enzyme làm giảm độ ẩm sản phẩm xuống cịn – 10% • Giai đoạn giúp cố định phẩm chất cho sản phẩm Nghiền: Làm nhỏ cấu trúc bán thành phẩm tạo điều kiện thuận lợi cho cơng • đoạn tiếp theo,việc đóng gói, trích ly sử dụng sau Pha lỗng: Cao polyphenol pha loãng vào nước với nồng độ 0.03% Mục đích việc pha lỗng làm cho polyphenol dễ thẩm thấu vào nguyên liệu, đồng thời tạo • phân bố trình phun Phun: Đây giai đoạn bổ sung polyphenol vào nguyên liệu trình xử lý, chế biến hàm lượng polyphenol nguyên liệu bị đáng kể, đồng thời nhằm mục đích làm tăng hàm lượng polyphenol sản phẩm Quá trình làm tăng nồng độ hợp chất hòa tan vào sản phẩm, nâng cao chất lượng sản • phẩm Sấy: Sau phun độ ẩm bán thành phẩm tăng lên ta sấy để đưa độ ẩm sản • • phẩm trở 9->10% Phối trộn: cho Cam thảo vào với mục đích tăng giá trị cảm quan cho sản phẩm Định lượng: Tạo cho sản phẩm có độ đồng khối lượng theo yêu cầu cầu sản phẩm quy trình cơng nghệ ( 20 g/gói) • Bao gói: Sử dụng máy bao gói trà vào túi lọc 3.3 Phương pháp phân tích a Phương pháp xử lý số liệu Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê 18 SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh Mỗi thí nghiệm tiến hành lần, kết trung bình cộng lần thí nghiệm Số liệu xử lý để vẽ đồ thị excel b Các tiêu kiểm tra • Xác định hàm lượng nước o Nguyên tắc: Dùng nhiệt độ cao để loại bỏ nước khỏi mẫu thử, hiệu số khối lượng mẫu thử trước sau sấy khô lượng nươc có mẫu thử o Dụng cụ: Chén cân có nắp mài, bình hút ẩm, cân phân tích độ xác 0.001g, tủ sấy o Cách tiến hành: Cân xác – 5g mẫu thử vào chén cân, cho tất vào tủ sấy Và sấy 60 – 800C hai giờ, sau nâng nhiệt độ lên 105 0C Sau lấy cốc để nguội bình hút ẩm cân thấy khối lượng khơng đổi q trình kết thúc o Tính kết quả: Hàm lượng nước tính sau: G2 – G1 X= (g) m Trong đó: m khối lượng mẫu thử (g) G1 khối lượng chén cân, nắp mẫu thử trước sấy (g) G2 khối lượng chén cân, nắp mẫu thử sau sấy (g) • Xác định hàm lượng tro o Nguyên tắc: Sử dụng nhiệt độ cao lọai bỏ hết chất hữu có mẫu xác định Khi sản phẩm thu lại cịn thành phần khống khơng tan o Dụng cụ: cốc nung sứ , tủ sấy, cân phân tích độ xác 0.0001g o Cách tiến hành: Cân khỏang 10 đến 20 g mẫu (với độ xác 0.001g) cốc nung chuẩn bị Sấy tủ sấy nhiệt độ 105 0C khối lượng không đổi Sau đưa vào tủ nung nhiệt độ 550-6000C khỏang thời gian Sản phẩm tro có màu trắng ngà Làm nguội bình hút ẩm, sau mang cân lại khối lượng o Tính kết Hàm lượng tro xác định sau: 19 SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh m2 – m1 X = (g) m Trong : m khối lượng mẫu cân (g) m1 khối lượng cốc nung (g) m khối lượng cốc nung tro (g) • Xác định hàm lượng chất khơ dịch trích ly: Sử dụng khúc xạ kế đo độ đường, đơn vị % 0Brix 200C o Nguyên tắc: Khi từ mơi trường khơng khí vào mơi trường chất lỏng, tia sáng bị khúc xạ Nếu chất lỏng dung dịch chất hòa tan, dựa độ lệch tia sáng ta xác định nồng độ chất khơ hịa tan dung dịch o Tiến hành: Dùng dụng cụ khúc xạ kế hiệu Atago Cần phải đem dịch lọc cho đo Dùng nước cất bình tia rửa mặt kính, dùng giấy thấm khô Dùng ống nhỏ giọt lấy vài giọt dịch nhỏ lên mặt kính khúc xạ kế đậy nắp nhựa lại Đưa khúc xạ kế hướng có ánh sáng nhìn vào ống kính ta thấy hai vùng xanh trắng Vạch ngăn cách hai vùng vào giá trị giá trị nồng độ chất khơ dịch nước Hình 5: Brix kế • Xác định pH dịch trích ly: Dùng máy đo pH để đo pH dung dịch 200C o Tiến hành: Mở máy nút On/Off Rửa điện cực nước cất, dùng giấy mềm thấm khô đầu điện cực Lắc mẫu dịch đặt điện cực vào (lưu ý điện cực phải nhúng ngập mẫu dịch) bấm nút “Read” Chờ cho hình lên dấu hiệu báo số pH khơng thay đổi ghi nhận kết 20 SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh Lấy điện cực khỏi mẫu, rửa điện cực nước cất, thấm khô giấy mềm nhúng vào dung dịch bảo quản (KCl 1%) Tắt máy nút On/Off Hình 6: Máy đo pH • Xác định polyphenol tổng có túi trà phương pháp so màu (Phương pháp Folin – Denis) dựa đường chuẩn acid Tannic TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Lê Vương Bảo – Nghiên cứu quy trình sản xuất trà dược thảo – Luận văn tốt nghiệp, Đại học Nông Lâm Tp HCM, 2008 Võ Văn Chi – Từ điển thuốc Việt Nam – Nhà xuất Y học, 1999 Nguyễn Hải Hà – Nghiên cứu trích ly polyphenol từ trà Camellia sinensis (L) – Luận văn thạc sĩ, Đại học Bách khoa Tp.HCM năm 2006 Tống Văn Hằng – Cơ sở sinh hóa kỹ thuật chế biến trà – Nhà xuất Tp HCM, 1985 21 SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh Phạm Ngọc Thiện, Lê Ngọc Liễn – Chiết xuất, xác định hàm lượng polyphenol đánh giá tác dụng chống oxy hoá mẫu bột chiết dâu tằm – Tạp chí nghiên cứu y học 38 (5), 2005 Nguyễn Minh Thông − Nghiên cứu cấu trúc, khả chống oxy hóa số polyphenol dẫn xuất fullerene (C 60) phương pháp hóa tính tốn – Luận án tiến sỹ hóa lý thuyết hóa lý, Đại học Huế, 2016 Folin, O; and Denis – A colorimetric method for determination of phenols (and phenol derivatives) in urine – Journal of biological chemistry, 1915 Peter J Hernes and John I Hedges – Geochemistry of Tanin: methods and applycations – University of Washington Hagerman, A.E - Method for determining tanin in plant extracts – Journal of chemical ecology, 1987 http://tieuchuan.mard.gov.vn/Documents/Uploads/TCVN%209745-22013.pdf 22 ... 2.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến quy trình trích ly thu nhận polyphenol từ thực vật a) Khảo sát q trình trích ly Trích ly nhằm mục đích tách polyphenol khỏi thực vật cách sử dụng dung mơi để hồ... Tinh chế Ethyl acetate Cơ đặc Thu hồi ethyl acetat Cao Polyphenol Hình 4: Sơ đồ quy trình trích ly thu nhận cao polyphenol 12 SVTH: Đỗ Thị Mai Trinh Thuyết minh quy trình: • Lựa chọn ngun liệu:... lên nhiều so với q trình làm héo Ủ: Đây giai đoạn thực trình lên men Sự lên men hình thành từ vị đến kết thúc q trình (khoảng – 4giờ) Các trình xảy giai đoạn là: trình lên men, trình tự oxy hóa,