NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN KHẢ NĂNG PHÁT SINH CALLUS TỪ BAO PHẤN CÂY MƯỚP ĐẮNG

TÀI LIỆU THAM KHẢO CHO NGHIÊN CỨU INVITRO BAO PHẤN , TỔNG QUAN, PHƯƠNG PHÁP, CÁC THẢO LUẬN, CÓ TÀI LIỆU THAM KHẢO ĐẦY ĐỦ. TÀI LIỆU THAM KHẢO CHO NGHIÊN CỨU INVITRO BAO PHẤN , TỔNG QUAN, PHƯƠNG PHÁP, CÁC THẢO LUẬN, CÓ TÀI LIỆU THAM KHẢO ĐẦY ĐỦ.

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN KHẢ NĂNG PHÁT SINH CALLUS TỪ BAO PHẤN CÂY MƯỚP ĐẮNG (MOMORDICA CHARANTIA L.) IN VITRO MỤC LỤC Mở đầu 1 Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 4.1 Ý nghĩa khoa học .3 4.2 Ý nghĩa thực tiễn CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung mướp đắng (Momordica charantia l.) .4 1.1.1 Nguồn gốc phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.3 Điều kiện sinh thái mướp đắng 1.1.4 Thành phần dinh dưỡng công dụng dược liệu mướp đắng (Momordica charantia l.) 1.2 Vai trò đơn bội chọn tạo giống trồng 1.3 Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn in vitro để tạo đơn bội 1.3.1 Giới thiệu chung 1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu nuôi cấy bao phấn 1.3.3 Nghiên cứu kĩ thuật nuôi cấy bao phấn tạo đơn bội in vitro giới nước 13 CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Vật liệu nghiên cứu .17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 18 2.2.1 Phương pháp xử lý mẫu 18 2.2.2 Phương pháp tạo callus đơn bội mướp đắng 20 3.2.3 Bố trí thí nghiệm xử lí thống kê 22 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 23 3.1 Phương pháp xử lý mẫu .23 3.2 Ảnh hưởng kiểu gen mướp đắng đến khả phát sinh callus 24 3.3 Ảnh hưởng kích thước nụ hoa mướp đắng đến khả phát sinh callus26 3.4 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST) đến sự phát sinh callus đơn bội 29 3.5 Ảnh hưởng tiền xử lý lạnh (4oC) đến khả phát sinh callus đơn bội 37 3.6 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy tối nhiệt độ 25±10C 32±10C đến khả tạo callus đơn bội 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .42 Kết luận 42 Kiến nghị 44 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO .45 PHỤ LỤC 50 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Cây mướp đắng (Momordica charantia L.) thuộc họ bầu bí (Cucurbitaceae) loại dây leo, hàng năm [28] Cây có nguồn gốc từ Ấn Độ, Nam Trung Quốc trồng rộng rãi các vùng nhiệt đới khắp giới Philippin, Malaysia, Australia, các nước Châu Phi, Tây Á Mỹ La Tinh [38], [61], [23], [22], [21] Tại Việt Nam, trồng hầu hết các tỉnh từ đồng đến trung du [7] Theo Trung tâm Rau màu giới, trước trung tâm Rau màu Châu Á (Asian Vegetable Research and Development - AVRDC) năm 2007, tổng diện tích trồng mướp đắng nước ta 12.000 ha, Philppines 12.000 ha, Thái Lan 3.000 ha, Indonesia 8.000 [8] Tại Pakistan mướp đắng sản xuất 9,92 tấn/ha, Trung Quốc 18,9 tấn/ha trung nước Châu Á 13,7 tấn/ha (FAOSTAT 2011) [44] Mướp đắng loại rau ăn giàu chất sắt, carbonhydrate, protein,vitamin C, B1, B2, PP, chất khoáng, protit, lipit, đường, chất xơ, canxi, photpho, caroten [58] Từ mướp đắng chế biến thành nhiều ăn khác bữa ăn bình dân đến bữa tiệc khách sạn sang trọng Nó ngũ vị người ưa thích (đắng-cay-chua-chát-ngọt) [5] Ngồi ra, mướp đắng cịn có tính hàn nên dân gian thường dùng để trị các bệnh mụn nhọt, giải nhiệt, sáng mắt, cảm nắng, giảm ho Trong mướp đắng có chất Alkaloid có cơng dụng lợi tiểu, giúp lưu thông máu tốt, chống viêm, hạ sốt tăng cướng sức khỏe thị lực Loại dầu có hạt mướp đắng giàu cis(c) 9, trasn(t) 11 axit linonic t13, Chanrantin, polypeptide-p, vicine…, hợp chất khơng làm giảm đường huyết mà cịn cải thiện việc dung nạp glucose giảm cholesterol, triệt tiêu các mầm bệnh gây ung thư tá tràng nhiều chứng bệnh nan y khác [2], [8], [10], [7] Mướp đắng vừa có giá trị thực phẩm vừa có giá trị dược liệu nên dần người nông dân trồng với diện tích lớn cho thu nhập cao Nhưng các giống sử dụng chủ yếu giống địa phương có khả thích nghi cao, chống chịu sâu bệnh tốt, song suất lại thấp Ngồi ra, các giống nhập từ các cơng ty nước ngồi các giống lai F1 có suất độ đồng cao, giá thành hạt giống cao nhiều giống chưa qua khảo nghiệm tính thích ứng ảnh hưởng đến hiệu sản xuất Một số giống lai nước nhập nội trồng liên tục qua nhiều năm làm suy giảm nguồn gen Vì vậy, việc tạo giống nước theo yêu cầu đặc điểm sản xuất phù hợp với điều kiện sinh thái vùng canh tác, có suất cao ngày trở nên cần thiết Bên cạnh đó, cơng tác chọn giống lai F1 địi hỏi phải có các dịng thuần, mà việc tạo các dòng phương pháp truyền thống thường tốn nhiều thời gian công sức Thông qua thụ phấn cưỡng chọn lọc liên tục 7-8 hệ nhận các dòng để đánh giá khả kết hợp giống Tuy vậy, phương pháp nhiều trường hợp không cho các dòng bố mẹ đồng hợp tử các cặp allen Vì vậy, việc áp dụng kĩ thuật ni cấy in vitro tạo giống mướp đắng từ bao phấn rút ngắn thời gian tạo dòng tuyệt đối xuống cịn hệ, từ cho phép giảm chi phí, tăng hiệu quá trình tạo giống mướp đắng có suất cao, khả thích nghi chống chịu với điều kiện Việt Nam [31], [29] Trên giới, quá trình tạo mướp đắng đơn bội in vitro nghiên cứu từ năm 2008, có đạt số thành tựu dừng lại giai đoạn tạo callus mà chưa cho phép thu thực tế CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung mướp đắng (Momordica charantia l.) 1.1.1 Nguồn gốc phân loại Cây mướp đắng có tên khoa học Momordica charantia L có tên nước ngồi Bitter melon, bitter ground (Anh), bitter apple, wild cucumber, bitter cucumber, ampalaya (Philipines), balsam pear (Mỹ), karela (Ấn Độ)… [18]; tên việt nam khổ qua, mướp đắng, lương qua, cẩm lệ chi… [18] Mướp đắng (momordica charantia L.) thuộc Giới (regnum): Plantae Ngành (divisio): Magnoliophyta Lớp (class): Magnoliopsida Bộ (ordo): Cucurbitales Họ (familia): Cucurbitaceae Chi (genus): Momordica [8] Chi mướp đắng Momordica thuộc họ Cucurbitaceae có khoảng 45 loài biết, chủ yếu tập trung Châu Phi, số lồi Mỹ, Châu Á có khoảng 5-7 loài Theo Phạm Hoàng Hộ (1991) Nguyễn Hữu Hiến (1994), chi Momordica L Việt Nam có loài là: Momordica charantia L Momordica Cochinchinensis (Louor.) Speng L Momordica subangulata Blume L Trong các tài liệu nghiên cứu qua các tiêu thu thập ác địa phương nước Viện Dược Liệu, các tác giả thống mướp đắng trồng Việt Nam thuộc loài Momordica charantia L., họ Cucurbitaceae [8] Loài mướp đằng (Momordica Caharantia L.) nhiễm sắc thể 2n=22, biết đến loại trồng hóa từ lâu Theo M.E.C Reyes, B.H Gildemach C.J Jansen, 1993 lồi tồn quần thể hoang dại trồng trọt Dạng trồng trọt trở nên khá phong phú, dạng có hoa đơn tính gốc (monoecious) hàng năm Nếu theo hình dạng bên ngồi người ta chia mướp đắng thành hai chủng loại: [16] - Momordica charantia L Var charantia L., to (đường kính > 5cm), màu xanh nhạt, gai tù, đắng - Momordica charantia L Var abbreviata Ser., nhỏ (đường kính < 5cm), màu xanh đậm, gai nhọn, vị đắng 1.1.2 Đặc điểm thực vật Cũng giống các họ bầu bí, rễ mướp đắng phát triển rộng ăn nông Ở giai đoạn nảy mầm hạt phát triển rễ cái (rễ cọc), rễ ăn sâu đất độ sâu 90 120 tới 180cm Các rễ hình sau nhiều, phát triển nhanh theo chiều ngang lang rộng đất, nhiên các nhánh không ăn sâu quá 60cm Mướp đắng thuộc loại dây leo tua cuốn, thân có cạnh, ngọn có mọc lơng tơ, có đời sống khoảng năm Lá mọc so le, dài 5-10 cm, rộng 4-8 cm, phiến lá chia làm 5-7 thuỳ, hình trứng, mép khía Mặt lá màu nhạt mặt trên, gân lá có lơng ngắn [22], [16], [3] Hoa đực hoa cái mọc riêng nách lá, có cuống dài Hoa đực có đài ống ngắn, tràng gồm năm cánh mỏng hình bầu dục, nhụy rời Hoa cái có đài tràng hoa giống hoa đực Tràng hoa màu vàng nhạt, đường kính khoảng cm [22], [16], [3] Quả hình thoi, dài 8-15 cm, gốc đầu thn nhọn, mặt vỏ có nhiều u lồi to nhỏ khơng Quả chưa chín có màu xanh vàng xanh nhạt, chín có màu vàng hồng Vì Trung Quốc, mướp đắng cịn có tên hồng dương, hồng nương Khi chín, nứt dần từ đầu, tách làm ba phần để lộ chùm áo hạt màu đỏ bên [22], [16], [3] Hạt mướp đắng có dạng dẹp, dài 13-15 mm, rộng 7-8 mm, trơng gần giống hạt bí ngơ Quanh hạt có màng đỏ bao quanh (giống màng hạt gấc) 1.1.3 Điều kiện sinh thái của mướp đắng 1.1.3.1 Nhiệt độ Mướp đắng trồng quanh năm vùng nhiệt đới, vùng cận nhiệt trồng hai vụ năm, vùng có khí hậu ơn hịa mướp đắng trồng vụ hè [27] Cũng các khác thuộc họ bầu bí, mướp đắng mẫn cảm với sương giá đặc biệt nhiệt độ thấp 0oC Vì mướp đắng trồng có nguồn gốc vùng nhiệt đới á nhiệt đới nên sinh trưởng tốt điều kiện khí hậu ấm áp, nhiệt độ thích hợp (24-27)oC (Desai Musmade, 1998) Biên độ nhiệt dao động ngày đêm (28-3)oC/(20-25)oC nhiệt độ thích hợp cho quá trình sinh trưởng, nhiệt độ ban đêm 16oC ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng (Peter McLaughlin, 1998) Ở nhiệt độ 5oC hầu hết các giống mướp đắng ngừng sinh trưởng Điều kiện nhiệt độ cao làm cho bị ngắn, dị hình, nhiệt độ 40oC làm thân bị héo Nhiệt độ thích hợp cho hạt nảy mầm (30-32)oC [24], [20], nhiệt độ cho xuất cao dao động khoảng (20-30)oC thời kì hình thành Khi nhiệt độ >30oC không đậu [27] Khung nhiệt độ tốt cho mướp đắng sinh trưởng phát triển từ 25-30oC 1.1.3.2 Ánh sáng Mướp đắng ưa ánh sáng, độ dài ngày ngắn trung Khi ánh sáng thiếu yếu sinh trưởng phát triển kém, hoa cái muộn dễ bị rụng, suất thấp, chất lượng giảm, hương vị Mướp đắng yêu cầu cường độ ánh sáng mạnh để sinh trưởng, phát triển tạo xuất cao Do mướp đắng không nên trồng với mật độ cao, thiếu ánh sáng, sinh trưởng chậm sâu bệnh phát triển Trong quá trình sinh trưởng, biện pháp kỹ thuật tỉa lá gốc, các nhánh mọc sát đất để tạo độ thông thoáng cho giàn mướp đắng cần thiết [19] 1.1.3.3 Đất dinh dưỡng Mướp đắng trồng nhiều loại đất khác (Cantwell cs 1996, Reyes cs 1994), song để sinh trưởng phát triển tốt nhất, cho suất cao trồng chân đất thịt nhẹ, giàu dinh dưỡng có tầng canh tác dày, thoát nước tốt Độ pH trung bình 6,0-6,7 (Desai Musmade 1998) thích hợp cho sinh trưởng phát triển mướp đắng Song mướp đắng có khả sinh trưởng đất kiềm có độ pH tới 8,0 [24] Mướp đắng địi hỏi lượng dinh dưỡng cân đối phân bón hữu phân vô để sinh trưởng phát triển tốt Song tùy thuộc loại đất có chế dinh dưỡng thích hợp khuyến cáo dùng cho mướp đắng Trên thực tế chưa có nhiều nghiên cứu chế độ dinh dưỡng, phân bón cho mướp đắng Tuy nhiên trồng mướp đắng chân đất giàu dinh dưỡng bón đầy đủ phân hữu hoại mục yêu cầu dinh dưỡng mướp đắngtheo khuyến cáo Robinson cà Decker-Walteer (1996) sử dụng phân bón với tỷ lệ N:P:K = 100:50:50 kg/ha [20], [19] 1.1.3.4 Độ ẩm Mướp đắng có khả chịu hạn tốt, mẫn cảm với điều kiện ngập úng (Reyes cs 1994), ruộng mướp đắng bị ngập ngày, bị thay đổi hình thái học (Liao Lin 1994) Để đảm bảo cho sinh trưởng, phát triển tốt luôn phải cung cấp đủ nước cho Mướp đắng ưa ẩm, sinh trưởng tốt điều kiện ẩm độ 70-80% Thời kì rộ phát triển yêu cầu độ ẩm cao 80-90% giai đoạn hàm lượng nước thân lá, mướp đắng lên đến 90% [20] Tuy nhiên độ ẩm khơng khí cao lại điều kiện thích hợp cho sự phát triển bệnh sương mai, đốm lá, thối vi khuẩn gây hại cho mướp đắng 1.1.4 Thành phần dinh dưỡng công dụng dược liệu của mướp đắng (Momordica charantia l.) Mướp đắng rau ăn có giá trị dinh dưỡng cao, phần ăn mướp đắng chiếm khoảng 95% Theo tài liệu viện Đại học Purdue các loại rau châu Á nhập vào Mỹ (Willsetal 1984), thành phần dinh dưỡng tính gam 100g mướp đắng sau: Phần ăn 84g, nước 93,8g; Protein 0,9g; Vitamin A 0,04mg; Vitamin B1 0,05mg; Vitamin B2 0,03mg; Niacin 0,4mg, Vitamin C 50,0mg; chất béo 0,1mg; Cacbohydrate 0,2mg; Calcium 22mg; Potassium 26,0mg; Magnesium 16,0mg; Sắt 0,9mg Hợp chất saponin vị đắng mướp đắng vị thuốc có chứa chất Charantin (như dạng insulin) Alkaloid Trong mướp đắng người ta tìm nhiều dưỡng chất có lợi ích cho thể như: Alkaloid, Charantin, Charine, Cryptoxanthin, Cucurbitins, Diosgenin, Galacturonic acids, Gentisic acid, Goyaglyosides, Goyasaponins, Gypsogenin, Lanosterol, Lauric acid, Linoleic acid, Momorcharasides, Momorcharins, Momordenol, Momordicins, Momordicinin, Momordicosides, Momordin, Oleanolic acide, Oleic acide, Oxalic acide, Peptides, Petroselinic acide, Polypeptides, Rubixathin, chất đạm, chất sợi, các sinh tố A, C, Folic acid… Hiện mướp đắng sử dụng loại rau sử dụng loại dược liệu cho việc điều trị bệnh tiểu đường làm thuốc tẩy giun Thành phần protein mướp đắng có cơng miễn dịch cao, làm cho tế bào miễn dịch có tác dụng tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh, coi thực phẩm dùng để điều trị ung thư Các nhà khoa học mỹ cho chiết xuất từ mướp đắng loại protein tiêu diệt virus gây bệnh AIDS [58] Trong y học truyền thống cổ xưa Ấn Độ, Trung Quốc, châu Phi Mỹ Latinh Dịch chiết từ mướp đắng chứa loạt các hóa chất thực vật có hoạt tính sinh học, bao gồm t.riterpenes, pisteins steroid (Grover Yadav 2004) có khả chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng virus, gải độc gan chống viêm vừa có khả làm giảm lượng đường máu (Welthinda et al 1986; Raman Lan 1996), điều trị nhiều loại loét khác nhau, tiểu đường, nhiễm trùng (Gurbuz et al 2000; Scartezzini Speroni 2000; Beloin et al 2005) Trong nước sắc có tính chất gây sẩy thai, nước sắc lá thân sử dụng điều trị bệnh lỵ, bệnh thấp khớp, bệnh gút (Subratty et al 2005) Ngoài ra, dịch chiết từ lá, hoa chí tồn thường sử dụng để điều trị các vết thương, nhiễm trùng, ký sinh trùng (ví dụ, sâu), sởi, viêm gan, sốt (Behera et al 2008) [58] 1.2 Vai trò của đơn bội chọn tạo giống trồng Hầu hết các loài trồng thường có mức bội thể lớn 1, phổ biến nhị bội (2n) tứ bội (4n) Như vậy, đặc điểm di truyền cá thể bị hai hay nhiều alen gen chi phối Nếu cá thể dị hợp tử, tức các gen hệ gen nhị bội hay tứ bội khác biểu tính trạng gen hồn tồn tùy thuộc vào tính trạng lặn hay trội chúng định Trong công tác chọn giống người ta không ý nhiều tới thể đơn bội (n), lẽ trồng dạng đơn bội thường khó tồn tự nhiên Nó sống điều kiện nhân tạo người Cây đơn bội mang NST (n), sống người ta phải tiến hành nhân đơi nhiễm sắc thể tạo các dịng đồng hợp tử tuyệt đối Những biểu đơn bội (kiểu hình) thể xác kiểu gen mà có, kể các gen lặn Đây nguồn vật liệu di truyền vô quý giá công tác chọn giống Giá trị đơn bội các nghiên cứu di truyền chọn giống phát từ lâu Karpachenco người từ năm 1929 khả triển vọng việc sử dụng đơn bội vào mục đích chọn giống, lẽ quần thể nào, tổ hợp mong muốn các gen giao tử thường cao so với hợp tử Do đó, mặt lý thuyết thường xuyên nhanh nhận các dạng đồng hợp tử có tổ hợp các dấu hiệu mong muốn cách nhân đôi trực tiếp số lượng nhiễm sắc thể các thể đơn bội [4] Trong công tác chọn tạo giống loài tự thụ phấn thời gian dài người ta yêu cầu phải có tái tổ hợp gen mong muốn từ các nguồn đồng hợp tử khác Bằng phương pháp truyền thống thường phải 8-10 năm để tạo lai đồng hợp tử ổn định Ở thụ phấn chéo thường gặp nhiều khó khăn để có dịng tự phối tượng suy giảm sức sống lai sau hệ tự thụ phấn bắt buộc Những dòng tự phối đồng hợp tử lai với để tạo lai F1 ưu lai Việc nghiên cứu đơn bội làm vật liệu nguồn để lưỡng bội hóa chúng thành vật liệu đồng hợp tử trở nên hữu dụng cho nhà chọn giống Thời gian cần thiết để tạo dòng vật liệu nguồn- dòng đơn bội kép rút ngắn nhiều, khoảng 3-4 lần, tùy đối tượng [1] 1.3 Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn in vitro để tạo đơn bội 1.3.1 Giới thiệu chung Nuôi cấy bao phấn kỹ thuật nuôi cấy in vitro bao phấn có chứa các tiểu bào tử hạt phấn chưa chín mơi trường dinh dưỡng tạo đơn bội, lối thoát kỳ diệu lĩnh vực ứng dụng đơn bội vào công tác chọn giống trồng Thông qua phương pháp ta rút ngắn thời gian chọn giống, làm tăng hiệu chọn lọc, tăng tính biến dị cho chọn lọc giúp giải khó khăn lai xa Các dịng nhanh chóng tạo từ ni cấy bao phấn lai F1 F2 thời gian ngắn [51], [30] Một số ưu điểm phương pháp sau: - Kỹ thuật khá đơn giản, số lồi sự phân chia tế bào xảy dễ dàng tế bào hạt phấn chưa thực sự chín Tỷ lệ hạt phấn có phản ứng tốt với mơi trường ni cấy cao (tần suất cảm ứng mơi trường cao) sản xuất thể đơn bội với số lượng lớn thời gian ngắn giảm từ 3-4 lần [51] - Nuôi cấy bao phấn phương pháp để tạo các dịng đồng hợp tử, quá trình vài tháng so với yêu cầu nhiều hệ sử dụng phương pháp truyền thống [62], [54], [6] Cây đơn bội kép sản phẩm cuối nuôi cấy bao phấn, chúng có đặc điểm đồng hợp tử tuyệt đối coi nguồn vật liệu đa dạng phong phú cho chọn tạo giống [60], [56], [37] Thơng qua phương pháp ta rút ngắn thời gian chọn giống, làm tăng hiệu chọn lọc, tăng tính biến dị cho chọn lọc giúp giải khó khăn lai xa Các dịng nhanh KIN [40] Ở thí nghiệm tổ hợp 0.5mg/l 2,4-D 1mg/l BA 1mg/l KIN tỷ lệ bao phấn tạo callus cao đạt 31.11% số callus/bình đạt 38.67% sau tuần ni cấy với callus nhỏ gọn, kết khối, màu vàng xanh Khi tăng nồng độ KIN lên 1.5mg/l phát sinh callus tỷ lệ thấp 22.22% số callus/bình đạt 14.67% sau tuần nuôi cấy với callus nhỏ gọn, kết khối, màu vàng xanh Ở các tổ hợp 0.5mg/l 2,4-D 1mg/l BA 0.5mg/l KIN 0.5mg/l 2,4-D 1mg/l BA 2mg/l KIN khơng có tượng phát sinh callus Hình 3.6 Callus phát sinh mơi trường MS có bổ sung 2,4-D kết hợp với BA KIN (A) 0.5mg/l 2,4-D 1mg/l BA 1mg/l KIN sau tuần nuôi cấy (B) 0.5mg/l 2,4D 1mg/l BA 1.5mg/l KIN sau tuần nuôi cấy Thanh ngang tỉ lệ 0.1cm Các thí nghiệm phát sinh callus hóa nâu sau tuần ni cấy Tương tự với nghiên cứu Y Tang các cộng sự (2010) hầu hết các callus phát sinh sau 7-8 tuần bị hóa nâu [63] Hình 3.7 Callus hoa mướp đắng giống khổ qua lai F1 Diago 26 nụ hoa có kích thước 3-5mm, cấy mơi trường MS có bổ sung 3% sucrose, 0,8% agar, pH = 5,75 2mg/l 2,4-D 2mg/l KIN Điểu kiện nuôi cấy nhiệt độ 25 ± 1oC, cường độ chiếu 36 sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 12h/ngày (A) Callus sau tuần ni cấy (B) Callus bắt đầu bị hóa nâu sau tuần nuôi cấy Thanh ngang tỷ lệ 0.3cm 3.5 Ảnh hưởng của tiền xử lý lạnh (4 oC) đến khả phát sinh callus đơn bội Đối với phần lớn các loại trồng việc xử lý bao phấn trước ni cấy có ảnh hưởng lớn đến kết nuôi cấy bao phấn Theo nghiên cứu Kumar cộng sự năm 2002 hai giống dưa chuột Green Long Calypso cho thấy mẫu hoa trước nuôi cấy xử lý lạnh 4oC hai ngày có ảnh hưởng tốt nuôi cấy bao phấn dưa chuột [26] Nhưng với bí (Cucurbita pepo) xử lý lạnh 4oC ngày mức xử lý lạnh tối ưu (Metwally, 1998) [37] Như vậy, việc xử lý lạnh xử lý nhiệt bao phấn hay cho bao phấn trước nuôi cấy không tác dụng trực tiếp sự hình thành callus mà cịn tác động gián tiếp đến tỷ lệ tái sinh Sử dụng giống khổ qua lai F1 Diago 26, khử trùng mẫu Cồn 70 o 30 giây; NaOCl 5% phút; HgCl2 0.1% phút, nụ hoa có kích thước 3-5 mm, qua tiền xử lý nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 3% sucrose, 0,8% agar, pH = 5,75 2mg/l 2,4-D 2mg/l KIN để thí nghiệm Kết thể bảng 3.10 Bảng 3.10 Sự ảnh hưởng tiền xử lý lạnh (4oC) đến khả phát sinh callus Thời gian tiền xử lý lạnh 4oC (ngày) Tỷ lệ phát sinh callus (%) Số callus/bình (%) Hình thái callus Nhỏ gọn, kết khối, màu vàng Nhỏ gọn, kết khối, màu vàng Nhỏ gọn, kết khối, màu vàng Nhỏ gọn, kết khối, màu vàng Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê trung bình mẫu với p